HPLC測定蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿含量的不確定度評定

HPLC測定蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿含量的不確定度評定

豐 杰 成強波 陳 娟 陳國輝

目的HPLC法測定蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿含量的不確定度評定方法。方法通過建立其數(shù)學(xué)模型，分析不確定度的來源，評定各不確定度因素的影響，獲得蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿含量測定的擴展不確定度和置信水平。結(jié)果HPLC法測定蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿含量的擴展不確定度為0.038 6 mg/粒，鹽酸麻黃堿含量的測定結(jié)果為（2.22±0.038 6）mg/粒。結(jié)論本方法可用于HPLC法測定蘇黃止咳膠囊的含量的不確定分析，使測定結(jié)果更加可靠。

蘇黃止咳膠囊；鹽酸麻黃堿；HPLC；不確定度評定分析

測量是為了確定被測量的量值，測量不確定度是說明被測量估計值的不可確定程度或可信程度的參數(shù)，可以通過評定得到，測量結(jié)果的可用性很大程度上取決于其不確定度的大小。因此，測量結(jié)果必須同時包含賦予被測量的值及與該值相關(guān)的測量不確定度。

蘇黃止咳膠囊主要用于咳嗽變異性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA）和感冒后咳嗽的治療。通過該藥多年生產(chǎn)、質(zhì)量及臨床實踐證明，蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿的含量對臨床療效具有重要作用。本研究依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局YBZ00172008，測定蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿的含量，參考《JJF1059.1-2012測量不確定度評定與表示》及其他不確定評定資料［1-18］，分析影響蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿含量測定結(jié)果的不確定度因素，對各個不確定因素進行評定，報告測量結(jié)果，包含賦予被測量的值及與該值相關(guān)的測量不確定度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫Agilent 1200高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機器（G-1322A），高壓四元泵（G-1311A），標(biāo)準(zhǔn)自動進樣器（G-1313A），智能化柱溫箱（G-1316A），可變波長檢測器（G-1313A）；XS205電子天平；KQ-250B超聲波清洗儀。

1.2 試劑與樣品

乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水是高純水。對照品：鹽酸麻黃堿由中國食品藥品檢定研究院提供，純度為100.0%，供含量測定。蘇黃止咳膠囊由北京海燕藥業(yè)有限公司提供。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

SHIMADZU Shim-pack VP-ODS C18柱色譜柱（4.6×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水-磷酸-三乙胺（1.5：98.3：0.1：0.1）；流速為1.5 ml/min，檢測波長為205 nm，柱溫30℃，進樣體積10 μl。理論塔板數(shù)以鹽酸麻黃堿峰計算，應(yīng)不低于6 000。

2.2 配制及測定方法

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品約10 mg，置50 ml容量瓶中，用0.l mol/L鹽酸溶液溶解稀釋、搖勻、定容至刻度。從中精密量取25 ml，置100 ml容量瓶中，用0.l mol/L鹽酸溶液稀釋、搖勻、定容至刻度，制備成每1 ml中含鹽酸麻黃堿50 μg對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱定0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入0.l mol/L鹽酸溶液25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率100 W，頻率20 kHz）30 min，取出放冷，再稱定重量，用0.l mol/L鹽酸溶液補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μl）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 測定法 按外標(biāo)法計算鹽酸麻黃堿的含量。

3 不確定度評定

測量不確定度的評定步驟可歸納為：（1）明確被測量及其測量方法；（2）建立數(shù)學(xué)模型或稱測量模型，是測量不確定度評定的依據(jù)；（3）分析找出所有影響測量不確定度的因素，評定各測量不確定度分量；（4）合成相對不確定度的評定；（5）擴展不確定度的評定；（6）形成不確定度報告。根據(jù)以上計算步驟，對本次實驗的測量不確定度進行評定。

3.1 建立數(shù)學(xué)模型（或測量模型）

蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿含量的計算公式為:

X=（C對×A樣×V樣×ω）÷（m樣×A對）

其中，x為每粒供試品中鹽酸麻黃堿的含量（mg/粒）；A樣為供試品中鹽酸麻黃堿的峰面積；V樣為供試品溶液稀釋后的體積（ml），w為每粒供試品的平均裝量（g/粒）；m樣為供試品的稱樣量（g）；A對為對照品鹽酸麻黃堿的色譜峰面積；C對為對照品鹽酸麻黃堿的濃度（mg/ml）。

C對=（m對×V2）÷（V1×V3）

公式中，m對為對照品鹽酸麻黃堿的稱樣量（mg）；V1、V2、V3分別為鹽酸麻黃堿對照品第一次定容的體積、稀釋時移取對照品溶液的體積、最后稀釋后的體積（ml）。

3.2 各個不確定度分量的評定

3.2.1 對照品溶液配制和對照品色譜峰引入的不確定度 對照品溶液配制引入的不確定度來源于對照品稱量引入的不確定度和稀釋過程引入的不確定度，而稱量引入的不確定度來源于對照品純度和對照品的稱量。

（1）對照品純度引入的相對不確定度：由中國食品藥品檢定研究院提供的鹽酸麻黃堿對照品，純度為100.0%，使用前不需干燥處理，未對外提供不確定度，因此不考慮對照品純度引入的不確定度。

（2）對照品稱量引入的相對不確定度：①天平的示值誤差引入的不確定度：實驗所用電子天平的檢定證書中，d=0.01 mg時最大允差為±0.1 mg，按矩形分布計算則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u（m1）=0.1÷3?=5.77×10-2mg

②天平稱量重復(fù)性引入的不確定度：電子天平的檢定證書中d=0.01 mg時，天平的重復(fù)性誤差為±0.05 mg，按矩形分布計算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u（m2）=0.05÷3?=2.89×10-2mg

③試驗稱量采用減重法，由相對獨立的兩次稱量組成，因此稱量所引入的相對不確定度：

u（m）=2?×﹝u2（m1）+u2（m2）﹞?=9.13×10-2mg

每次稱量對照品平行稱取兩份，鹽酸麻黃堿對照品稱樣量分別為10.26 mg、10.33 mg，其每份對照品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

urel（m對1）=u（m）÷m對1=9.13×10-2÷10.26=8.90×10-3mg

urel（m對2）=u（m）÷m對2=9.13×10-2÷10.33=8.84×10-3mg

因此，對照品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel（m對）=2?×﹝urel2（m對1）+urel2（m對2）﹞?=1.77×10-2mg

（3）對照品、供試品稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：①玻璃儀器校準(zhǔn)引入的不確定度，實驗過程使用了A級100 ml容量瓶、50 ml容量瓶及25 ml移液管。根據(jù)國家計量檢定規(guī)程JJG196-2006規(guī)定，其最大允許誤差分別為±0.10 ml、±0.05 ml、±0.10 ml。按三角分布計算，玻璃儀器校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

u（V1）a=0.1÷6?=4.08×10-2ml

u（V2）a=0.05÷6?=2.04×10-2ml

u（V3）a=0.1÷6?=4.08×10-2ml

②溫度引入的不確定度，實驗時的溫度為23℃，校準(zhǔn)溫度為20℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4ml/℃，按矩形分布計算，溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

u（V1）b=（2.1×10-4×100×3）÷3?=3.64×10-2ml

u（V1）b=（2.1×10-4×50×3）÷3?=1.82×10-2ml

u（V1）b=（2.1×10-4×25×3）÷3?=9.1×10-3ml

每次稀釋，由玻璃儀器校準(zhǔn)和溫度引入的相對不確定度分別為：

urel（V1）=﹝u2（V1）a+u2（V1）b﹞?÷100=5.47×10-4

urel（V2）=﹝u2（V2）a+u2（V2）b﹞?÷50=5.47×10-4

urel（V3）=﹝u2（V3）a+u2（V3）b﹞?÷25=1.67×10-3ml

則對照品稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel（v對）=2?×﹝urel2（v1）+urel2（v2）+urel2（v3）﹞?=2.60×10-3

則供試品稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，即：

urel（v供）=2?×﹝urel2（v3）﹞?=2.36×10-3

（4）對照品色譜峰引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

實驗中，鹽酸麻黃堿對照品配制兩份，每份平行進樣兩次測定峰面積，對照品溶液1的峰面積分別為760.11，759.74，兩者差值R1=0.37，平均峰面積為759.92；對照品溶液2的峰面積分別為759.85，759.64，兩者差值R2=0.21，平均峰面積為759.74。采用極差法計算，當(dāng)n=2時，極差系數(shù)C=1.13。則每份對照品溶液色譜峰峰面積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則對照品溶液色譜峰引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（5）對照品溶液配制的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.2 供試品溶液配制和供試品色譜峰引入的不確定度評定：（1） 供試品稱量引入的相對不確定度：①天平的示值誤差引入的不確定度：所用電子天平的檢定證書中，d=0.1 mg時最大允差為±1.0 mg，按矩形分布計算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u（m1'）=1.0÷3?=5.77×10-1ml

②天平稱量重復(fù)性引入的不確定度：所用電子天平檢定證書中，d=0.1 mg時天平的重復(fù)性誤差為±0.1 mg，按矩形分布，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u（m2'）=0.1÷3?=5.77×10-2ml

③試驗稱量采用減重法，由相對獨立的兩次稱量組成，因此稱量所引入的相對不確定度：

u（m'）=2?×﹝u2（m1'）+u2（m2'）﹞?=0.82ml

每次稱量供試品平行稱取兩份，稱樣量分別為0.301 7 g、0.302 4 g。每份供試品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

urel（m樣1）=u（m'）÷m樣1=0.82÷301.7=2.72×10-3

urel（m樣2）=u（m'）÷m樣2=0.82÷302.4=2.71×10-3

那么供試品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel（m樣）=2?×﹝urel2（m樣1）+urel2（m樣2）﹞?=5.43×10-3

（2）供試品稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel（V供）=2?×﹝urel2（v3）﹞?=2.36×10-3

（3）供試品色譜峰峰面積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：實驗中，供試品配制兩份，每份平行進樣兩次測定峰面積。供試品溶液1的色譜峰峰面積分別為875.18，877.94，兩者差值R3=2.76，平均峰面積為876.56；供試品溶液2的色譜峰峰面積分別為884.16，879.32，兩者差值R4=4.84，平均峰面積為 881.74。采用極差法計算，當(dāng)n=2時，極差系數(shù)C=1.13。則每份供試品溶液色譜峰峰面積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

那么，供試品溶液色譜峰峰面積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

urel（A供）=﹝urel2（A供1）+urel2（A供2）﹞?=3.96×10-3

（4）供試品溶液配制的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

urel（A供）=﹝urel2（m供）+urel

2（V供）+ure

l2（A供）﹞?=7.12×10-3

3.3 合成相對不確定度的評定

蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿的含量測得結(jié)果的合成相對不確定度為：

3.4 擴展不確定度的評定

蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿的含量測定結(jié)果按正態(tài)分布，取置信概率P=95%，包含因子k=2，則擴展不確定度為：

U=urel×k=1.93×10-2×2=3.86×10-2

3.5 測量不確定度報告

蘇黃止咳膠囊鹽酸麻黃堿的含量測定結(jié)果，可表示為x=（2.22±0.038 6）mg/粒。蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿的含量不確定度分量一覽表見表1，表中列出了不確定度的因素，及占總不確定度的百分比。

表1 各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表

從表1中可以發(fā)現(xiàn)，對照品的稱量是蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿含量測定不確定度的最大影響因素，其次是供試品的稱量。

4 討論

本文評定了蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿含量測定的擴展不確定度為0.038 6 mg/粒，鹽酸麻黃堿含量的測定結(jié)果為（2.22± 0.038 6）mg/粒。因此，在藥品檢驗過程中，相關(guān)測量設(shè)備必須經(jīng)過計量，且在計量有效期內(nèi)。檢定的量程范圍和精度應(yīng)當(dāng)涵蓋實際稱量的范圍和測定使用的要求。同時，要建立、健全測量設(shè)備的操作、清潔、維修、維護保養(yǎng)工作。定期對測量設(shè)備的計量特性是否符合測量過程的計量要求進行確認(rèn)，盡量減少測量設(shè)備本身引入的不確定度分量。

評定不確定度時，合成不確定度的大小取決于各不確定度分量，必須根據(jù)實際測量情況進行具體分析，可從測量儀器、測量環(huán)境、測量人員、測量方法等方面考慮，盡量做到不遺漏、不重復(fù)。蘇黃止咳膠囊中鹽酸麻黃堿含量測定的評定結(jié)果表明，對測量結(jié)果的測量不確定度起主要作用的分量來自對照品和供試品的稱量過程。測量不確定度的評定，是為了評價測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信程度，在藥品檢驗中具有重要意義。

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Analysis of Uncertainty for Determination of Ephedrine Hydrochloride in Suhuang Zhike Capsule by HPLC

FENG Jie CHENG Qiangbo CHEN Juan CHEN Guohui Beijing Haiyan Pharmaceutical Co.Ltd of Yangtze River Pharmaceutical Group，Beijng 102206，China

ObjectiveTo find out the effect factors of uncertainty by analyzing the measurement uncertainty in the determination of ephedrine hydrochloride in suhuang zhike capsule by HPLC，and provide the evidence for the measurement evaluation.MethordsA mathematic model for calculating uncertainty was established and each component of the uncertainty was assessed.ResultsThe expanded standard measurement uncertainty for the HPLC determination was 0.038 6，and the determined content was（2.22±0.038 6）.ConclusionThe established mathematical model of uncertainty measurement is reasonable and reliable. It is applicable to the uncertainty analysis of high performance liquid chromatography method in the determination of drugs.

Suhuang zhike capsule，Ephedrine hydrochloride，HPLC，Uncertainty analysis

R28

B

1674-9316（2015）28-0142-04

10.3969/j.issn.1674-9316.2015.28.108

102206 揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司

豐杰，E-mail：fengjie@yangzijiang.com

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2010ZX09401-303-2-6）