兔椎間失穩(wěn)后彈性內(nèi)固定軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白變化的實驗研究

2015-12-28 01:27:57楊學(xué)軍宋雄英邢文華霍洪軍劉春楊

河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2015年7期

張　昭，楊學(xué)軍，宋雄英，邢文華，霍洪軍，劉春楊

(1.北京市豐臺中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨傷科，北京 100072；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸腰脊柱外科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030)

張昭1，楊學(xué)軍2*，宋雄英1，邢文華2，霍洪軍2，劉春楊1

[摘要]目的觀察兔軟骨終板在椎間失穩(wěn)環(huán)境下，經(jīng)彈性內(nèi)固定重建椎間穩(wěn)定，軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的變化，為腰腿痛疾病的治療提供新的思路和方法。方法選取36只6個月齡日本大耳白兔,雄雌不限,體質(zhì)量(2.5±0.15) kg，隨機分為對照組和實驗組各18只。先將實驗所用36只兔制作成L6/7椎間手術(shù)失穩(wěn)模型；實驗組在手術(shù)失穩(wěn)2個月后用椎弓根螺絲釘和張力鋼絲彈性內(nèi)固定的方法進行L6/7的穩(wěn)定性重建，術(shù)后2、4、6個月分別取2組兔椎間盤軟骨終板(每個時點6只)，用免疫組織化學(xué)的方法檢測Ⅱ型膠原蛋白,用JD801圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析,綜合判斷軟骨終板的退行性變過程及機制。結(jié)果實驗組手術(shù)進行椎間失穩(wěn)張力鋼絲彈性內(nèi)固定穩(wěn)定性重建后,2、4、6個月短期內(nèi)椎間軟骨終板厚度較對照組明顯變厚，軟骨細(xì)胞顯著增加。實驗組Ⅱ型膠原蛋白灰度術(shù)后2～6個月逐漸下降，實驗組Ⅱ型膠原蛋白灰度術(shù)后2～6個月均低于對照組(P<0.01)；實驗組Ⅱ型膠原蛋白光密度術(shù)后2～6個月逐漸升高，實驗組Ⅱ型膠原蛋白光密度術(shù)后2～6個月均高于對照組(P<0.01)。結(jié)論彈性內(nèi)固定能有效阻止軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的退行性變；而且有部分恢復(fù)的征象,為進一步進行其他治療創(chuàng)造了必要條件。

[關(guān)鍵詞]椎間盤退行性變；軟骨終板；膠原Ⅱ型；內(nèi)固定

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.009

椎間盤軟骨終板的退行性變受生物體內(nèi)部因素和其所處周圍外界因素影響，生物體在不同時間不同環(huán)境條件下，軟骨終板的退行性變是不同的,傳統(tǒng)的脊柱融合術(shù)一直是治療脊柱椎間盤退行性變疾病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，堅強的后路內(nèi)固定和椎間融合會影響脊柱的活動度,同時會導(dǎo)致固定節(jié)段相鄰椎間盤的退行性變加重，從而產(chǎn)生相應(yīng)臨床癥狀，脊柱內(nèi)固定術(shù)后存在潛在的并發(fā)癥[1]。關(guān)節(jié)失穩(wěn)后的穩(wěn)定性重建可阻止關(guān)節(jié)軟骨的退行性變，明顯緩解術(shù)后關(guān)節(jié)疼痛。椎間彈性內(nèi)固定可有效治療由椎間失穩(wěn)引起的腰腿痛，也可有效緩解鄰近節(jié)段椎間盤的退行性變[2]，并能適度保留椎體間的活動功能。為此，本實驗手術(shù)咬去兔L6椎體的兩側(cè)下關(guān)節(jié)突，改變腰椎內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成椎間失穩(wěn),用張力鋼絲彈性內(nèi)固定的方法重建椎間穩(wěn)定性,觀察椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的變化過程[3],現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1實驗設(shè)計取36只6個月齡日本大耳白兔(由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物中心提供),雄雌不限,平均體質(zhì)量(2.50±0.15) kg，均在同樣環(huán)境條件下喂養(yǎng)，隨機分為實驗組和對照組各18只。先將實驗所用36只兔制備L6/7椎間手術(shù)失穩(wěn)模型：刮除兔腰背部皮毛,用安定注射液1.25 mg/kg、氯胺酮0.02 g/kg、阿托品0.125 mg/kg依次一側(cè)耳緣靜脈注射麻醉后,俯臥固定于手術(shù)臺上,消毒后鋪無菌手術(shù)巾，取雙側(cè)平對髂嵴椎間隙(即L6/7)為中心,從正中切一長約4.5 cm縱行切口,切開皮膚及皮下組織,分離暴露棘突、雙側(cè)椎板及上下關(guān)節(jié)突，分離附著于棘突、椎板及小關(guān)節(jié)的肌肉等軟組織,然后咬除L6/7棘上及棘間韌帶,咬除L6椎體下位全部小關(guān)節(jié)突，造成兔椎間盤椎間失穩(wěn)，用無菌生理鹽水充分沖洗切口3次,依次縫合各層組織；碘伏消毒手術(shù)切口，術(shù)后各兔在自己單籠中自由活動。實驗組18只兔在手術(shù)失穩(wěn)2個月后用椎弓根螺絲釘和張力鋼絲彈性內(nèi)固定的方法進行L6/7的穩(wěn)定性重建(圖1，2)。將實驗組和對照組動物在術(shù)后2、4、6個月分別取材，采用免疫組織化學(xué)的方法對所取椎間盤軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白進行制片檢測,然后用JD801圖像分析系統(tǒng)進行Ⅱ型膠原蛋白圖像分析。

1.2試劑和設(shè)備APES防脫片劑(編號GLU-0048)、DAB顯色試劑盒(編號DAB-0031/1031)、SP超敏試劑盒(編號Kit-9710/9720/9730)、抗人的膠原蛋白Ⅱ單克隆抗體(編號MAB-0222)由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)；分析純乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)由江蘇捷達(dá)科技有限公司生產(chǎn)。JD801圖像分析系統(tǒng)由江蘇捷達(dá)科技有限公司生產(chǎn)；手提便攜式X射線透視儀(BJI-1X型)/ BG-9000 C形臂X線機由德國產(chǎn)；HR-7751-M型微波爐由山東青島海爾公司生產(chǎn)；醫(yī)用手術(shù)器械一套;一次性無菌手術(shù)衣、無菌手術(shù)單及無菌手套；直徑2 mm 長10 mm指骨用螺釘30×4個,直徑0.9 mm醫(yī)用鋼絲3 m。

1.3操作方法

1.3.1取材用無菌注射器將25 mL空氣沿實驗兔耳緣靜脈注射栓塞將其處死,用快骨刀快速切取完整L6/7椎間盤(保留部分軟骨終板下松質(zhì)骨)，放入中性甲醛溶液中固定,24 h后用15%EDTA溶液脫鈣。

1.3.2脫鈣將所取得的兔椎間盤軟骨終板組織放入裝有15% EDTA溶液的干凈安瓿中,安瓿用用硫酸紙標(biāo)記所放標(biāo)本性質(zhì),安瓿用瓶蓋封閉放入盛1 200 mL18 ℃左右自來水的塑料盆中,在微波爐中用中低兩檔加熱10 min,然后換1 200 mL18 ℃左右自來水繼續(xù)在微波爐中用中低兩檔加熱10 min,自來水用來控制軟骨終板組織脫鈣時的溫度始終控制在50℃以下,如此反復(fù)脫鈣每日2 h后換15% EDTA溶液,置入37 ℃溫箱中過夜,第2天再更換1次15% EDTA溶液，再按前一天方法進行微波脫鈣,如此反復(fù)15 d左右，完整椎間盤可完成脫鈣。

1.3.3制片載玻片清潔后用APES防脫片劑用丙酮50倍稀釋后常規(guī)處理,蓋玻片常規(guī)清潔處理。脫鈣后將組織用自來水沖洗2次，其間5%無水硫酸鈉飽和溶液浸泡，依次50%、70%、80%、95%(Ⅰ、Ⅱ)、100%(Ⅰ、Ⅱ)乙醇脫水，二甲苯透明，依次48～50 ℃、54～56 ℃、56～58 ℃軟蠟滲蠟，石蠟包埋、修塊、切片。

1.4Ⅱ型膠原蛋白的檢測用UltrasensitiveTMSP超敏試劑盒檢測按其說明書操作制片；JD801圖像分析系統(tǒng)檢測Ⅱ型膠原蛋白。

2結(jié)果

2.1軟骨終板的變化椎間失穩(wěn)(對照組)可導(dǎo)致椎間軟骨終板在2～6個月短期內(nèi)厚度明顯變薄，軟骨細(xì)胞顯著減少(圖3～5)；實驗組手術(shù)進行椎間失穩(wěn)張力鋼絲彈性內(nèi)固定穩(wěn)定性重建后,在2～6個月短期內(nèi)椎間軟骨終板厚度較對照組明顯變厚，軟骨細(xì)胞顯著增加(圖6～8)。

2.2Ⅱ型膠原蛋白的變化對照組Ⅱ型膠原蛋白灰度術(shù)后2～6個月逐漸升高(P<0.01)，而實驗組則逐漸下降(P<0.01)；實驗組Ⅱ型膠原蛋白灰度術(shù)后2、4、6個月均低于對照組(P<0.01)。對照組Ⅱ型膠原蛋白光密度術(shù)后2～6個月緩慢降低(P<0.01)，而實驗組Ⅱ型膠原蛋白光密度逐漸升高(P<0.01)；實驗組Ⅱ型膠原蛋白光密度在術(shù)后2～6個月均高于對照組(P<0.01)。見表1。

表12組術(shù)后Ⅱ型膠原蛋白灰度和光密度比較

Table 1Comparison in gray scale and optical density of collagen typeⅡbetween two groups

組別Ⅱ型膠原蛋白灰度2個月4個月6個月FP對照組310.28±0.91313.21±1.30*315.68±0.77*#42.2810.000實驗組290.28±0.87287.36±0.94*284.47±0.01*#40.2700.000t38.91339.47062.915P0.0000.0000.000組別Ⅱ型膠原蛋白光密度2個月4個月6個月FP對照組0.52±0.010.51±0.010.49±0.01*#14.0000.000實驗組0.56±0.010.61±0.010.64±0.01*#98.0000.000t6.92817.32125.981P0.0000.0000.000

*P<0.01與2個月比較#P<0.01與4個月比較(q檢驗)

3討論

頸肩痛、腰腿痛嚴(yán)重影響著人類的身體健康，而椎間盤的退行性變是導(dǎo)致頸肩痛、腰腿痛的主要原因。日前對椎間盤的退行性變過程及機制的認(rèn)識有限,對構(gòu)成椎間盤軟骨終板的退行性變的認(rèn)識更少,傳統(tǒng)頸肩痛、腰腿痛均采用神經(jīng)減壓椎間盤摘除椎間融合術(shù)，給患者帶來的負(fù)面影響是脊柱活動受限和鄰近節(jié)段椎間盤退行性變加重。近年來隨著分子生物學(xué)和基因技術(shù)等的臨床應(yīng)用，激發(fā)人類不斷尋求干預(yù)椎間盤退行性變的新方法[4-8]。近期使用的脊柱彈性內(nèi)固定系統(tǒng)(Bioflex、K-ROD、Dynesis、Coflex、人工椎間盤等)已取得了一定的臨床療效，但也存在一些不足；當(dāng)前已有研究使用轉(zhuǎn)基因及組織工程技術(shù)重建或修復(fù)椎間盤，利用重組DNA技術(shù)和基因克隆技術(shù)人工獲得基因物質(zhì)如骨形態(tài)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子、血小板衍生生長因子等[9-10]，這些治療因子僅在極短的一段時間內(nèi)或只在某些特定環(huán)境條件下有效,始終不能達(dá)到預(yù)期效果[11-18]。為此，本研究應(yīng)用張力鋼絲彈性內(nèi)固定重建椎間穩(wěn)定的方法來觀察椎間失穩(wěn)后軟骨終板退行性變的過程，國內(nèi)亦曾有過相關(guān)報道[19-20]。

本研究結(jié)果顯示：①正常結(jié)構(gòu)的椎間盤及其周圍組織是椎間盤正常代謝功能的基礎(chǔ)，失穩(wěn)狀態(tài)的椎間盤各種代謝均處于失代償狀態(tài)。②椎間失穩(wěn)(對照組)可導(dǎo)致椎間軟骨終板在各實驗時間點厚度明顯變薄，軟骨細(xì)胞顯著減少，Ⅱ型膠原蛋白灰度術(shù)后2～6個月逐漸升高(P<0.01)，由于灰度值與陽性物質(zhì)含量成反比，證明椎間失穩(wěn)可導(dǎo)致椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的含量是逐漸減少的；同樣對照組Ⅱ型膠原蛋白光密度術(shù)后2～6個月緩慢降低(P<0.01)，光密度與陽性物質(zhì)的含量成正比，再次證明對照組可導(dǎo)致椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的含量是逐漸減少的[21]。由此可推測椎間盤在失穩(wěn)狀態(tài)下可直接影響軟骨細(xì)胞的活性和數(shù)量，從而影響Ⅱ型膠原蛋白的含量，進而直接影響到椎間盤的新陳代謝、結(jié)構(gòu)和功能。③手術(shù)進行椎間失穩(wěn)張力鋼絲彈性內(nèi)固定穩(wěn)定性重建后,在各實驗時間點椎間軟骨終板的厚度較對照組明顯變厚，軟骨細(xì)胞顯著增加,而實驗組Ⅱ型膠原蛋白灰度在2、4、6個月則是逐漸下降的(P<0.01)，Ⅱ型膠原蛋白光密度在2、4、6個月是逐漸升高的，不同時點間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),證明實驗組可導(dǎo)致椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的含量增加；實驗組椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白灰度在2、4、6個月均低于對照組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，同樣也證明彈性內(nèi)固定能有效阻止椎間軟骨終板的退行性變，可部分恢復(fù)退行性變的軟骨終板結(jié)構(gòu)。椎間失穩(wěn)在短期內(nèi)可能由于局部力學(xué)結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致椎間盤軟骨終板機構(gòu)和功能的改變，從而導(dǎo)致軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白明顯減少。臨床工作中積極預(yù)防椎體間失穩(wěn)的出現(xiàn)可有效預(yù)防腰腿痛和頸肩痛的發(fā)生，椎間失穩(wěn)后的椎間穩(wěn)定性重建是有效的治療方法，同時也是進行其他有效治療的基礎(chǔ)。

綜上所述，椎間失穩(wěn)是導(dǎo)致椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白在短期內(nèi)退行性變的主要原因；用張力鋼絲彈性內(nèi)固定的方法行椎間失穩(wěn)后的穩(wěn)定性重建，能有效阻止椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的退行性變,并能使退行性變的軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白得到部分恢復(fù)。(本文圖見封二)

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