口蹄疫病毒TaqMan 實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒的比較試驗(yàn)

蔡順萍 李 幸 王瑞深

(1.深圳市光明新區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,廣東深圳 518107;2.深圳市光明新區(qū)光明動植物防疫檢疫站,廣東深圳 518107)

口蹄疫病毒TaqMan 實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒的比較試驗(yàn)

蔡順萍 李 幸 王瑞深

(1.深圳市光明新區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,廣東深圳 518107;2.深圳市光明新區(qū)光明動植物防疫檢疫站,廣東深圳 518107)

本研究通過對深圳市場上常見的3個品牌（A，B，C）的口蹄疫病毒TaqMan 實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒的外觀和物理性狀、特異性、靈敏度、重復(fù)性和穩(wěn)定性符合率進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，試劑盒A外包裝完整，標(biāo)簽牢固且采用了具有隔熱層的凍存管保存關(guān)鍵性試劑，包裝較為科學(xué)；3家試劑盒中反應(yīng)時間最長的C（61.75min）與最短的B（56.75min）相差5min；A，B，C試劑盒對口蹄疫陽性樣本檢測均呈陽性，對豬瘟等6種非口蹄疫陽性樣本檢測呈陰性；A比B試劑盒的檢出Ct值提前1～2個Ct值，比C試劑盒檢出Ct值提前1～4個Ct值；在樣本濃度相對高時（稀釋梯度≥2×10-4），3個廠家的試劑盒都較穩(wěn)定，在樣本濃度相對低時（稀釋梯度在2×10-5時），3個廠家試劑盒都有不同程度的不穩(wěn)定，A試劑盒3個平行樣均有陽性擴(kuò)增，但其中一個樣檢出熒光增量相對較低；B和C試劑盒均出現(xiàn)無擴(kuò)增樣品。結(jié)論：3家試劑盒中，A產(chǎn)品使用具有隔熱層的凍存管保存關(guān)鍵性試劑，且靈敏度較高、特異性較強(qiáng)、穩(wěn)定性較佳，適用于臨床檢測。

熒光定量PCR 口蹄疫病毒 試劑盒比對

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度傳染性人畜共患病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為15個A類傳染病之首?？谔阋卟粌H嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)，影響食品安全，而且危及人類的健康。同時由于口蹄疫發(fā)生范圍較廣，單純依靠撲殺措施不僅難以控制疫情，還需付出巨大的代價。因此，世界上許多國家（包括我國）采取撲殺和疫苗接種相結(jié)合的防疫政策，所有大型養(yǎng)殖企業(yè)，偶蹄動物均需接受口蹄疫疫苗注射。但是，經(jīng)過免疫的動物群攜帶病毒的現(xiàn)象仍時有發(fā)生，且免疫動物群中感染的微量病毒在免疫壓力的作用下，有可能進(jìn)一步發(fā)生抗原變異，產(chǎn)生新的流行毒株[1]。動物接種疫苗后，常規(guī)的檢測方法由于不能區(qū)分感染抗體和疫苗免疫抗體，無法通過抗體監(jiān)測來發(fā)現(xiàn)病毒感染的動物群，致使對群體的野毒感染狀況無法調(diào)查。此外，現(xiàn)今屠宰檢疫主要依靠官方獸醫(yī)臨床檢疫來確定動物是否感染口蹄疫病毒，當(dāng)遇到病畜感染初期或感染多種病菌而導(dǎo)致臨床病癥不明顯時，官方獸醫(yī)的臨床檢疫存在一定的困難，且存在一定的誤判。

實(shí)時熒光PCR技術(shù)，因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究和動植物疾病診斷中。因此，眾多動物疫病的國標(biāo)檢測方法中，都包含了實(shí)時熒光PCR技術(shù)。作為一種法定的診斷方法，該技術(shù)應(yīng)用于口蹄疫檢測也將成為預(yù)防動物疫病和動物部品檢疫的必然方向。目前，市場上檢測口蹄疫病毒的熒光試劑盒種類繁多，進(jìn)口試劑盒價格昂貴；而國產(chǎn)試劑盒性價比高，但質(zhì)量參差不齊。因此，為評估國產(chǎn)試劑盒的質(zhì)量，本研究對深圳市場上常見的3家口蹄疫試劑盒進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的比對，為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行臨床檢驗(yàn)提供一定的依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑盒

采購深圳市場上3家口蹄疫病毒實(shí)時熒光PCR檢測試劑盒，分別用A、B、C代碼表示。RNA提取試劑盒購自澳東生物制品有限公司。

1.2 陽性樣本

口蹄疫病毒O型抗原購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.3 疫苗

用于比對的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬細(xì)小病毒病疫苗購自武漢科前生物股份有限公司，此6種疫苗均已通過相應(yīng)RT-PCR試劑盒確定為陽性樣本。

表1 3種口蹄疫熒光PCR試劑盒的外包裝和物理性質(zhì)比較

1.4 主要儀器

由表1可看出，3家試劑盒外包裝均完整無損，但A試劑盒相對B試劑盒，有標(biāo)簽穩(wěn)固不易脫落的優(yōu)點(diǎn)；相對于B和C試劑盒，使用了具有隔熱層的凍存管保存關(guān)鍵性試劑，降低了酶等試劑因溫度影響而失效的風(fēng)險。因此，A試劑盒在包裝上優(yōu)于B和C試劑盒。

表2 3種試劑盒反應(yīng)體系和反應(yīng)總時間

3.2 反應(yīng)體系和反應(yīng)總時長

3家試劑盒中，反應(yīng)體系的總時長最短的是B試劑盒的56.75min，其次是A試劑盒的58.83min，最長是C試劑盒的61.75分鐘之間，最長與最短反應(yīng)總時長相差5min（表2），反應(yīng)體系總時長無太大的差異。

3.3 特異性

3家試劑盒經(jīng)特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，口蹄疫病毒0型樣本提取的核酸檢測結(jié)果均呈陽性，而豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬細(xì)小病毒病提取的核酸檢測結(jié)果均呈陰性，說明3種試劑盒都有較好的特異性（圖1～圖3）。

圖1 A試劑盒特異性結(jié)果

圖2 B試劑盒特異性結(jié)果

圖3 C試劑盒特異性結(jié)果

3.4 靈敏度

3.4.1 Ct值的比較

根據(jù)3.2的3個試劑盒的反應(yīng)體系對比可知，A試劑盒較B和C試劑盒多5個預(yù)循環(huán)，即檢測同一樣本時，該試劑盒檢測結(jié)果顯示的Ct值會比無預(yù)循環(huán)的試劑盒檢測結(jié)果提前5個Ct值，因此，用于比對的A試劑盒檢測結(jié)果的平均Ct值需額外加5個Ct值。

靈敏度檢測結(jié)果顯示（表3，圖4～圖6），將相同濃度樣本的3個平行樣的平均Ct值進(jìn)行比對，A比B試劑盒的檢出Ct值提前1～2個Ct值，比C試劑盒檢出Ct值提前1～4個Ct值，即A優(yōu)于B，優(yōu)于C試劑盒。

圖4 A試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 3家試劑盒不同稀釋濃度的Ct值對比

圖5 B試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 C試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4.2 穩(wěn)定性

同樣由靈敏度結(jié)果（表3，圖4、5、6）可知，在樣本濃度相對高時，（稀釋梯度≥2×10-4），3個廠家的試劑盒都較穩(wěn)定，在樣本濃度相對低時（稀釋梯度在2×10-5時），3個廠家試劑盒都有不同程度的不穩(wěn)定。其中在檢測口蹄疫RNA（2×10-5濃度梯度）樣本（3個平行樣）時A試劑盒3個平行樣均有陽性擴(kuò)增，但其中一個樣檢出熒光增量相對較低；B試劑盒有一個樣品有陽性擴(kuò)增；C的試劑盒有兩個樣品陽性擴(kuò)增。

取B和C試劑盒，按2.4.2實(shí)驗(yàn)方法對口蹄疫RNA（2X10-5濃度梯度）樣本進(jìn)行3個平行樣的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖），B試劑盒檢測的3個平行樣中有一個陽性擴(kuò)增，Ct值為38、15、34，C試劑盒檢測的3個平行樣均無擴(kuò)增（見圖7、8）。因此，A試劑盒的穩(wěn)定性比B、C試劑盒較好。

圖7 B家試劑盒檢測口蹄疫RNA（2X10-5）3個平行樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

通過對A，B，C3家口蹄疫病毒熒光PCR試劑盒的外觀，物理性質(zhì)和對相同樣本的特異性、靈敏度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對比，結(jié)果顯示：A產(chǎn)品使用具有隔熱層的凍存管保存關(guān)鍵性試劑，且具有靈敏度較好，特異性強(qiáng)，重復(fù)性較好的特性。因此，A試劑盒要優(yōu)于B和C試劑盒，更適用于臨床檢測篩選。

圖8 C試劑盒檢測口蹄疫RNA（2X10-5濃）3個平行樣結(jié)果

5 討論

世界動物衛(wèi)生組織將口蹄疫列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[5-6]。2013年至2014年，我國共計報告發(fā)生A型口蹄疫疫情22次，疫點(diǎn)分布廣東、青海和云南等6個省、自治區(qū)。從監(jiān)測陽性區(qū)域分布來看，我國口蹄疫病毒污染面較廣，病原長期存在，清除難度大。除此，境外毒株傳入風(fēng)險增加，對我國口蹄疫防控構(gòu)成重大威脅，每次從境外傳入我國一個新毒株，就會引發(fā)一輪疫情，如2005年Asia1型、2009年Sea-97G1毒株、2010年O型Mya-98毒株、2013年A型Sea-97 G2毒株，分別在我國引起4次高發(fā)[7]。另外，豬群免疫狀況參差不齊，存在疫情發(fā)生的風(fēng)險，廣東的肉豬群免疫效果一般，抗體合格率接近70%，存在隱性感染和發(fā)病的可能[8]。而且，跨省區(qū)動物移動頻繁，也是導(dǎo)致病情擴(kuò)散的原因。鑒于口蹄疫疫情危害的嚴(yán)重性和防控的困難性，及時、有效地檢測出被感染病豬，是控制疫情暴發(fā)和蔓延的有效措施。實(shí)時RT-PCR快速檢測方法的建立與應(yīng)用，為動物衛(wèi)生部及時確診和有效處置口蹄疫疫情提供了堅實(shí)的技術(shù)支持。但是，隨著商品化檢測試劑盒的推出，在為檢測工作帶來便利的同時，由于不同廠家試劑盒的敏感性、特異性等有所差異，導(dǎo)致結(jié)果會有所偏差，有的甚至?xí)z。因此，需要對這些商品化試劑盒進(jìn)行評估，以便為選擇最合適的試劑盒對口蹄疫病毒確診提供技術(shù)依據(jù)。

本研究所選的3個廠家的試劑盒是目前深圳市場常用的試劑盒。我們試驗(yàn)表明，3家試劑盒均具有較好的特異性，但是依據(jù)各自評判標(biāo)準(zhǔn)的靈敏性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，3個廠家試劑盒的有所差異，A試劑盒靈敏度和重復(fù)性最好，A檢出Ct值比B提前1～2個，比C提前1～4個Ct值，而且樣口濃度越低，差別越大；2X10-5濃度的3個平行樣檢測中，A均有擴(kuò)增，其中一個平行樣熒光增量較低，B和C均有1-3個平行樣無擴(kuò)增，這跟各家試劑盒的引物、探針的設(shè)計，反應(yīng)體系和原材料的選擇不同有很大的關(guān)系。因此，在檢測樣品的Ct值處于試劑盒判定的臨界值時，建議重復(fù)檢測，避免檢測結(jié)果的誤判。另外，在日常檢測過程中，對商業(yè)化試劑盒進(jìn)行定期的檢測結(jié)果差異實(shí)驗(yàn)是很有必要的。

本研究所選擇的試劑盒中，有采用核酸片斷或克隆質(zhì)粒作為陽性對照，無法質(zhì)控核酸的提取過程。而病毒顆粒的傳染性和裸RNA的不穩(wěn)定性也無法作為RNA的理想質(zhì)控品，已有應(yīng)用的盔甲RNA質(zhì)控品，是一種理想的質(zhì)控品，可以彌補(bǔ)這一缺陷。

本研究的3家試劑盒，均需要經(jīng)過提取RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA 和PCR的3個步驟，從拿到樣品到出RT-PCR檢測結(jié)果，全程至少需要2 h。目前，已有直接擴(kuò)增實(shí)時熒光RT-PCR技術(shù)的研究，該技術(shù)可以免去提取RNA的步驟，從樣品處理到擴(kuò)增完成，全程不超過1.5 h，極大地縮短了檢測時間，如應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)檢疫，將極高的提升檢測效率，對于重大動物疫病的診斷，防控，以及保障公共衛(wèi)生安全，具有重要意義。

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