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    玉米樣品前處理方法和掩蔽劑對(duì)ELISA檢測(cè)玉米赤霉烯酮的影響

    2015-12-27 01:08:33甄玉萍裴世春高建偉
    食品科學(xué) 2015年16期
    關(guān)鍵詞:烯酮毒素分?jǐn)?shù)

    甄玉萍,裴世春*,王 巖,高建偉,李 妍

    (齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

    玉米樣品前處理方法和掩蔽劑對(duì)ELISA檢測(cè)玉米赤霉烯酮的影響

    甄玉萍,裴世春*,王 巖,高建偉,李 妍

    (齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

    探討粉碎時(shí)間、提取劑、掩蔽劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素對(duì)酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測(cè)玉米赤霉烯酮的影響。結(jié)果表明,玉米樣品粉碎時(shí)間180 s以上、70%甲醇溶液為提取劑、添加0.025%魚(yú)皮膠的磷酸鹽緩沖液為掩蔽劑時(shí),檢測(cè)結(jié)果最為穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)高穩(wěn)定性玉米赤霉烯酮檢測(cè)ELISA試劑盒的開(kāi)發(fā)具有參考價(jià)值。

    真菌毒素;玉米赤霉烯酮;酶聯(lián)免疫吸附分析法;定量檢測(cè)

    玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZON)是常見(jiàn)的真菌毒素之一,常污染玉米、小麥、水稻等谷物,并通過(guò)加工過(guò)程會(huì)轉(zhuǎn)移到食品和飼料中,最終通過(guò)食物鏈危害人類的健康[1-2]。因此,關(guān)于ZON的檢測(cè)、去除及危害評(píng)估等方面[3-9]一直備受研究者們的關(guān)注,其中基于抗原抗體特異性反應(yīng)的ZON檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附分析(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)法因其具有快速、簡(jiǎn)便、高通量等特點(diǎn)[4],已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品及相應(yīng)食品中ZON毒素的檢測(cè)[5-9],但是,ZON的快速ELISA檢測(cè)方法在實(shí)際樣品的定量分析過(guò)程中常發(fā)生測(cè)定值偏差較大的現(xiàn)象,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因涉及到眾多因素,其中樣品前處理方法和樣品基質(zhì)對(duì)抗原抗體反應(yīng)的影響可以認(rèn)為是原因之一。雖然在提高樣品前處理效果的方法中有應(yīng)用超聲波、微波、超臨界等各種補(bǔ)助措施[10-14],但這些有悖于ELISA檢測(cè)的快速簡(jiǎn)便的初衷,因此,在確保ELISA檢測(cè)方法的簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)的基礎(chǔ)上如何通過(guò)改善樣品前處理[15-17]和消除樣品基質(zhì)[18]的影響等措施提高ELISA檢測(cè)穩(wěn)定性相關(guān)研究已經(jīng)被研究者所關(guān)注。

    為此,本研究選取污染了ZON的玉米為實(shí)驗(yàn)材料,以ZON污染度的ELISA測(cè)定值為指標(biāo),分析玉米樣品的粉碎程度、提取劑的選擇、提取劑的體積分?jǐn)?shù)、樣品基質(zhì)等因素對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果的影響,以期為有效提高ZON檢測(cè)ELISA方法的穩(wěn)定性提供實(shí)驗(yàn)性基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    玉米采自黑龍江省玉米種植區(qū);甲醇、乙醇、乙腈、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫酸(均為分析純) 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司;魚(yú)皮膠(fish skin gelatin,F(xiàn)G)、四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)、ZON標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)Sigma公司;ZON偶聯(lián)抗原(ZON-BSA) 北京中科匯文遺傳技術(shù)發(fā)展中心;山羊抗小鼠IgG /辣根酶標(biāo)記北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;抗ZON抗體 實(shí)驗(yàn)室自行制備[19-20]。

    1.2 儀器與設(shè)備

    VICTOR X4多功能酶標(biāo)儀、Wahser400 96 孔洗板機(jī) 美國(guó)GE公司;S-4300掃描電鏡 日本日立公司;Acquity超高效液相色譜-質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)聯(lián)用儀(光電二極管陣列檢測(cè)器、Masslynx4.1工作站) 美國(guó)Waters公司;HH.CP-7培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PEFERENCE超純水系統(tǒng) 美國(guó)密理博公司;FA1004N電子天平 上海菁海儀器有限公司;TG1650-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 上海汗諾儀器有限公司;HY-200篩子 北京祥宇偉業(yè)設(shè)備有限公司;AISITE高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 緩沖液的配制

    0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution,CBS)的配制方法:取1.59 g碳酸鈉、2.93 g碳酸氫鈉,加到1 000 mL去離子水中,加酸或堿調(diào)節(jié)pH值至9.6,置于4 ℃保存,備用。

    0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)的配制方法:取0.27 g磷酸二氫鉀、1.42 g磷酸氫二鈉、8.0 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀,加到1 000 mL去離子水中,加酸或堿調(diào)節(jié)pH值至7.4,置于4 ℃保存,備用。

    1.3.2 ZON檢測(cè)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法

    采用CBS作為抗原ZON-BSA的包被稀釋液,將其質(zhì)量濃度稀釋為0.25 μg/mL包被96 孔酶標(biāo)板,4 ℃條件下過(guò)夜。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉作為封閉液,37 ℃封閉1 h后洗板3 次,每孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品,再加抗ZON單克隆抗體50 μL/孔,37 ℃孵育1 h后洗板3 次,加入以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 100 μL/孔,37 ℃孵育1 h后洗板3 次,加入TMB顯色液100 μL/孔,顯色15 min后,加入稀硫酸50 μL/孔作為終止液,用VICTOR X4多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值并計(jì)算樣品中的毒素含量。

    1.3.3 UPLC-MS法

    UPLC條件:色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液,流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫條件為0~2 min,20% B;2~9 min,20%~95% B;9~9.1 min,95%~100% B;9.1~11 min,100% B;11~11.1 min,100%~20% B,11.1~13 min,20% B;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫40 ℃;樣品室溫度4 ℃;柱后分離進(jìn)入質(zhì)譜儀。

    質(zhì)譜條件:電離方式為電噴霧電離源;檢測(cè)方式為負(fù)離子[M-H]-模式;錐孔電壓40 V;毛細(xì)管電壓3.0 kV;離子源溫度100 ℃;脫溶劑氣流速600 L/h;反吹氣流量 10 L/h;質(zhì)量掃描范圍m/z 50~1 200。

    1.3.4 粉碎樣品

    玉米采摘后晾干,取足量玉米用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)對(duì)其進(jìn)行磨碎并計(jì)時(shí),計(jì)時(shí)時(shí)間分別為15、30、60、120、180、240 s。

    1.3.5 粉碎樣品顆粒分布的測(cè)定

    按時(shí)間磨粉后取出粉碎樣品,依次過(guò)20、40、60、80、100、120、140、160 目的篩子,然后分別稱質(zhì)量,計(jì)算每?jī)蓚€(gè)篩子之間的樣品質(zhì)量占總質(zhì)量的百分比。

    1.3.6 ZON的提取

    用四分法分別從各時(shí)間段粉碎樣品中取5 g樣品,分別用50 mL體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%的甲醇、乙醇、乙腈劇烈振蕩5 min[21],然后4 000 r/min離心5 min,取上清液作為樣品提取液,待用。以上步驟重復(fù)3 次。

    1.3.7 添加FG對(duì)ELISA檢測(cè)的影響

    在0.05 mol/L的PBS溶液中,分別添加0%、0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%的FG,用其作為掩蔽劑,將ZON標(biāo)品的質(zhì)量濃度以10 倍梯度稀釋為100、10、1、0.1、0.01、0 ?g/L,采用ELISA法進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.8 FG掩蔽效果的測(cè)定

    在1.3.7節(jié)測(cè)定結(jié)果的基礎(chǔ)上,確定可用FG的范圍,配制成稀釋液作為掩蔽劑,將1.3.6節(jié)所提取的樣品提取液平均分為2 份,一份添加體積均等的30 ?g/L的ZON標(biāo)準(zhǔn)品,一份添加體積均等的0.05 mol/L的PBS溶液,然后均采用1∶9的比例對(duì)提取液用配制好的梯度稀釋液進(jìn)行稀釋。采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行測(cè)定,添加毒素一組測(cè)定值為Cn(n≥1),未添加毒素一組測(cè)定值為Cn*(n≥1),用Cn-Cn*,所得數(shù)值與30 ?g/L標(biāo)準(zhǔn)添加值進(jìn)行比較。

    1.3.9 回收率實(shí)驗(yàn)

    在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上挑選幾組粉碎時(shí)間,將每組粉碎時(shí)間下的樣品均平均分為4 份,在前3 份樣品中分別添加量為500、50、5 ?g/L的ZON標(biāo)準(zhǔn)品,最后一份不加毒素做空白對(duì)照,采用以上經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取條件進(jìn)行提取,按照以上實(shí)驗(yàn)所得的最適ELISA方法和UPLC-MS法進(jìn)行測(cè)定,分別計(jì)算其回收率,比較2 種檢測(cè)方法的相關(guān)性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 粉碎時(shí)間與顆粒分布

    玉米中ZON污染度的ELISA檢測(cè)過(guò)程主要包括玉米樣品粉碎、ZON毒素提取、提取液稀釋、抗原抗體特異性反應(yīng)等程序,其中玉米顆粒樣品的粉碎是所有ZON檢測(cè)方法中必須進(jìn)行的一個(gè)過(guò)程,國(guó)內(nèi)針對(duì)ZON的檢測(cè)GB/T 23504—2009《食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定:免疫親和層析凈化高效液相色譜法》[22]規(guī)定,硬質(zhì)的糧食是用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)磨細(xì)后過(guò)1 mm的孔徑篩,但具體磨細(xì)到什么程度沒(méi)有界定,因此很難保障不同檢測(cè)者處理樣品時(shí)的一致性,進(jìn)而有可能產(chǎn)生測(cè)定值的實(shí)驗(yàn)誤差。

    圖1 不同粉碎時(shí)間對(duì)樣品粒徑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effect of grinding time on the mass fraction of samples with different particle sizes

    為了考察分析玉米粉碎程度對(duì)顆粒分布的影響,首先對(duì)粉碎時(shí)間與顆粒分布的相關(guān)性進(jìn)行了測(cè)定,即利用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)按不同時(shí)間粉碎玉米后過(guò)不同目數(shù)的篩子,分別稱量后計(jì)算顆粒質(zhì)量分配比例,其結(jié)果如圖1所示,當(dāng)粉碎時(shí)間從15 s延長(zhǎng)到240 s時(shí),小于100 目的大顆粒比例分別為61.21%、 41.06%、26.69%、13.04%、6.10%、4.95%,由此可知,隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng),大顆粒玉米粉所占比例逐漸減小。當(dāng)粉碎時(shí)間超過(guò)120 s時(shí),表現(xiàn)為細(xì)顆粒開(kāi)始明顯增加,但還有部分100~120 目的顆粒,而在粉碎180 s以后,顆粒分布發(fā)生顯著變化,過(guò)160 目及更細(xì)的顆粒比例超過(guò)了其他顆粒的質(zhì)量。由此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,隨著磨碎時(shí)間的不斷延長(zhǎng),不同顆粒大小的玉米粉分布具有顯著的變化,考慮到玉米不同大小顆粒的比例分布會(huì)產(chǎn)生比表面積的差異,進(jìn)而有可能對(duì)玉米樣品中提取ZON的效果產(chǎn)生影響,因此有必要在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上分析ELISA檢測(cè)ZON過(guò)程中樣品粉碎時(shí)間對(duì)ZON檢測(cè)結(jié)果的影響,進(jìn)而為國(guó)內(nèi)ZON檢測(cè)GB/T 23504—2009中硬質(zhì)玉米樣品的粉碎方法的完善提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    為了更好地觀察各時(shí)間段粉碎玉米顆粒的狀態(tài),將粉碎樣品在10 Pa真空度、15 mA離子電流條件下鍍金160 s,用掃描電鏡在20 kV加速電壓條件下進(jìn)行觀察,其結(jié)果如圖2所示。當(dāng)粉碎時(shí)間少于120 s時(shí)有大量的大顆粒玉米,當(dāng)粉碎時(shí)間在180 s以后大顆粒玉米顯著減少,小顆粒玉米粉增多且分布較為均勻。結(jié)合圖1的顆粒分布測(cè)定結(jié)果可知,玉米的粉碎時(shí)間在180 s時(shí),過(guò)100目以上的顆粒質(zhì)量合計(jì)超過(guò)93.90%,其中過(guò)160目以上的顆粒占總質(zhì)量的27.70%;玉米的粉碎時(shí)間在240 s時(shí),過(guò)100 目以上的顆粒質(zhì)量合計(jì)達(dá)到95.05%,其中過(guò)160 目的顆粒占總質(zhì)量的35.82%。玉米的粉碎時(shí)間在180 s以上時(shí)雖然超過(guò)160 目以上的顆粒分布隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,但是超過(guò)100 目以上的顆粒質(zhì)量總和沒(méi)有顯著變化,趨于穩(wěn)定狀態(tài)。

    圖2 不同粉碎時(shí)間對(duì)玉米顆粒分布的影響Fig.2 Effect of grinding time on the particle size distribution of corn powder

    2.2 添加FG對(duì)ELISA檢測(cè)的影響研究

    用ELISA方法檢測(cè)玉米中的ZON毒素,一般程序是將玉米粉碎后用有機(jī)溶劑對(duì)毒素進(jìn)行提取,然后對(duì)提取液進(jìn)行稀釋后直接進(jìn)行測(cè)定,這一過(guò)程中提取液及樣品基質(zhì)成分會(huì)影響ELISA的測(cè)定結(jié)果,因?yàn)樵诶糜袡C(jī)溶劑提取后的溶液中,會(huì)含有許多大分子蛋白、脂肪、色素等,這些成分甚至樣品溶液的pH值等都會(huì)非特異的影響抗體對(duì)抗原的親和作用,這種影響會(huì)降低抗體與抗原的結(jié)合能力,進(jìn)而降低免疫檢測(cè)方法的靈敏度和可靠性。

    消除基質(zhì)影響是免疫檢測(cè)方法應(yīng)用到實(shí)際樣品檢測(cè)中的重要保證,在傳統(tǒng)方法中,多采用稀釋法,降低這些基質(zhì)成分的質(zhì)量濃度來(lái)保證檢測(cè)方法的可靠性,但是,僅僅依靠單純的稀釋待檢測(cè)樣品的濃度并不能從根本上解決這些基質(zhì)成分的干擾,為此,于春娣等[23]試圖采用不同的掩蔽劑消除樣品提取液中基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響,發(fā)現(xiàn)利用0.5%的FG-PBS在檢測(cè)西維因時(shí)克服基質(zhì)影響方面效果較好,但是,此種方法是否也同樣適用于ZON的檢測(cè)中的基質(zhì)影響消除,未有定論。

    本實(shí)驗(yàn)采用在PBS溶液中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)魚(yú)皮膠的方法,用添有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)魚(yú)皮膠的PBS溶液稀釋ZON標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)過(guò)與抗原的競(jìng)爭(zhēng)和抗體的特異性的結(jié)合,最后測(cè)得吸光度,分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。其結(jié)果如圖3所示,將魚(yú)皮膠添加量定在0~10%,當(dāng)魚(yú)皮膠添加到10%時(shí),高質(zhì)量濃度魚(yú)皮膠本身就會(huì)對(duì)ELISA產(chǎn)生影響,而且隨著ZON含量的降低,魚(yú)皮膠對(duì)抗原抗體的競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)影響增大。用添加魚(yú)皮膠為0%的PBS溶液作為空白對(duì)照,添加的魚(yú)皮膠在1~10%時(shí),對(duì)低于1 ?g/L的ZON測(cè)定值具有顯著性影響,而當(dāng)魚(yú)皮膠添加至0.1%以下時(shí),對(duì)利用ELISA方法測(cè)定ZON含量結(jié)果的影響明顯減小,因此在利用ELISA檢測(cè)ZON過(guò)程中,對(duì)魚(yú)皮膠的使用不應(yīng)該超過(guò)0.1%。

    圖3 添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的魚(yú)皮膠作為標(biāo)品稀釋液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves established using 10-fold serial dilutions of fish skin gelatin in PBS buffer

    2.3 FG的掩蔽效果與添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究

    為了驗(yàn)證魚(yú)皮膠是否能作為玉米提取液的掩蔽劑以及在稀釋液中添加多少質(zhì)量分?jǐn)?shù)的魚(yú)皮膠可以達(dá)到掩蔽的效果,按1.3.8節(jié)所述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定與計(jì)算,其結(jié)果如圖4所示。當(dāng)添加魚(yú)皮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.025%、0.006 3%、0.001 6%、0.000 39%的PBS溶液作為稀釋液時(shí),測(cè)定結(jié)果分別為25.80、26.18、27.50、28.18、30.23、32.46 ?g/L,隨著添加魚(yú)皮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,掩蔽劑的效果逐漸增強(qiáng),但是在添加到0.1%時(shí)測(cè)定結(jié)果超過(guò)了標(biāo)準(zhǔn)添加值,表現(xiàn)為魚(yú)皮膠本身對(duì)ELISA測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生了一定的影響,而當(dāng)添加魚(yú)皮膠的量為0.025%時(shí),與標(biāo)準(zhǔn)添加值30 ?g/L無(wú)顯著性差異,說(shuō)明該添加量既對(duì)ELISA測(cè)定沒(méi)有影響,又可以消除基質(zhì)的干擾,有效提高了檢測(cè)精密度,當(dāng)添加魚(yú)皮膠的量為0.006 3%時(shí),與標(biāo)準(zhǔn)添加值差異顯著性較添加量為0.025%時(shí)略微增大,因此可知當(dāng)添加魚(yú)皮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%時(shí),可顯著消除樣品基質(zhì)對(duì)ELISA測(cè)定的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與于春娣等[23]所做有一定的差異性,前人在建立基質(zhì)中的西維因標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),采用的西維因含量是0.1~1 000 ?g/L,添加FG-PBS的量為0.5%,本研究在建立ZON的標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),因ZON在谷物中的含量大多較低,國(guó)標(biāo)[24]中對(duì)其限量有嚴(yán)格的要求,所以將其測(cè)定范圍定在0~100 ?g/L之間,在此測(cè)定范圍內(nèi)得出添加FG-PBS的量為0.025%為最佳。因此,本實(shí)驗(yàn)中ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程中的標(biāo)準(zhǔn)毒素稀釋液和樣品提取液的稀釋液均使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%的FG-PBS溶液。

    圖4 添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的FG對(duì)消除樣品基質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fish skin gelatin concentration on the elimination of sample matrix

    2.4 粉碎時(shí)間及提取溶劑對(duì)ELISA測(cè)定的影響

    在2.1、2.2節(jié)和2.3節(jié)分析的基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步考察顆粒分布及提取溶劑對(duì)ELISA檢測(cè)玉米中ZON含量的影響,選擇用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇、乙腈對(duì)不同粉碎時(shí)間的玉米樣品進(jìn)行毒素提取,并利用ELISA進(jìn)行定量測(cè)定,其結(jié)果如表1所示。

    表1 粉碎時(shí)間及提取溶劑對(duì)ELISA測(cè)定天然玉米樣品中ZON含量的影響Table 1 Effect of grinding time and extraction solvents on the content of ZON determined by ELISA?g/L

    在2.1節(jié)中已得知隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng),過(guò)100 目篩子以上的顆粒累積總和由38.79%增加至95.05%,等到120 s之后,粉碎顆粒大于100 目的累積總和均在86.96%以上。為了進(jìn)一步驗(yàn)證玉米粉碎程度對(duì)ELISA檢測(cè)玉米中ZON的影響,在圖1粉碎分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)不同粉碎時(shí)間的樣品進(jìn)行了ELISA檢測(cè)分析。

    從表1可以看出,ELISA檢測(cè)ZON的測(cè)定值隨著玉米粉碎時(shí)間的延長(zhǎng),測(cè)定值在不斷的增加,從180 s時(shí)開(kāi)始ZON的測(cè)定值和240 s時(shí)的測(cè)定值差異不顯著,結(jié)合圖1顆粒分布可知,玉米粉碎180 s后,100目以上顆粒分布趨于穩(wěn)定,因此,100目以上顆粒百分比可以作為一項(xiàng)ELISA檢測(cè)玉米中ZON毒素的一個(gè)處理指標(biāo)。

    提取溶劑的選擇也可從表1看出,根據(jù)數(shù)值進(jìn)行比較,提取劑效果最好的是甲醇,其次是乙腈,乙醇也可進(jìn)行毒素提取,但其提取效果不如前兩者。從溶劑的體積分?jǐn)?shù)來(lái)看,70%的甲醇溶液為效果最佳,當(dāng)粉碎時(shí)間達(dá)到180 s以后,50%的甲醇與70%的甲醇提取效果差異性并不十分顯著,但是在120 s以前有差異,說(shuō)明當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)可能會(huì)對(duì)不同粉碎時(shí)間的樣品產(chǎn)生誤差。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高達(dá)到90%時(shí),提取毒素效果反而減弱,其減弱的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。張藝兵等[25]在利用ELISA方法檢測(cè)ZON時(shí),也采用了70%的甲醇溶液作為提取劑,劉濤[21]在谷物中ZON毒素ELISA的研究中,同樣使用了甲醇作為提取劑,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證明了體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作為提取劑效果最佳。

    為了驗(yàn)證用ELISA檢測(cè)樣品中ZON含量結(jié)果的準(zhǔn)確性,將粉碎時(shí)間為180 s,用70%甲醇作為提取劑的提取液采用UPLC-MS和Masslynx4.1工作站進(jìn)行定性定量測(cè)定與分析,其結(jié)果如圖5、6所示。圖5為添加1 000 ?g/L的ZON毒素標(biāo)準(zhǔn)品圖譜,可以看出ZON的流出時(shí)間為5.66 min,對(duì)應(yīng)的其定性分子[M-H]-為m/z 317.15[26]。圖6為天然含有ZON的玉米樣品測(cè)定圖譜,同樣在5.66 min時(shí)出峰,且具有相同的分子離子峰([M-H]-,m/z 317.15),與ZON的標(biāo)準(zhǔn)品圖譜一致。將該標(biāo)準(zhǔn)毒素進(jìn)行梯度稀釋后分別用UPLC-MS進(jìn)行檢測(cè),測(cè)得數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將天然含有ZON的玉米樣品帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行計(jì)算,最終求得樣品中ZON的污染量為750.84 ?g/L,該數(shù)值與用ELISA測(cè)得的數(shù)值無(wú)顯著性差異,證明了以上結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    圖5 ZON標(biāo)準(zhǔn)品離子流(A)及質(zhì)譜圖(B)Fig.5 Ion current chromatogram and mass spectrum of ZON standard

    圖6 玉米樣品離子流圖(A)及質(zhì)譜圖(B)Fig.6 Ion current chromatogram and mass spectrumof corn sample

    2.5 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    為了驗(yàn)證表1采用ELISA方法所得的測(cè)定值的精確性和準(zhǔn)確性,選取120、180、240 s粉碎時(shí)間的粉碎樣品,在粉碎樣品中添加不同水平的ZON標(biāo)準(zhǔn)品,用ELISA和UPLC同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),分別計(jì)算其回收率,其結(jié)果如表2所示。由表2可知,ELISA測(cè)定值與UPLC檢測(cè)值基本一致,兩種檢測(cè)方法的回收率均在87%以上,因此,ELISA方法可應(yīng)用于樣品中ZON的檢測(cè)。

    表2 ZON添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recoveries of ZON from spiked corn

    3 結(jié) 論

    綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,當(dāng)粉碎時(shí)間180 s以上,提取劑為甲醇,體積分?jǐn)?shù)為70%,樣品稀釋液使用含有FG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%的PBS溶液時(shí),玉米中ZON毒素的ELISA檢測(cè)結(jié)果最為穩(wěn)定。本研究進(jìn)一步明確了玉米粉碎程度、提取劑、掩蔽劑等因子對(duì)ELISA檢測(cè)ZON含量的影響,優(yōu)化了檢測(cè)效果,本實(shí)驗(yàn)為高穩(wěn)定性檢測(cè)ZON ELISA試劑盒的開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)性數(shù)據(jù),同時(shí)也為優(yōu)化其他真菌毒素的ELISA檢測(cè)方法的研究提供了新思路。

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    Effect of Pretreatment Methods and Masking Agents for on the Detection of Zearalenone in Corn by ELISA

    ZHEN Yuping, PEI Shichun*, WANG Yan, GAO Jianwei, LI Yan
    (College of Food and Biological Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China)

    In the present study, the effects of grinding time, extraction solvents and different amounts of masking agents on the detection of zearalenone were explored. The most stable results were obtained when corn samples were ground for more than 180 s, and then extracted with 70% methanol using phosphate buffer solution with 0.025% fish skin gelatin as the masking agent. The findings of this study can provide a reference for the development of highly stable ELISA kit for the detection of zearalenone in corn.

    mycotoxin; zearalenone; enzyme-linked immunosorbent assay; quantitative detection

    R446.61

    A

    1002-6630(2015)16-0255-06

    10.7506/spkx1002-6630-201516049

    2015-04-28

    齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(YJSCX2014-015X);國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)(2013FY113400);黑龍江省教育廳科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(12541871)

    甄玉萍(1990—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail:15146694340@139.com

    *通信作者:裴世春(1966—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail:1079481030@qq.com

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