植物根系分泌蛋白研究進(jìn)展

趙 坤，呂孝敏，胡訓(xùn)霞，張 萍，史春陽(yáng)，王喜慶，葛才林，王澤港(揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009)

根系分泌物是植物與外界信息、物質(zhì)、能量交流和交換的重要載體物質(zhì)。早在18、19世紀(jì)，Plenk等就發(fā)現(xiàn)根系分泌物具有促進(jìn)生長(zhǎng)和抑制鄰近植株的作用。到20世紀(jì)50年代，研究者發(fā)現(xiàn)了根系分泌物與固氮菌之間的互利關(guān)系。在20世紀(jì)70～90年代，根系分泌物的研究進(jìn)入一個(gè)新的時(shí)期。根系分泌物在植物營(yíng)養(yǎng)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與環(huán)境等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，而且根系分泌物與根際微生物間相生、相克關(guān)系就成為當(dāng)時(shí)一個(gè)重要的研究方向［1］。時(shí)至今日，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在微生物學(xué)、土壤學(xué)等相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展和研究技術(shù)不斷改進(jìn)的基礎(chǔ)上，逐步了解和完善不同植物根系分泌物的種類、分泌機(jī)制、根系分泌物的檢測(cè)方法，并且在根系分泌物與根際微生態(tài)環(huán)境之間相互作用等方面的研究都取得很大的進(jìn)步。目前，一般把復(fù)雜的根系分泌物分為三類:一是具有較強(qiáng)的黏性、吸附性和潤(rùn)濕作用的大分子的有機(jī)分泌物，如多糖、多聚半乳糖醛酸及少量蛋白質(zhì)、胞外酶;二是具有絡(luò)合、鰲合能力的小分子的可溶性有機(jī)物，主要有可溶性糖、氨基酸、有機(jī)酸、酚類等，它們可以為根際微生物提供重要的碳源;三是其他有機(jī)分泌物，主要是維生素、生長(zhǎng)素、膽堿、煙酸［2-4］。最初對(duì)根系分泌物的研究主要局限在小分子物質(zhì)一類，具有代表性的是張福鎖等對(duì)麥根酸植物鐵載體的研究。另外，研究發(fā)現(xiàn)，植物在高濃度的金屬脅迫下能夠形成植物螯合肽(Phytochelatins，PCs)。PCs既可以在根際環(huán)境存在，又可以在植物體內(nèi)存在。PCs主要起到對(duì)過(guò)量金屬的解毒和維持微量金屬元素體內(nèi)平衡的作用。然而，PCs是否由相關(guān)的基因控制還有待于進(jìn)一步的研究［5］。根系分泌蛋白作為根系分泌物的重要成分近年來(lái)逐漸成為研究熱點(diǎn)。分泌蛋白參與植物相關(guān)的根系胞外信號(hào)途徑、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等多種生物過(guò)程，并且根系分泌蛋白還對(duì)土壤養(yǎng)分有化學(xué)活化作用、修飾土壤且提高植物的抗逆能力。同時(shí)，根系分泌的酶類蛋白是對(duì)土壤酶的一個(gè)補(bǔ)充，并且影響根系蛋白分泌的因素除與植物種類及其生理特性有關(guān)外，還與外界環(huán)境密切相關(guān)。這其中主要包括養(yǎng)分脅迫、根際微生物等。Doloressa等［6］根據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽在蛋白質(zhì)合成中的作用，把嗜熱細(xì)菌來(lái)源的木聚糖酶、水母的綠色熒光蛋白和人胎盤(pán)分泌的堿性磷酸酶(SEAP)3種重組蛋白定位到質(zhì)外體中，通過(guò)根分泌和葉分泌途徑獲得表達(dá)，從而建立2種新的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)——植物根分泌和葉分泌，簡(jiǎn)化分離和純化程序，為利用轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白提供潛在的途徑，同時(shí)表明根分泌途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌途徑具有相似性。但是，根系分泌蛋白較少，而且多數(shù)分泌蛋白是酶類蛋白，富集、分離、鑒定工作繁雜、效率低;同時(shí)，植物分泌蛋白水平處于動(dòng)態(tài)變化中，往往導(dǎo)致分泌蛋白質(zhì)組學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差，目前對(duì)植物根系分泌蛋白的研究相對(duì)集中在脅迫條件下根系對(duì)逆境環(huán)境應(yīng)答方面的研究［7-9］。

1 分泌蛋白的主要分泌機(jī)制

在植物生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞之間必須進(jìn)行信息傳遞以保證基本的生命活動(dòng)。其中，蛋白質(zhì)分泌就是細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞的重要方式之一。

蛋白質(zhì)分泌包括2條基本的途徑。一是經(jīng)典分泌途徑。在這一途徑中，蛋白質(zhì)N端具信號(hào)肽序列，且依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體(Golgi apparatus)，即ER-Golgi途徑。二是非經(jīng)典的分泌途徑。分泌蛋白不含N端信號(hào)肽序列，其分泌過(guò)程不依賴于ER-Golgi。非經(jīng)典分泌又包括至少4種不同的分泌方式(圖1)［10］。

1.1 經(jīng)典分泌途徑 在經(jīng)典分泌途徑中，ER參與初生蛋白的合成、折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)與分泌［11］。蛋白質(zhì)的合成都是從細(xì)胞質(zhì)中游離核糖體上開(kāi)始的。經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體蛋白質(zhì)在其N端具有信號(hào)肽序列。當(dāng)合成的信號(hào)肽序列被信號(hào)識(shí)別顆粒(SRP)識(shí)別結(jié)合后，肽鏈延伸終止，此后SRP與受體結(jié)合，SRP脫離信號(hào)肽，蛋白質(zhì)合成重新開(kāi)始，與此同時(shí)信號(hào)肽引導(dǎo)新肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而信號(hào)肽序列則在信號(hào)肽酶的作用下被切除，肽鏈延伸到終止。進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的多肽鏈還要經(jīng)過(guò)各種修飾加工，如糖基化(Glycosylation)、羥基化(Hydroxylation)、?；?Acylation)和二硫鍵(Disulfide bond)的形成等。糖基化伴隨著多肽鏈的合成同時(shí)進(jìn)行，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中最常見(jiàn)的多肽鏈加工方式。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中加在多肽鏈上的寡糖鏈，還要在高爾基體中進(jìn)行一系列復(fù)雜的加工才能成為有活性的分泌蛋白。在合成過(guò)程中，多肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中要進(jìn)行折疊。不能正確折疊的多肽鏈一般不能進(jìn)入高爾基體，而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中很快地被降解［12］。

1.2 非經(jīng)典蛋白質(zhì)分泌途徑 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在真核細(xì)胞中存在著一類無(wú)信號(hào)肽的分泌蛋白。這些在細(xì)胞外有明確功能的蛋白質(zhì)且不含有信號(hào)肽的分泌蛋白不依賴于ERGolgi途徑，而是通過(guò)其他途徑進(jìn)行分泌。這類分泌途徑被稱為非經(jīng)典分泌途徑［10］。它們的分泌不需要ER-Golgi的參與，因此ER-Golgi分泌途徑的抑制劑布雷菲爾德菌素A(BFA)和莫能菌素不能抑制非經(jīng)典蛋白的分泌。蛋白的非經(jīng)典分泌是有選擇性的，不是細(xì)胞內(nèi)容物被動(dòng)釋放的結(jié)果，而且不伴隨著其他諸如LDH等細(xì)胞死亡標(biāo)志物的出現(xiàn)［13］。因此，這一類蛋白被稱為非經(jīng)典分泌蛋白。

非經(jīng)典蛋白質(zhì)分泌途徑作為另一種廣泛存在的蛋白質(zhì)分泌方式，在胞外信號(hào)途徑、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等多種生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基”途徑有效的補(bǔ)充和替代。以下是真核細(xì)胞非經(jīng)典分泌蛋白的特點(diǎn):①蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為12～45 kDa，沒(méi)有有功能的信號(hào)肽，通常由胞質(zhì)內(nèi)游離核糖體合成;②這些蛋白質(zhì)多為單體，有不參與形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，它們不需要經(jīng)過(guò)ER-Golgi的翻譯后修飾;③ER-Golgi的蛋白分泌途徑的抑制劑布雷菲爾德菌素A不能抑制非經(jīng)典蛋白分泌途徑［14］;④非經(jīng)典分泌途徑被證明依賴于能量和溫度，并且在多種條件下被抑制或激活，是可調(diào)控的［15-16］;⑤非經(jīng)典蛋白分泌過(guò)程被 NK-κB 依賴的信號(hào)傳導(dǎo)途徑［17］、細(xì)胞分化［18］和轉(zhuǎn)錄后修飾(如磷酸化)等所調(diào)控［19］。

盡管非經(jīng)典分泌蛋白有許多共同的特征，但不同的分泌蛋白也有其各自的分泌機(jī)制，主要分為組成型和調(diào)節(jié)型分泌。目前已有4種非經(jīng)典蛋白分泌途徑被廣泛報(bào)道，分別是①經(jīng)多囊體(MVBs)分泌;②經(jīng)液泡與細(xì)胞膜融合的分泌;③不依賴于高爾基體的胞質(zhì)蛋白分泌，如甘露醇脫氫酶(MTD)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HYG?);④經(jīng)雙層膜細(xì)胞器EXPO 的分泌［10］。

1.2.1 MVBs介導(dǎo)的蛋白分泌途徑。MVBs介導(dǎo)的蛋白分泌在動(dòng)物中研究報(bào)道較多。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明植物中同樣存在MVBs介導(dǎo)的蛋白分泌過(guò)程［20］。MVBs在植物細(xì)胞中也被稱作液泡前體(Prevacuolar compartments，PVCs)或晚期胞內(nèi)體(Late endosomes，LEs)。在植物受真菌等病原體感染時(shí)，往往會(huì)誘導(dǎo)植物體啟動(dòng)MVBs介導(dǎo)的蛋白分泌。這種由MVBs分子機(jī)器介導(dǎo)的非經(jīng)典蛋白分泌在植物體內(nèi)獨(dú)具特色。病程相關(guān)的貨物蛋白通過(guò)該途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外病原感染的乳突部位［21-23］。關(guān)于MVBs的來(lái)源，既有源于質(zhì)膜的轉(zhuǎn)內(nèi)吞作用，又有重新生物合成的［22-24］。Scheuring等［25］以擬南芥為材料的研究表明，植物中的MVBs起源于TGN/EE。在這一形成過(guò)程中，需要內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(Endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)的參與且形成管腔內(nèi)空泡，也需要膜聯(lián)蛋白(Annexin)以完成MVBs作為運(yùn)輸載體向液泡的釋放。ESCRT系統(tǒng)是真核細(xì)胞中完成胞內(nèi)體(Endosome)膜內(nèi)陷以形成多囊泡體(multi-vesicular body，MVB)的分子機(jī)器。ESCRT系統(tǒng)包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ和 Vps4-Vta1 共 5 個(gè)蛋白 - 蛋白復(fù)合物。晶體學(xué)研究已經(jīng)解析了大部分復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。它促使膜內(nèi)陷的分子機(jī)理一般認(rèn)為分3步:首先是ESCRT-Ⅰ和-Ⅱ在內(nèi)體膜上結(jié)合，并且促使內(nèi)體膜內(nèi)陷形成初始芽體;然后，ESCRT-Ⅲ在芽體頸部聚合，并且導(dǎo)致芽體的剪切，從而將內(nèi)腔囊泡(Intralumenal vesicles，ILVs)釋放到內(nèi)體腔，形成MVB;最后，Vps4/Vta1復(fù)合物以水解ATP提供能量將聚合的ESCRT-Ⅲ解聚以循環(huán)利用，完成更多的出芽過(guò)程［26］。Nielsen等［27］用大麥白粉菌感染擬南芥時(shí)發(fā)現(xiàn)，僅有3種SNAREs(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor protein receptors)分泌蛋白在侵染部位積累，分別是PENETRATION1(PEN1，也就是擬南芥中的AtSYP121)、ROR2(required for mlo-sjpecified resistanse 2，是大麥中PEN1的同系物)和AtSNAP33(即擬南芥中的soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor protein 33)。只有特殊類型的MVBs參與病原菌侵染的應(yīng)激響應(yīng)過(guò)程。

MVBs除參與病原應(yīng)激響應(yīng)外，還參與在正常生長(zhǎng)條件下蛋白的非經(jīng)典途徑分泌。在動(dòng)物細(xì)胞中，外泌體(Endosomes)是來(lái)自于MVBs和PM融合后的管腔囊泡［28］。不同研究者利用超速離心技術(shù)［29］、免疫熒光標(biāo)記技術(shù)［30-31］、免疫電子顯微鏡技術(shù)［32］在不同植物的胞外空間(Extracellular space，ECS)也發(fā)現(xiàn)了類似的外泌體囊泡。也有研究發(fā)現(xiàn)，在向日葵幼苗的ECS中檢測(cè)到不受BFA影響的LSP-jacalin相關(guān)植物凝集素(Helja)。該凝集素存在于類似外泌體的囊泡中［30］。越來(lái)越多的研究表明，MVBs是植物體內(nèi)介導(dǎo)蛋白非經(jīng)典分泌的重要方式之一。

1.2.2 不依賴于高爾基體的胞質(zhì)蛋白分泌。不依賴于高爾基體的胞質(zhì)蛋白分泌又稱為高爾基體旁路分泌(Golgi-bypass pathway)。在動(dòng)物體內(nèi)，ARF-GEF抑制劑BrefildinA(BFA)是一種常被用來(lái)檢測(cè)含信號(hào)肽蛋白是否經(jīng)高爾基體旁路分泌的有效工具。在20多年前，第一次用該方法在植物中檢測(cè)到多個(gè)高爾基體旁路分泌的蛋白，當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)在煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞液中存在多種多肽對(duì)BFA不敏感［33-34］。

迄今為止，在植物中發(fā)現(xiàn)的由高爾基體旁路分泌的蛋白主要有芹菜中的MTD和擬南芥中的HYGR兩個(gè)。一般情況下，MTD是植物和真菌體內(nèi)參與代謝與滲透調(diào)節(jié)的重要的碳水化合物。Cheng等［35］應(yīng)用透射電子顯微鏡法觀察到MTD在病原防御相關(guān)的植物激素水楊酸(SA)的誘導(dǎo)下會(huì)分泌至細(xì)胞外空間。該蛋白不含信號(hào)肽序列，是典型的無(wú)導(dǎo)肽分泌蛋白(LSP)。用高爾基體抑制劑Brefeldin A(BFA)處理，發(fā)現(xiàn)MTD分泌對(duì)BFA不敏感，也就是說(shuō)其分泌不依賴于高爾基體。MTD通過(guò)非經(jīng)典分泌途徑可實(shí)現(xiàn)其多樣性的細(xì)胞功能。在正常條件下MTD參與細(xì)胞內(nèi)的代謝與滲透調(diào)節(jié)功能，而在病原侵染等逆境條件下MTD可通過(guò)非經(jīng)典分泌途徑分泌至細(xì)胞外，并且將病原真菌分泌的甘露醇降解，以防其對(duì)活性氧的猝滅作用。這是因?yàn)榛钚匝鯇?duì)真菌的侵染有重要的抑制作用。HYGR是Zhang等［36］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第2個(gè)存在于植物中的由高爾基體旁路分泌的無(wú)導(dǎo)肽分泌蛋白。它可以磷酸化和鈍化潮霉素B。利用熒光免疫檢測(cè)技術(shù)和免疫金標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)擬南芥的突觸結(jié)合蛋白SYT2(Synaptotagmin 2)定位于高爾基體，SYT2與HYGR-GFP共表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)潮霉素B的超敏反應(yīng)。在細(xì)胞內(nèi)和胞外空間均被檢測(cè)到，但其分泌對(duì)BFA處理不敏感，表明其分泌不依賴于高爾基體的介導(dǎo)，而是受定位于高爾基體的SYT2的調(diào)控，并且通過(guò)非經(jīng)典途徑分泌，但對(duì)于這一分泌途徑的機(jī)制了解甚少。

1.2.3 液泡與質(zhì)膜融合介導(dǎo)的蛋白分泌途徑。有研究表明，當(dāng)受到病原細(xì)菌侵染時(shí)，擬南芥的液泡會(huì)與質(zhì)膜在感染部位融合而將植物防御相關(guān)的液泡酶分泌至質(zhì)膜外，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)［37］。在該融合過(guò)程中需要蛋白酶體復(fù)合物的催化。研究表明，組成蛋白酶體的3個(gè)組分中任意一個(gè)被沉默，那么液泡與質(zhì)膜的融合就會(huì)被抑制［38］，而該融合過(guò)程的抑制劑可以被蛋白酶體復(fù)合物降解，不過(guò)這種抑制劑到目前還未被分離、鑒定出來(lái)［18］。眾所周知，液泡的常規(guī)功能是維持植物細(xì)胞的完整性，即保持細(xì)胞的膨脹壓。因此，液泡與質(zhì)膜融合的存在就必然給人們帶來(lái)很多疑問(wèn)，比如，該融合過(guò)程中植物細(xì)胞如何實(shí)現(xiàn)病原防御?如何在液泡與質(zhì)膜融合后保持細(xì)胞的完整性和活力?是否有新的液泡產(chǎn)生?

1.2.4 EXPO介導(dǎo)的蛋白分泌途徑。胞外復(fù)合物(Exocyst comples)最早是在酵母中被分離、鑒定的［39］。后來(lái)，在動(dòng)物［40］和植物［41］中相繼被發(fā)現(xiàn)，包括其功能也被報(bào)道［42］。在酵母和動(dòng)物細(xì)胞中，胞外復(fù)合物僅有一個(gè)拷貝，而在大多數(shù)植物細(xì)胞中則存在相當(dāng)數(shù)量的旁系同源基因如EXO70s，在擬南芥中估計(jì)有23個(gè)旁系同源基因，而在水稻中可能有47個(gè)之多，但其功能尚未知［43-44］。植物中如此之多的EXO70s，表明不同的胞外復(fù)合物亞基可組合成更多的胞外復(fù)合物。這些胞外復(fù)合物除具有常規(guī)的質(zhì)膜系留作用外，可能還具有其他特定的功能［45-47］。在細(xì)胞水平上，擬南芥中的AtEXO70E2亞基被用作探測(cè)鑒定新的細(xì)胞組分EXPO的有效工具［48］。由于與已知細(xì)胞器或內(nèi)吞途徑標(biāo)記物FM4-64缺乏同源序列，又對(duì)常規(guī)的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BFA、wort-mannin或concanamycin A沒(méi)有響應(yīng)，EXPO被認(rèn)為不參與經(jīng)典的分泌途徑或內(nèi)吞途徑。但是，AtEXO70E2-GFP和EXPO-GFP在細(xì)胞外被檢測(cè)到，表明EXPO通過(guò)非經(jīng)典途徑分泌。另外，LSP:SAMS2(S-adenosylmethionine synthetase 2)在瞬時(shí)表達(dá)后可共定位于EXPO。這些研究結(jié)果表明，該蛋白是被EXPO逐步扣留并最終分泌到細(xì)胞外。SAMS2(S-adenosylmethionine synthetase 2，S-腺苷甲硫氨酸合成酶2)是目前唯一研究較深入的通過(guò)EXPO途徑分泌的蛋白［48］。這是關(guān)于植物體內(nèi)通過(guò)EXPO介導(dǎo)的非經(jīng)典蛋白分泌的首次報(bào)道。

2 根系分泌蛋白的研究技術(shù)和方法

2.1 根系分泌蛋白的分離 根系分泌蛋白是混雜在根系分泌物中的。要想研究根系分泌蛋白，必須先獲得根系分泌物。目前獲得根系分泌物的方法有很多種，常用的有基質(zhì)培養(yǎng)收集、溶液培養(yǎng)收集、土培收集等方法。根據(jù)不同的試驗(yàn)做出改進(jìn)的方法，有分根收集裝置［49］、自動(dòng)連續(xù)收集系統(tǒng)［50］以及塑料管連接多孔陶土頭減壓原位收集［51］等。在根系分泌物收集之后，進(jìn)一步作分離純化等預(yù)處理才能進(jìn)行有效的定性、定量分析，而常規(guī)的蛋白質(zhì)分離方法如沉淀法、吸附層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾等方法對(duì)蛋白含量低且成分復(fù)雜的根系分泌物，很難獲得其中的分泌蛋白成分。目前，分離蛋白的較有效的方法是分子膜法。在根系分泌物研究中廣泛應(yīng)用的便是分子膜與超速離心分離技術(shù)。不同分子量的分子膜孔徑一般介于0.001～1.000 μm之間。利用分子膜結(jié)合超濾濃縮技術(shù)，可將根系分泌物細(xì)菌、雜質(zhì)甚至病毒和蛋白質(zhì)、氨基酸及多肽有效地分離開(kāi)來(lái)，在分離出分泌蛋白的同時(shí)防止微生物對(duì)根系分泌物的降解［52］。

2.2 根系分泌蛋白的定性定量分析 根系分泌蛋白是根系分泌物中的一種重要的成分。常見(jiàn)的根系分泌蛋白主要是一些酶類物質(zhì)。根系分泌物中存在大量的酶，如轉(zhuǎn)化酶、磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶、RNA酶和DNA酶等。它們對(duì)修飾土壤起一定的作用，如番茄根釋放磷酸酶、玉米根釋放水解酶。植物根系分泌蛋白對(duì)植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的作用。因此，分泌蛋白組的研究是國(guó)內(nèi)外學(xué)者近年來(lái)研究探索的重要領(lǐng)域。這是由于分泌蛋白組不同于組織和細(xì)胞蛋白質(zhì)組，其分泌量低，干擾物多，又受收集、濃縮等過(guò)程的限制［53］。目前，關(guān)于植物根系分泌蛋白的報(bào)道還相對(duì)較少。

根系分泌蛋白主要通過(guò)以下方法來(lái)鑒定。植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的方法是雙向電泳與質(zhì)譜聯(lián)用［54］，但由于該方法要求上樣量大，低豐度蛋白質(zhì)難以檢測(cè)，所以不適合分析、鑒定植物根系分泌的量少且干擾物質(zhì)多的分泌蛋白。傳統(tǒng)的Edman降解法測(cè)定的肽序列準(zhǔn)確，雖然測(cè)定肽段序列的速度較慢，花費(fèi)較高，但目前依然是一種可靠的鑒定蛋白質(zhì)的方法。隨著Edman降解法在微量測(cè)序等方面的重大突破，它在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中仍發(fā)揮著重要作用［55］。生物質(zhì)譜技術(shù)具有極高的靈敏度和高能量。它是把樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比(m/z)的差異來(lái)分離且確定相對(duì)分子量，采用生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)主要是根據(jù)蛋白質(zhì)酶解后的肽質(zhì)量指紋圖譜和肽序列信息去搜索蛋白質(zhì)或核酸序列庫(kù)［56］。鳥(niǎo)槍法(Shotgun)則是運(yùn)用生物質(zhì)譜技術(shù)，并且集成2種或2種以上色譜分離鑒定技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)混合物的高通量分離鑒定。Shotgun技術(shù)的關(guān)鍵是對(duì)獲得的全蛋白進(jìn)行全酶切，得到多肽混合物，之后對(duì)其進(jìn)行兩維或多維色譜分離在線串聯(lián)質(zhì)譜分析［54］，然后通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，從而鑒定蛋白質(zhì)。馬瑋等［57］運(yùn)用Shotgun技術(shù)共鑒定得到玉米根系分泌物中的2 848個(gè)蛋白，獲得較完整的玉米根系分泌蛋白圖譜。Shotgun技術(shù)具有更高的靈敏性，更適合對(duì)低豐度蛋白質(zhì)、干擾物多的植物根系分泌蛋白組進(jìn)行鑒定，并且能夠獲得完整、可靠的蛋白質(zhì)組表達(dá)信息。

2.3 生物信息學(xué)對(duì)根系分泌蛋白的預(yù)測(cè)與分析 近年來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，各類生物信息學(xué)軟件及各類分子生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)不斷涌現(xiàn)，并且在生命科學(xué)領(lǐng)域中的作用日益廣泛。與測(cè)定蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位不同，生物信息學(xué)方法利用多種序列分析程序，根據(jù)蛋白序列的編碼特征，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的高通量分析。對(duì)于分泌蛋白的生物信息學(xué)鑒定方法，目前常應(yīng)用三類軟件的組合分析，來(lái)預(yù)測(cè)一個(gè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位及其可能的分泌途徑。目前常用的用于分泌蛋白預(yù)測(cè)的軟件列于表1。蘇源等［68］應(yīng)用信號(hào)肽分析軟件SignalP v3.0、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)軟件TargetP 1.1、GPI錨定位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件big-PI Predictor和跨膜螺旋分析軟件TMHMM2.0等4個(gè)軟件分析了稻瘟菌12 595個(gè)蛋白序列，發(fā)現(xiàn)有1 134個(gè)為分泌蛋白(約占全部蛋白的9%)，其中435個(gè)分泌蛋白有功能注釋，主要是代謝相關(guān)的酶類，其中細(xì)胞壁組分降解相關(guān)的酶有45個(gè)，還有相當(dāng)數(shù)量的酶與致病相關(guān)。SUBA3是由澳大利亞西澳大學(xué)(University of Western Austrilia)計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)中心創(chuàng)建、維護(hù)的擬南芥蛋白亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)庫(kù)(SUBA3，SUBcellular location of proteins in Arabidopsis)。該數(shù)據(jù)庫(kù)創(chuàng)建于2007年。亞細(xì)胞定位的信息來(lái)自于通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)和利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析的數(shù)據(jù)。最新版本的數(shù)據(jù)庫(kù)中亞細(xì)胞定位信息涉及22個(gè)預(yù)測(cè)分析程序，分別是Ada-Boost、ATP、BaCelLo、ChloroP 1.1、EpiLoc 、iPSORT、MitoPred、MitoProt、MultiLoc2、Nucleo、PCLR 0.9、Plant-mPLoc 、PProwler 1.2、Predotar v1.03、PredSL 、PTS1、SLPFA、SLP-Local、Sub-Loc、TargetP 1.1、WoLF PSORT 和 YLoc，可見(jiàn)生物信息學(xué)軟件在分泌蛋白預(yù)測(cè)分析中具有越來(lái)越重要的作用［69］。

表1 應(yīng)用于植物分泌蛋白預(yù)測(cè)分析的主要生物信息學(xué)軟件

3 展望

根系作為植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的重要器官，在養(yǎng)分與水分的吸收、土壤生物和非生物逆境(如病蟲(chóng)害、干旱、淹水、養(yǎng)分缺乏、土壤污染、土壤酸化等)適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。了解不同生長(zhǎng)條件下根系分泌蛋白的表達(dá)，對(duì)合理利用植物資源、提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要生產(chǎn)實(shí)踐意義。近年來(lái)，根系研究已成為植物科學(xué)研究領(lǐng)域中一個(gè)重要的研究方向。而了解根系蛋白分泌的調(diào)控作用和機(jī)制，從而將這些知識(shí)更好地運(yùn)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一個(gè)迫切的任務(wù)。目前科研人員面臨的挑戰(zhàn)在于弄清根系分泌中的運(yùn)輸系統(tǒng)和調(diào)節(jié)機(jī)制，從而有助于我們更好地了解根系分泌的化合物以及它們?cè)诟H中的作用;另外一個(gè)重大挑戰(zhàn)是對(duì)根系分泌的低豐度蛋白的分離與鑒定，并且最終闡明其生物學(xué)功能。根系分泌蛋白為土壤中的微生物提供了氮源和能源物質(zhì)。微生物活動(dòng)所分泌的蛋白同樣對(duì)根系分泌蛋白研究進(jìn)展產(chǎn)生一定的影響。那么，相應(yīng)的無(wú)菌培養(yǎng)系統(tǒng)將會(huì)成為未來(lái)研究的新方向。傳統(tǒng)生態(tài)學(xué)方法與現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)結(jié)合，有助于闡明根系分泌物與根際微生物間的相互作用。

在蛋白組學(xué)日益發(fā)展的今天，它在根系分泌蛋白的分離、鑒定方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。比如，早在20世紀(jì)90年代中期，就報(bào)道了在植物中非經(jīng)典分泌蛋白的存在，但只是近年來(lái)隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，大量的分泌蛋白才陸續(xù)被報(bào)道，并認(rèn)為有高達(dá)70%的分泌蛋白是通過(guò)非經(jīng)典途徑分泌的，也就是說(shuō)，大部分分泌蛋白的胞外轉(zhuǎn)運(yùn)是不依賴于經(jīng)典的ER-Golgi途徑的［20］。因此，發(fā)展高能量的定量蛋白組學(xué)技術(shù)是快速鑒定根系分泌蛋白的重要技術(shù)保證。

僅以試驗(yàn)手段去捕獲生物中重要分泌蛋白且做深入研究的效率是有限的，而通過(guò)生物信息學(xué)的手段高通量地獲悉生物中某一類型的蛋白，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選以獲得感興趣的蛋白，是一種簡(jiǎn)單、高效的方法。目前，雖然大部分生物信息學(xué)軟件可以預(yù)測(cè)蛋白組中可能的分泌蛋白，但仍存在較高的假陽(yáng)性。如何對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，并從中挑選出有意義的目標(biāo)蛋白并且對(duì)其進(jìn)行功能測(cè)定，是亟待解決的另一問(wèn)題［70-71］。

另外，已知分泌蛋白多為病原微生物與植物受體蛋白起作用的激發(fā)子和其他致病因子。結(jié)合計(jì)算機(jī)技術(shù)和生物信息學(xué)的方法，深入研究分泌蛋白組學(xué)，有助于為全面掌握植物與病菌相互作用的分子機(jī)制。同時(shí)，對(duì)植物的根系逆境條件下分泌蛋白的抗性機(jī)制研究具有重要的實(shí)踐意義。

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