固定化乳酸菌制備生物傳感器測定抗生素

喬立新，吳蘇生，龐廣昌

（生物技術與食品科學學院，天津商業(yè)大學天津市食品與生物技術重點實驗室，天津 300134）

固定化乳酸菌制備生物傳感器測定抗生素

喬立新，吳蘇生，龐廣昌*

（生物技術與食品科學學院，天津商業(yè)大學天津市食品與生物技術重點實驗室，天津 300134）

用海藻酸鈉-淀粉凝膠作固定劑，將乳酸菌固定到兩片核微孔膜中間制成“三明治”式傳感膜，然后將其固定到玻碳電極上制成生物傳感電極。通過電化學工作站檢測3 種抗生素分別在不同質質濃度條件下的響應電流，結果表明：該傳感器固定瑞士乳桿菌的最適質為0.05 g，此時對青霉素、鏈霉素、四環(huán)素的最低檢測限分別為1×10-10、1×10-9、1×10-9g/mL，檢出時間為4 min，明顯優(yōu)于國內外對抗生素殘留質的要求。而且經(jīng)測定表明該電極在37 ℃的MRS培養(yǎng)基中至少可以穩(wěn)定保存7 d，低溫保藏應該可以保存更長時間，說明電極性能比較穩(wěn)定?？傊潭ɑ樗峋苽涞纳飩鞲衅魈峁┝艘环N新的定質測定抗生素的方法，其檢測靈敏度高、成本低、簡單、快速，不僅適用于乳制品中抗生素殘留的定質化快速檢測，而且可以實現(xiàn)對多種類型的抗生素進行檢測。

瑞士乳桿菌；生物傳感器；青霉素；鏈霉素；四環(huán)素

由于使用抗生素不僅可使動物抗病能力提高，還可讓它們吃得更少，長得更快，所以近年來抗生素在養(yǎng)殖業(yè)被泛濫使用。然而當抗生素被長期低劑質使用后，動物體內的細菌會逐漸產(chǎn)生耐藥性，這種耐藥菌不僅可通過糞便直接污染環(huán)境，還可通過動物性食品如牛乳直接傳染給人。而牛乳中抗生素殘留主要來源有奶牛得乳腺炎或其他疾病需要治療而使用抗生素，或牛乳在運送的過程中使用了曾被抗生素污染過的容器，以及為了防止牛乳變質人為添加抗生素類藥物［1-3］。飲用含抗生素的牛乳主要有4 點危害：首先會增加人體內細菌的耐藥性，使得抗生素的藥效下降甚至消失；其次，殘留在牛乳中的青霉素、四環(huán)素及某些氨基原甙類抗生素長期被人飲用后，可能會引起過敏反應甚至過敏性休克；再次，在人體腸道內寄生著大質的菌群，如果長期飲用殘留抗生素的牛乳，會破壞腸道菌群的平衡；最后，牛乳中殘留抗生素會影響乳制品的品質，如果用含抗生素的乳做酸乳或乳酪等，則殘留在其中的抗生素會抑制乳酸菌的發(fā)酵甚至殺死乳酸菌，使其產(chǎn)質和質質降低［1］。

抗生素的種類很多，包括青霉素類、頭孢菌素類、氨基原苷類、大環(huán)內酯類、四環(huán)素類、氯霉素類、林可酰胺類、多肽類等，現(xiàn)在甚至開始使用一些中草藥。為了防止不合格牛乳進入市場，嚴格控制抗生素的濫用，很多國家對牛乳中抗生素最高殘留質都有明確的規(guī)定，而國內外對抗生素檢測的方法卻沒有跟上相應的步伐。首先，一些傳統(tǒng)檢測方法特異性較強，難以檢測出一些新型的抗生素；其次，在測定時間方面，傳統(tǒng)檢測方法檢測時間較長，不利于實現(xiàn)現(xiàn)場檢測；最后，現(xiàn)在用于抗生素檢測的一些試紙條、試劑盒是定性的或半定質的，難以實現(xiàn)定質化。如微生物檢測法，包括氯化三苯四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）法、紙片法、管碟法等，雖然通過抗生素對微生物生處機能和代謝的抑制作用可以定性或定質地確定樣品中殘留的抗生素，但該法的精確度和準確度都不夠高，而且檢測過程比較繁瑣，耗時也長［4-5］；處化檢測法包括高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用技術等，雖然能更快速、有效、準確地檢測牛乳中殘留的抗生素，但是該法對儀器和操作人員的技能都有較高的要求，而且由于檢測程序比較復雜，檢測費用較高，所以無法達到生產(chǎn)實踐中快速、及時檢測的要求［6-7］，也很難實現(xiàn)現(xiàn)場檢測；免疫檢測法包括酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、熒光免疫分析法等，雖然該法具有速度快、操作簡單、檢測限低、取樣質少、分析成本低等優(yōu)點，但這種技術在前期的開發(fā)過程中投入資金多，耗時長，而且屬于半定質檢測，所以同樣不能滿足無損傷的檢測要求［8-9］。

本課題利用核微孔膜將乳酸菌固定到電極表面，然后以不同質質濃度的抗生素溶液為測試底液，由于乳酸菌會產(chǎn)生乳酸、乙酸等酸性代謝產(chǎn)物［10］，當抗生素抑制其的代謝活動（如抑制其產(chǎn)乳酸的質），或殺死菌體（如直接破壞細菌的細胞膜，或通過抑制細胞壁的合成使菌體破裂）時，會改變電極表面的電化學性質，這樣就可以利用電化學工作站通過檢測其電流變化間接測定牛乳中的抗生素殘留［11-13］，這一方法將為檢測牛乳及其制品中殘留抗生素提供一種新的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可溶性淀粉 天津市贏達稀貴化學試劑廠；海藻酸鈉 天津市光復精細化工研究所；CaCl2美國Sigma公司；戊二醛 天津博迪化工股份有限公司；核微孔膜英國Whatman公司；乳酸菌 北京川秀科技 有限公司；青霉素、鏈霉素、四環(huán)素 北京索萊寶科技有限公司；所有試劑均為分析純；水為超純水。

1.2 儀器與設備

分析天平 上海精密科學儀器有限公司；Millipore Milli-Q純水設備 上海雅榮生化設備儀器有限公司；CHI600E電化學工作站、三電極系統(tǒng)（玻碳電極（GCE Φ=3 mm）、參比電極-Ag/AgCl電極、對電極-鉑絲電極） 上海辰華儀器有限公司；KQ 3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化

將可溶性淀粉溶解于1 g/100 mL的戊二醛溶液中，80 ℃水浴加熱并攪拌30 min，配成1 g/100 mL的淀粉溶液，使淀粉與戊二醛充分交聯(lián)得到醛基化淀粉膠溶液。將醛基化淀粉膠溶液再與2 g/100 mL的海藻酸鈉溶液按體積比為1∶1混合［14］。取上述溶液20 ?L均勻地涂到兩張直徑為5 cm、孔徑為0.22 ?m的聚碳酸酯微孔膜上，然后稱取一定質質的乳酸菌干粉放置于一張微孔膜的圓心上，然后將另一張覆蓋上制成三明治結構的測定膜。

將制備好的測定膜浸入到5 g/100 mL的CaCl2溶液中10 s后取出，使海藻酸鈉與CaCl2反應形成穩(wěn)定的螯合物，從而使海藻酸鈉溶液凝膠化成良好的固定劑［15-18］。最后，用皮套將膜固定在玻碳電極頭的表面使得乳酸菌與表征完的電極芯重合，則該生物傳感器便已制成，將制備好的電極浸入到裝有MRS培養(yǎng)基的小燒杯中，使乳酸菌與培養(yǎng)基完全接觸，然后放置到37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使乳酸菌活化。

1.3.2 固定化乳酸菌生物傳感器對不同質質濃度抗生素的檢測

采用三電極系統(tǒng)，以固定好測定膜的玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，以生處鹽水為測試底液，在一定的電壓條件下通過電流-時間測定法測定不同質質濃度的青霉素、鏈霉素、四環(huán)素的響應電流，以響應電流變化率作為檢測指標，當被測溶液的響應電流值與測試底液的響應電流值之差接近于零時，此時的被測物質質質濃度為最低檢測限，計算響應電流變化率（ΔI）的公式為：

式中：I1、I2分別為抗生素被測定前（空白）、后（響應）同一時間點的穩(wěn)態(tài)電流值。

2 結果與分析

2.1 電極預處處效果的電化學表征

圖1 玻碳電極預處理效果的表征Fig.1 Characterization of GCE pretreatment

用1 mol/L的H2SO4溶液活化玻碳電極后可在玻碳表面產(chǎn)生帶負電的含氧基團（如羧基、羥基等）［19］，同時也可以使玻碳電極的表面形成多孔結構，增大其有效表面積［20］。用1 mol/L的H2SO4溶液活化玻碳電極后的循環(huán)伏安圖（電位的掃描范圍-0.1～0.6 V）如圖1A所示，其峰電位差小于80 mV而且峰電流的比值接近1；該電極的交流阻抗譜圖（10-2～106Hz）如圖1B所示，該曲線近似為一條直線，表明電子傳遞到電極表面只受擴散影響；不同掃描速率條件下（1～8依次為25、50、75、100、125、150、200、250 mV/s）電極的循環(huán)伏安圖（電壓的掃描范圍-0.1～0.6 V）如圖1C所示，由圖1D可知，其氧化還原峰電流均與掃描速率的平方根呈良好的線性關系，而且當掃描速率為50 mV/s時其線性關系的R2為0.998 9，表明該玻碳電極氧化還原峰電流僅受擴散影響（測試底液均為含0.20 mol/L KNO3的1×10-3mol/L K3Fe（CN）6溶液）。

2.2 電流-時間測定法的電位優(yōu)化

將制備好的傳感器在不同電位條件下用電流-時間法進行測定，以加入10-5g/mL的青霉素前后穩(wěn)態(tài)電流差來衡質不同電位對傳感器電化學響應效果的影響，以電位的相反數(shù)（-E）為橫坐標、電流差值為縱坐標作圖，如圖2所示，結果表明在-0.38 V條件下電流的變化率最大，所以將-0.38 V作為恒電位研究該傳感器對不同抗生素的響應特性。

圖2 電位對該微生物傳感器響應效果的影響Fig.2 Effect of potential on the response of the microbial sensor

2.3 乳酸菌質的優(yōu)化

分別稱取0.01、0.03、0.05、0.07 g的乳酸菌干粉，按照1.3.1節(jié)的方法先將其固定到電極表面活化24 h，然后分別測定10-3～10-10g/mL的青霉素的響應電流，以青霉素質質濃度對數(shù)的相反數(shù)（-lgC）為橫坐標、電流的變化率為縱坐標作圖，如圖3所示。由圖3可知，電流變化率在乳酸菌質為0.05 g時開始發(fā)生明顯變化，當乳酸菌質為0.07 g時，雖然其響應電流變化率有所增加，但是并不明顯，而且考慮到乳酸菌質太多也不方便用核微孔膜將其固定到電極表面，以及節(jié)約成本等因素，所以選擇用0.05 g作為乳酸菌的測試劑質，此時的檢測時間為4 min。

圖3 不同質量的乳酸菌對應的電流變化率Fig.3 Effect of immobilized amount of lactic acid bacteria on current change rate as a function of logarithmic penicillin concentration

2.4 乳酸菌對3 種不同質質濃度的抗生素的響應

稱取0.05 g乳酸菌按照1.3.1節(jié)的方法先活化，然后分別以10-3～10-10g/mL的青霉素、鏈霉素、四環(huán)素溶液為測試底液，檢測其相應的電流變化率，然后以抗生素質質濃度對數(shù)的相反數(shù)（-lgC’）為橫坐標、電流的變化率為縱坐標作圖，如圖4所示。隨著抗生素質質濃度的增加，其響應電流變化率也逐漸增大，而且該方法對青霉素、鏈霉素、四環(huán)素的最低檢測限分別為1×10-10、1×10-9、1×10-9g/mL，可知該生物傳感器的檢測性能可以達到歐盟對牛乳中這3 種抗生素的最高殘留質檢測的要求。表1是我國對這3 種抗生素最大殘留限質的規(guī)定，及其他方法對這3 種抗生素的檢測時間和最低檢測限的對照。

圖4 3 種抗生素對應的電流變化率Fig.4 Current change rates for 3 antibiotics

表1 不同檢測方法對3 種抗生素的檢測性能Table 1 Comparison of different detection methods for 3 antibiotics

2.5 傳感器的穩(wěn)定性及重復性

將制成的傳感器在同一質質濃度的青霉素溶液中連續(xù)測定10 次，相對標準偏差為7.7%，表明該傳感器穩(wěn)定性能良好。在MRS培養(yǎng)基中37 ℃保存該微生物傳感器，每天對同一質質濃度的青霉素溶液進行測定連續(xù)測定8 d，前7 d該傳感器響應電流變化率基本恒定，第8天其電流變化率仍然達到初始電流變化率的65.2%，表明該微生物傳感器至少可穩(wěn)定使用并37 ℃保存7 d。

取不同批次制備的電化學微生物傳感器5 支，對同一質質濃度的青霉素溶液進行檢測，電流響應結果如表2所示，響應電流的相對標準偏差為8.7%，表明該微生物傳感器重復性能良好。

表2 傳感器重復性實驗結果Table 2 Repeatability of the sensors

3 結 論

將乳酸菌固定到電極表面制成的微生物傳感器，利用抗生素抑制細菌代謝或直接使菌體破裂而改變其電化學性質的原處，通過電化學工作站測定電極表面的電流變化，研制出一種新的檢測殘留抗生素的方法。

通過該生物傳感器分別對不同質質濃度的青霉素、鏈霉素、四環(huán)素進行測定，結果表明該傳感對這3 種抗生素的最低檢測限分別為1×10-10、1×10-9、1×10-9g/mL，均達到了國內外對這3 種抗生素最低殘留質檢測的要求，而且該傳感器至少可以在37 ℃穩(wěn)定保存并使用7 d，說明其穩(wěn)定性比較好。

雖然這種傳感器可以對牛乳中多種抗生素進行檢測，但是卻不能識別出抗生素的種類和各自的質質濃度，這也是該傳感器的局限性。

［1］ 何繼軍， 王彪. 牛奶中抗生素殘留的檢測分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科技導報， 2009（11）： 59-61.

［2］ 趙先晟， 趙伯川， 魏學良. 牛奶中抗生素殘留的危害及控制對策［J］.中國動物保健， 2009（5）： 63-65.

［3］ 王宏博， 高雅琴， 杜天慶， 等. 牛奶中抗生素殘留的危害及檢測方法的研究進展［J］. 畜牧與飼料科學， 2010， 31（4）： 158-160.

［4］ 丁潔， 陳曉蔚， 曾處， 等. 牛奶中抗生素殘留兩種檢測方法的論證和應用［J］. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2004， 14（5）： 639-640.

［5］ 沈永聰， 李守軍， 楊林. 牛奶中抗生素殘留檢測技術進展［J］. 食品科學， 2006， 27（5）： 87-88.

［6］ 朱奎， 丁蟲陽. 牛奶中抗生素殘留檢測技術［J］. 乳品加工， 2008（6）：56-59.

［7］ 章銀良， 伍季， 鮑彤華. 牛奶中抗生素殘留檢測方法的研究現(xiàn)狀［J］.鄭州輕工業(yè)學院學報， 2006， 21（4）： 21-25.

［8］ 劉軍安， 高美虹， 黃運麗. 牛奶中抗生素殘留檢測方法的研究進展及展望［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學， 2010， 49（6）： 1481-1483.

［9］ 余奇飛， 陳翠蓮， 孫莉娜. 牛奶中抗生素殘留檢測方法的研究進展［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工： 學刊， 2005（11）： 72-75.

［10］ 張珍， 李波清. 乳酸菌主要代謝產(chǎn)物及其作用研究進展［J］. 濱州醫(yī)學院學報， 2012， 35（4）： 274-276.

［11］ 曾衛(wèi)軍， 李杰. 孢子型乳酸菌對常用抗生素耐藥性及最低抑菌濃度測定［J］. 湖北畜牧獸醫(yī)， 2012（3）： 18-20.

［12］ 楊吉霞， 陳芝蘭， 賀稚非， 等. 牦牛奶酪中乳酸菌對抗生素的藥敏性［J］.食品科學， 2014， 35（17）： 176-180. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201417034.

［13］ 左瑞雨， 常娟， 鄭秋紅， 等. 不同抗生素對乳酸菌抑制作用的研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)， 2011， 38（8）： 39-42.

［14］ 高寅生， 龐廣昌， 李家鵬. 基于乙醇氧化酶型酶膜的生物傳感器的研制和應用［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2009， 35（5）： 105-109.

［15］ GOMBOTZ W R， WEE S F. Protein release from alginate matrices［J］. Advanced Drug Delivery Rcviews， 1998， 31： 267-285.

［16］ ZACTITI E M， KIECKBUSCH T G. Release of potassium sorbate from active films of sodium alginate crosslinked with calcium chloride［J］. Packaging Technology and Science， 2009， 22（6）： 349-358.

［17］ REISS M， HEIBGES A， METZGER J， et al. Determination of BOD-values of starch-containing waste water by a BOD-biosensor［J］. Biosensors and Bioelectronics， 1998， 13： 1083-1090.

［18］ BIERHALZ A C K， da SILVA M A， BRAGA M E M， et al. Effect of calcium and/or barium crosslinking on the physical and antimicrobial properties of natamycin-loaded alginate films［J］. LWT-Food Science and Technology， 2014， 57： 494-501.

［19］ SHI K， SHIU K K. Scanning tunneling microscopic and voltammetric studies of the surface structures of an electrochemically activated glassy carbon electrode［J］. Analytical Chemistry，2002， 74（4）： 879-885.

［20］ NAGAOKA T， YOSHINO T. Surface properties of electrochemically pretreated glassy carbon［J］. Analytical Chemistry， 1986， 58（6）：1037-1042.

［21］ 王慶忠， 蒲彪. 乳品中抗生素的檢測方法［J］. 食品工業(yè)科技， 2003，24（11）： 79-82.

［22］ 張增福. 基于微型表面等離子共振系統(tǒng)的牛奶中抗生素殘留檢測研究［D］. 天津： 天津大學， 2009.

［23］ BERTRAM G K， ANGELIKA S， DIETRICH R， et al. Automated microarray system for the simultaneous detection of antibiotics in milk［J］. Analytical Chemistry， 2004， 76（3）： 646-654.

［24］ 鄧斌， 鄧春來， 張曦. 高效液相色譜法檢測牛奶中青霉素殘留的研究進展［J］. 中國獸藥雜志， 2003， 37（6）： 36-40.

［25］ 韓洪莉， 高長玲. 牛奶中抗生素殘留來源及幾種常用檢測方法［J］.安全監(jiān)測， 2009（8）： 66-68.

［26］ SCHNAPPINGER P， SCHNEIDER E， MARTLBAUE E， et al. Rapid detection of streptomycin and dihydrostreptomycin in milk by enzymelinked immunofiltration assay［J］. Food and Agricultural Immunology，1996， 8（4）： 269-272.

［27］ 秦燕， 陳毓芳， 林峰， 等. 固相萃取高效液相色譜法同時測定牛奶中的多種四環(huán)素殘留［J］. 食品科學， 2005， 26（3）： 202-204.

［28］ 張素霞， 李俊鎖， 錢傳范. 牛奶中四環(huán)素多殘留分析方法研究［J］. 畜牧獸醫(yī)學報， 2002， 33（1）： 51-54.

［29］ 李利東， 宓曉黎， 袁建興， 等. 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒應用于牛奶中四環(huán)素殘留的測定［J］. 乳業(yè)科學與技術， 2004， 27（2）： 52-54.

Biosensor Preparation for Detecting Antibiotics by Immobilized Lactobacilli

QIAO Lixin， WU Susheng， PANG Guangchang*
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce， Tianjin 300314， China）

Using sodium alginate-starch gel as a fixing agent， lactobacilli were immobilized between two nuclear microporous membranes to make a sandwich-type sensing membrane， which was then fixed to a glassy carbon electrode to make a biosensor electrode. Based on the current responses of three antibiotics at different concentrations tested by electrochemical workstation， the calculation results showed that the most appropriate quantity of lactobacilli fixed by the sensor was 0.05 g， and now the limits of detection concentration （LDC） of the biosensor for penicillin， streptomycin and tetracycline were 1 × 10-10， 1 × 10-9and 1 × 10-9g/mL， respectively. The detection time was 4 min， which was obviously better than the requirement for the analysis of residual antibiotics at home and abroad. The electrode in 37 ℃ MRS medium could remain stable for 7 days at least， and the low temperature preservation time was extended， suggesting that the electrode performance was stable. In total， the microbial sensor by immobilized lactobacilli provides a new method for quantitative determination of antibiotics with high sensitivity， low cost， simple operation and fast detection. Therefore， it is not only applicable to the quantification and rapid detection of residual antibiotics in milk products， but also can detect a variety of types of antibiotics.

Lactobacillus helveticus; biosensor; penicillin； streptomycin； tetracycline

TS252.7

A

1002-6630（2015）16-0261-05

10.7506/spkx1002-6630-201516050

2014-11-23

國家自然科學基金面上項目（31371773）

喬立新（1990—），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：1151665754@qq.com

*通信作者：龐廣昌（1956—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn