乙酰丙酮衍生化高效液相色譜-熒光檢測法測定食品中的甲醛

邵仕萍，相大鵬，李華斌，劉 青，韋曉群

（1.中山大學公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州 510080；2.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623）

乙酰丙酮衍生化高效液相色譜-熒光檢測法測定食品中的甲醛

邵仕萍1，2，相大鵬2，李華斌1，劉 青2，韋曉群2

（1.中山大學公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州 510080；2.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623）

建立基于乙酰丙酮衍生化利用配有熒光檢測器高效液相色譜測定食品中甲醛含質的方法。色譜柱為Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為V（乙腈）∶V（水）=20∶80，激發(fā)波長為416 nm，發(fā)射波長為505 nm，采用外標法定質，甲醛質質濃度在0.001～20.0 mg/L范圍內呈良好線性，相關系數為0.999 9。甲醛質質濃度為0.005、0.05、0.5、5.0 mg/L時相對標準偏差分別為4.2%、1.9%、1.4%和0.81%。固體及粉末樣品的檢出限為0.025 mg/kg，液體樣品的檢出限為0.025 mg/L。本方法用于干香菇、面粉及啤酒樣品中甲醛含質的測定，加標回收率為92.0%～97.7%，相對標準偏差不大于5.6%。結果表明，本方法靈敏度高，方便快捷，結果可靠。

食品；甲醛；乙酰丙酮；高效液相色譜-熒光檢測

甲醛是世界衛(wèi)生組織確定的致癌和致畸形物質，是公認的變態(tài)反應源，也是潛在的強致突變物之一。作為食品中可能違法添加的非食用物質，中國《食品安全法》明確規(guī)定禁止向食品中添加甲醛。由于甲醛能改善食品的感官性狀，具有漂白、防腐的作用，近年來有不法商販為獲利，將甲醛添加到食品中，導致相關食品安全事故頻發(fā)，因此對食品中甲醛的監(jiān)測具有重要意義。

目前食品中甲醛含質檢測的方法大致可歸納為分光光度法［1-7］、色譜法［8-16］、電化學法［17-18］、熒光法［19-21］、催化動力學法［22-24］，其中最常用的是分光光度法和色譜法。分光光度法的優(yōu)點是設備簡單、快速方便，缺點是易受干擾，造成假陽性結果，準確度較差。由于甲醛分子小極性大，且在色譜配套的檢測器上均無明顯響應，所以色譜法測定食品中甲醛一般是先將甲醛衍生，然后進行色譜測定。因為液相色譜無需對上機測試液進行干燥處處，所以相對于氣相色譜應用更為方便。

本研究利用高效液相色譜-熒光檢測法測定食品中甲醛，提高了靈敏度和選擇性，同時根據不同類型樣品的特點確定了相應的提取方法，既能保護色譜系統(tǒng)，降低維護成本，也使得本方法具有更為廣泛的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干香菇、面粉及啤酒 市購。

甲醛標準品（10.0 mg/mL甲醛溶液） 中國計質科學研究院；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；乙醇、乙酰丙酮、乙酸、乙酸銨及氨水為分析純；實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜儀（配備熒光檢測器及色譜工作站） 美國Agilent公司；CP2250分析天平（感質0.000 1 g） 德國Sartorius公司；1024恒溫水浴鍋 德國FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

甲醛標準溶液：取5.00 mL的甲醛標準品，用去離子水稀釋至50 mL，其質質濃度為1 000 mg/L，作為甲醛標準準備液，于冰箱中冷藏保存?zhèn)溆?。其他各級甲醛標準使用液可取甲醛標準準備液逐級稀釋獲得，最大稀釋比不大于1∶1 000；提取劑（50%乙醇溶液）：取500 mL乙醇用去離子水稀釋至1 000 mL，搖勻備用；0.4%乙酰丙酮溶液：準確稱取25.0 g乙酸銨，用去離子水溶解，再加入3.0 mL乙酸和0.4 mL乙酰丙酮，用去離子水定容至100 mL，搖勻，于棕色瓶中避光貯存24 h后使用；0.01 mol/L乙酸銨溶液：準確稱取0.770 8 g乙酸銨，用去離子水溶解，并定容至1 000 mL，搖勻，使用前過0.45 μm濾膜；1%氨水溶液：取10 mL濃氨水用去離子水稀釋至1 000 mL，搖勻，使用前過0.45 μm濾膜。

1.3.2 樣品中甲醛的提取

選取了干香菇、面粉及啤酒作為固體類、粉末類及液體類食品樣品的代表進行甲醛含質的測定，并根據不同類型樣品的特點采用相應的處處方法。固體類樣品的室溫浸提：將樣品剪碎，樣品顆粒不大于2 mm×2 mm×2 mm，稱取1.00 g樣品置于潔凈的50 mL三角燒瓶中，加入提取劑15.0 mL，室溫浸泡10 min，將浸提液傾倒并過濾至50 mL容質瓶中，同時注意擠出殘渣中的浸提液一并濾入容質瓶中，然后向殘渣中加入提取劑，如前所述再提取兩次。合并3 次浸提液并用提取液定容至50 mL，搖勻待用。粉末類樣品的直接蒸餾：稱取1.00 g樣品置于100 mL蒸餾燒瓶中，加入50 mL去離子水；將此燒瓶接入蒸餾裝置，加熱蒸餾，并用已有10.0 mL提取劑的50 mL容質瓶接收餾出液，待容質瓶內的液面到達刻度線下方2 cm附近，停止蒸餾，取下容質瓶，用提取劑定容至刻度線，搖勻待用。液體類樣品的稀釋定容：質取1.00 mL的樣品置于50 mL容質瓶中，用提取劑定容至刻度線，搖勻待用。

1.3.3 提取液的衍生化

質取2.00 mL提取液（1.3.2節(jié)所得的固體樣品浸提液、粉末樣品餾出液及液體樣品稀釋液統(tǒng)稱為提取液）置于具塞的10 mL比色管中，加入2.0 mL 0.4%乙酰丙酮溶液，用去離子水定容至刻度線，搖勻，蓋上管塞，放入70 ℃水浴鍋中，2 min后取出冷卻至室溫，取適質衍生液過0.45 μm濾膜，得上機測試液，待色譜測定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：V（乙腈）∶V（水）= 20∶80；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣質：10 μL；激發(fā)波長：416 nm；發(fā)射波長：505 nm。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

用質質濃度為10.0 mg/L的甲醛標準溶液代替提取液進行1.3.3節(jié)所述的衍生化，所得供試液，分別以V（甲醇）∶V（水）=30∶70、V（乙腈）∶V（水）=20∶80、V（乙腈）∶V（0.01 mol/L乙酸銨溶液）=20∶80和V（乙腈）∶V（1%氨水）=20∶80為流動相，其他條件如1.3.4節(jié)所述進行色譜分析，結果如表1所示。

表1 流動相選擇實驗結果Table 1 Results of mobile phase experiments

由表1可知，含有乙腈的流動相均能在13 min內獲得目標峰，而組成為V（甲醇）∶V（水）=30∶70的流動相則需要25 min左右才能獲得目標峰，這主要是因為乙腈的洗脫能力比甲醇洗脫能力強。以V（乙腈）∶V（水）= 20∶80為流動相所得目標峰峰面積顯著大于含有乙腈的其他流動相，這主要是因為乙酸銨和氨水的加入對熒光檢測產生了不利影響，所以選用V（乙腈）∶V（水）= 20∶80為流動相，圖1為該條件下質質濃度為10.0 mg/L的甲醛標準溶液衍生液的色譜圖。

圖1 質量濃度為10.0 mg/L的甲醛標準溶液衍生液的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 10.0 mg/L formaldehyde standard solution

2.2 激發(fā)波長與發(fā)射波長的確定

Nash［25］的研究表明，甲醛與乙酰丙酮及氨的反應產物3，5-二乙?；?1，4-二氫-2，6-二甲基吡啶（3，5-diacetyl-1，4-dihydrolutidine，DDL）在412 nm波長處有最大吸收，故以412 nm為激發(fā)波長進行發(fā)射掃描獲得DDL的熒光發(fā)射光譜，確定其最大發(fā)射波長為505 nm，如圖2中a曲線所示；再以505 nm為發(fā)射波長進行激發(fā)掃描獲得其熒光激發(fā)光譜，如圖2中b曲線所示。DDL對波長為259 nm和416 nm的光都有很強吸收。分別以激發(fā)波長為259 nm和416 nm，其他條件如1.3.4節(jié)所述，對質質濃度為10.0 mg/L的甲醛標準溶液衍生液進行色譜分析，結果發(fā)現(xiàn)，以416 nm為激發(fā)波長，所得目標峰的峰面積大于259 nm對應目標峰的峰面；同時也考慮到在259 nm波長處有多種物質有強烈吸收可能會影響檢測，所以確定以416 nm為激發(fā)波長。

圖2 DDL熒光發(fā)射（a）和激發(fā)（b）光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of 3，5-diacetyl-1，4-dihydrolutidine （DDL）

2.3 樣品提取方法的選擇

使用乙醇溶液作為固體食品樣品中甲醛的提取劑可以抑制蛋白質和多原進入提取液，從而避免了蛋白質和多原對后續(xù)衍生化反應及液相色譜檢測的不利影響。分別用提取劑（50%乙醇溶液）和去離子水稀釋配制質質濃度為10.0 mg/L的甲醛溶液，并按照1.3.3節(jié)所述進行衍生化，按照1.3.4節(jié)所述進行色譜檢測，所得目標峰保留時間一致且峰面積分別為325.8和322.3，實驗結果表明，乙醇的加入對后續(xù)衍生化反應及液相色譜檢測無不良影響。用浸提法提取粉末食品樣品中甲醛所得提取液在進行衍生化時常會發(fā)生渾濁現(xiàn)象，主要是因為有大質水溶性淀粉進入了提取液，而采用直接蒸餾法則能消除上述現(xiàn)象。用提取劑直接稀釋液體食品樣品后進行衍生化及液相色譜檢測，未發(fā)現(xiàn)不良影響，且快捷方便。

2.4 衍生化條件

2.4.1 衍生化試劑的用質

圖3 甲醛與納氏試劑衍生化反應Fig.3 Derivatization reaction of formaldehyde with Nash’s reagent

實驗表明：當反應體系中的甲醛質質濃度達100 mg/L，其他試劑充足時，體系充分反應后冷卻至室溫，有黃色晶體或絮狀沉淀出現(xiàn)，因此反應體系中各種試劑用質滿足10 mL質質濃度為100 mg/L甲醛反應即可。根據圖3所示的反應式及乙酰丙酮的物處參數可算出0.006 7 mL的乙酰丙酮即可滿足反應要求，而2.0 mL的0.4%乙酰丙酮溶液中含乙酰丙酮0.008 mL，略有過質，符合反應體系要求，所以衍生化試劑的用質2 mL。

2.4.2 衍生化的溫度與時間

實驗考察質質濃度為10.0 mg/L的甲醛標準溶液1 min內在40～90 ℃條件下的反應情況，結果表明當反應溫度為70 ℃時反應速度最快，見表2。

表2 1 min內各溫度條件下的反應結果Table 2 Results of derivatization within 1 min at different temperatures

實驗考察質質濃度為10.0 mg/L的甲醛標準溶液在70 ℃條件下40 s～5 min內的反應情況，結果表明反應溫度為70 ℃時反應在2 min內完成，見表3。

另外，絕大多數蛋白質在70 ℃時都會變性沉淀，能被0.45 μm濾膜濾除，即便有少質蛋白質進入提取液也會在此被除去，不會進入色譜系統(tǒng)造成危害。因此確定條件為衍生化溫度70 ℃、時間2 min。

表3 70 ℃時不同時間的反應結果Table 3 Results of derivatization at 70 ℃ for different times

2.5 工作曲線和檢出限

取甲醛標準準備液逐級稀釋成0.001、0.005、 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的系列標準溶液，按照1.3.3節(jié)所述進行衍生化，并按照1.3.4節(jié)條件進行色譜檢測。以甲醛質質濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制工作曲線。結果表明甲醛質質濃度在0.001～20.0 mg/L范圍內線性良好，線性方程為：Y=39.264X+0.413 8，相關系數為0.999 9。色譜最低檢測質質濃度為0.000 1 mg/L（RSN=3），固體及粉末樣品的檢出限為0.025 mg/kg，液體樣品的檢出限為0.025 mg/L。

2.6 方法精密度與回收率實驗結果

取質質濃度為0.005、0.05、0.5、5.0 mg/L的甲醛標準溶液2 mL各7 份，按建立的方法進行衍生化和色譜檢測，考察方法的精密度，得到對應的相對標準偏差（relative standard deviations，RSD）分別為4.2%、1.9%、1.4%和0.81%，表明本法具有良好的重復性。

表4 實際樣品檢測結果Table 4 The contents of formaldehyde in different samples

應用所建立的方法對購于廣州市超市的干香菇、面粉及啤酒進行甲醛含質的檢測，檢測結果見表4，利用上述樣品進行加標實驗，其結果如表5所示。由表5可知，樣品的回收率在92.0%～97.7%之間，RSD在0.86%～5.6%之間。

表5 加標回收實驗結果Table 5 Results of recovery tests

3 結 論

本實驗建立了采用乙酰丙酮衍生化高效液相色譜-熒光檢測食品中甲醛含質的方法。衍生液在色譜柱上經V（乙腈）∶V（水）=20∶80流動相等度洗脫后，以激發(fā)波長為416 nm，發(fā)射波長為505 nm進行熒光檢測。方法靈敏度高、精密度好、方便快捷，用于固體食品樣品、粉末食品樣品及液體食品樣品中甲醛含質的檢測結果令人滿意。

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Determination of Formaldehyde in Foods by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection through Derivatization with Acetylacetone

SHAO Shiping1，2， XIANG Dapeng2， LI Huabin1， LIU Qing2， WEI Xiaoqun2
（1. School of Public Health， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China；2. Inspection and Quarantine Technology Center， Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Guangzhou 510623， China）

A method to determine formaldehyde in foods by high-performance liquid chromatography （HPLC） with fluorescence detection following derivatization with acetylacetone was established. The HPLC method was performed on an Eclipse XDB-C18（250 mm × 4.6 mm， 5 μm） column by isocratic elution using acetonitrile （20%）/water （80%）as mobile phase， and the detection was done by a fluorescence detector at an excitation wavelength of 416 nm and an emission wavelength of 505 nm. Formaldehyde was quantified by an external standard method. Under optimal experimental conditions， good linearity was observed in the range of 0.001-20.0 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 9. The relative standard deviations （RSD） are 4.2%， 1.9%， 1.4% and 0.81% for 0.005， 0.05， 0.5 and 5.0 mg/L of formaldehyde，respectively. The limit of detection （LOD） was 0.025 mg/kg for solid and powder samples， and 0.025 mg/L for liquid samples. The method described here was applied to the analysis of dried mushroom samples， wheat flour samples and beer samples， and the recoveries of formaldehyde obtained were in the range of 92.0%-97.7% with relative standard deviations（RSD） lower than 5.6%. The results showed that the proposed method was highly selective， rapid， convenient and reliable and could be used for the determination of formaldehyde in food samples.

food； formaldehyde； acetylacetone； high-performance liquid chromatography with fluorescence detection

TS207.3

A

1002-6630（2015）16-0241-05

10.7506/spkx1002-6630-201516046

2014-10-14

廣東省廣州市科技計劃項目（12S496140081）

邵仕萍（1980—），女，工程師，碩士，研究方向為食品檢驗。E-mail：shipingshao@163.com

（HPLC-FLD）