鐵皮石斛組培快繁及移栽技術(shù)研究

林秀蓮 ，鐘均宏 ，楊自軒 ，嚴(yán)旭超 ，林永庚 ，鐘春水 ，賴鐘雄

（1.惠州工程技術(shù)學(xué)校，廣東惠州516023；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002）

鐵皮石斛（Dendrobium candidum Wal1．Ex Lind1．）為蘭科石斛屬多年生附生型草本植物，別名鐵皮蘭，因其莖節(jié)處呈黑褐色，又名黑節(jié)草。鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥，其化學(xué)成分為石斛多糖（高達(dá)21.7%）及石斛堿[1]。《中國藥典》收錄3種石斛屬植物，鐵皮石斛是之中最珍貴品種，具有滋陰清熱、養(yǎng)胃生津、潤肺止咳等功效，其所含的多糖成分具有增強(qiáng)人體免疫功能、防癌抗癌、恢復(fù)嗓音等功效[2]。鐵皮石斛喜陰涼、濕潤的環(huán)境，常附在高海拔懸崖峭壁或林內(nèi)樹干和巖石縫隙中。鐵皮石斛的種子極為細(xì)小，胚胎發(fā)育不完全，缺乏胚乳組織，萌發(fā)率極低（不足5%）[3]，且自然條件下必須與蘭菌共生才能萌發(fā)。因此無法在大田或苗床上播種，很難生產(chǎn)足夠的實生苗用于栽培。與此同時，鐵皮石斛對生長環(huán)境要求苛刻，成苗更困難。傳統(tǒng)的人工繁殖方式如分株、扦插等，繁殖速度慢，增殖率很低。鐵皮石斛具有極高的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值，長期依賴采挖野生資源來滿足市場需求。由于無節(jié)制的采挖以及鐵皮石斛自身生長、繁殖特性和對生長環(huán)境的特殊要求等原因，導(dǎo)致其野生資源日益稀少，種源已臨枯竭[4-11]。目前鐵皮石斛工廠化育苗存在問題，組培技術(shù)有待于進(jìn)一步優(yōu)化，組培苗移栽和栽培方面的研究報道較少。利用組培快繁技術(shù)繁殖試管苗，不僅是解決鐵皮石斛野生資源緊缺的有效方法，也對該物種的種質(zhì)資源保護(hù)起到積極作用。該試驗以市面上較少見誘導(dǎo)成功的紅桿鐵皮石斛原球莖為外植體，對原球莖增殖、原球莖分化、壯苗生根、試管苗馴化時間以及栽培基質(zhì)等整個過程進(jìn)行系統(tǒng)研究，并通過不同試驗篩選出適合各個階段的培養(yǎng)基配方或方法，以期縮短鐵皮石斛組培苗生長周期、降低組織培養(yǎng)成本、提高其移栽成活率，為鐵皮石斛工廠化育苗及其高效栽培提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛取自惠州工程技術(shù)學(xué)校園藝中心花卉大棚。9月授粉成功后，來年2月選擇天氣晴朗的下午采收種子，將其接種在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)原球莖，以誘導(dǎo)的原球莖進(jìn)行以下試驗。

1.2 方法

1.2.1 原球莖增殖。將原球莖分別接種在以下培養(yǎng)基中：I-1：MS+20 g/L 蔗糖+6 g/L 瓊脂；I-2；MS+10%馬鈴薯泥+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂；I-3：MS+20%馬鈴薯泥+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂；I-4：MS+30%馬鈴薯泥+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂；I-5：MS+20%香蕉泥+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂；I-6：MS+10%馬鈴薯泥+20%香蕉泥＋20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂。每個處理20瓶，每瓶接種3團(tuán)相似大小原球莖，每7 d觀察記錄1次，40 d后統(tǒng)計增殖率：增殖系數(shù)（%）=40 d后原球莖團(tuán)數(shù)／接種數(shù)×100。

1.2.2 原球莖分化。在MS+0.5 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+200 ml/L椰汁的培養(yǎng)基上，分別添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L BA，比較不同濃度 BA對原球莖分化的影響。培養(yǎng)基代號分別為II-1～I(xiàn)I-6。每個處理20瓶，每瓶接2團(tuán)，每7 d觀察記錄1次，40 d后統(tǒng)計分化系數(shù)。分化率（%）=植株分化總數(shù)/接種總數(shù)×100。

1.2.3 壯苗生根培養(yǎng)。在0.5 mg/L NAA+15%香蕉泥+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的基礎(chǔ)上，比較MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS 4種基本培養(yǎng)基對鐵皮石斛壯苗生根的影響。選取2 cm以上，有3片完整葉片的無根苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)生根。每個處理30瓶，每瓶接種3株，每7 d觀察記錄1次，40 d后統(tǒng)計生根率。

以上培養(yǎng)基 pH 均為 5.8，并在 1.1 kg·cm2、121 ℃下消毒20 min。

1.2.4 煉苗馴化時間的確定。將具有3～4片葉的鐵皮石斛生根苗進(jìn)行大棚馴化煉苗 7、14、21、28 d，以松樹皮為基質(zhì)，每個處理設(shè)90株生根組培苗，設(shè)3次重復(fù)，移栽45 d后記錄小苗長勢情況。

1.2.5 栽培基質(zhì)的選擇。將馴化28 d后的鐵皮石斛分別移栽在以下基質(zhì)中：①松樹皮；②松樹皮∶椰糠=1∶1；③松樹皮∶椰糠∶石頭=1∶1∶1，比較不同基質(zhì)對移栽成活率及長勢的影響。以上3種基質(zhì)，每個處理500株叢苗，設(shè)3次重復(fù)，移栽60 d后統(tǒng)計成活率及小苗長勢。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，生根培養(yǎng)光照 3 000 lx，其他為暗培養(yǎng)，濕度保持在70%。大棚溫度在（25±5）℃，光照 10 000 lx，濕度保持在 70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對原球莖增殖的影響

鐵皮石斛種子在MS空白培養(yǎng)基上進(jìn)行播種，3～4個月后可陸續(xù)長出原球莖。以這些原球莖為材料，研究不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛原球莖增殖的影響，結(jié)果見表1。根據(jù)方差分析結(jié)果，不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛原球莖增殖有顯著影響。根據(jù)6個處理的均值與兩兩比較結(jié)果，處理I-6的增殖系數(shù)最大且與其他5個處理均存在顯著差異；此外，I-6處理的原球莖簇生、松散并呈深綠色（圖1-A）。因此，同時添加10%馬鈴薯泥與20%香蕉泥對鐵皮石斛原球莖增殖效果最好，系數(shù)為3.05。

2.2 不同BA濃度對原球莖分化的影響

在MS+0.5 mg/LNAA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+200 ml/L椰汁的培養(yǎng)基上，研究不同BA濃度對鐵皮石斛原球莖分化的影響，結(jié)果見表2。根據(jù)方差分析結(jié)果，不同濃度BA對鐵皮石斛原球莖分化有顯著影響。根據(jù)6個處理的均值與兩兩比較結(jié)果，處理II-6的分化率最高，其次是II-5，這2個處理與其他4個處理均存在顯著差異。此外，II-5與II-6處理的原球莖分化整齊健壯，但I(xiàn)I-6處理的分化率最高（圖1-B）。因此，添加3.0 mg/L BA對鐵皮石斛原球莖分化效果最好，分化率為97%。

表1 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛原球莖增殖的影響

表2 不同BA濃度對鐵皮石斛原球莖分化的影響

2.3 不同基本培養(yǎng)基對壯苗生根的影響

在0.5 mg/L NAA+15%香蕉泥+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的基礎(chǔ)上，比較 MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS 4 種基本培養(yǎng)基對鐵皮石斛壯苗生根的影響，結(jié)果見表3。根據(jù)方差分析結(jié)果，不同基本培養(yǎng)基對鐵皮石斛壯苗生根有顯著影響。根據(jù)4個處理的均值與兩兩比較結(jié)果，1/2MS作為基本培養(yǎng)基的處理生根率最高，處理的原球莖分化苗健壯，且與其他3個處理均存在顯著差異。因此，1/2MS作為基本培養(yǎng)基對鐵皮石斛壯苗生根效果最好，生根率為99%（圖1-C）。

2.4 馴化時間對組培苗移栽成活率的影響

將具有3～4片葉的鐵皮石斛生根苗進(jìn)行大棚馴化 7、14、21、28 d，以松樹皮為基質(zhì)，結(jié)果見表 4。根據(jù)方差分析結(jié)果，不同馴化時間對鐵皮石斛組培苗移栽成活有顯著影響。根據(jù)4個處理的均值與兩兩比較結(jié)果，馴化28 d的處理移栽成活率最高，處理的組培苗健壯，且與其他3個處理均存在顯著差異。因此，馴化28 d對鐵皮石斛組培苗移栽成活效果最好（圖1-D），成活率為96%。

表3 不同基本培養(yǎng)基對鐵皮石斛壯苗生根的影響

表4 不同馴化時間對鐵皮石斛成活率的影響

2.5 栽培基質(zhì)對組培苗生長的影響

將馴化28 d后的鐵皮石斛分別移栽在不同基質(zhì)中，比較不同基質(zhì)對移栽成活率及長勢的影響，結(jié)果見表5。根據(jù)方差分析結(jié)果，不同栽培基質(zhì)對鐵皮石斛組培苗成活率及壯苗指數(shù)有極顯著影響。根據(jù)3個處理的均值與兩兩比較結(jié)果，單獨添加松樹皮或者添加松樹皮、椰糠、石頭的混合基質(zhì)處理移栽成活率都較高，且2個處理的壯苗指數(shù)較高，與以松樹皮∶椰糠為基質(zhì)的組培苗相比，有顯著差異。在研究中，發(fā)現(xiàn)同時添加松樹皮、椰糠與石頭的栽培基質(zhì)，鐵皮石斛組培苗更加壯碩，苗也更高（圖2），這可能與鐵皮石斛好氣性相關(guān)。因此，適合鐵皮石斛移栽的基質(zhì)為松樹皮∶椰糠∶石頭=1∶1∶1。

3 討論

通過試驗研究，獲得了通過原球莖增殖、分化、壯苗生根等方法得到的鐵皮石斛再生植株。但這種通過播種形成原球莖的方式只是組織培養(yǎng)獲得再生植株的一種方法。在今后的試驗中，可嘗試通過選擇其他適宜的外植體獲得完整植株以解決鐵皮石斛資源緊缺的問題。

表5 不同栽培基質(zhì)對鐵皮石斛組培苗生長的影響

圖1 鐵皮石斛的組培快繁技術(shù)

圖2 移栽5個月的鐵皮石斛大棚移栽苗

組培苗在無菌、有營養(yǎng)供給、適宜光照和溫度、100%相對濕度環(huán)境中生長[12-18]，但在馴化移栽過程中，環(huán)境發(fā)生了劇烈變化，如果不能謹(jǐn)慎處理好與環(huán)境因子的關(guān)系，就有可能造成大量死苗，進(jìn)而影響整體經(jīng)濟(jì)效益。鐵皮石斛喜溫暖、濕潤、半陰的氣候環(huán)境，該試驗研究了馴化時間與栽培基質(zhì)對鐵皮石斛成活率的影響，但其成活率還有待提高。因此，選擇適宜的馴化時間，并篩選出適宜的移栽基質(zhì)，結(jié)合調(diào)節(jié)環(huán)境條件，特別是移栽前期的濕度與溫度控制是提高移栽成活率的重要環(huán)節(jié)，也是今后要研究的重要內(nèi)容。

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