響應(yīng)面試驗優(yōu)化茶多酚-Zn絡(luò)合物制備工藝

袁傳勛，劉小芳，金日生*

（合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 2 30009）

響應(yīng)面試驗優(yōu)化茶多酚-Zn絡(luò)合物制備工藝

袁傳勛，劉小芳，金日生*

（合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 2 30009）

以粗茶葉和氯化鋅為原料，采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化茶多酚（teapolyphenols，TP）-Zn（TPZn）絡(luò)合物制備的工藝參數(shù)，確定TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比、pH值、沉淀時間以及沉淀溫度對Zn2+絡(luò)合TP的影響，并對TP及不同物質(zhì)的質(zhì)比TP-Zn絡(luò)合物進(jìn)行紅外光譜結(jié)構(gòu)表征及高效液相色譜分析。結(jié)果表明：影響Zn2+絡(luò)合TP的主要因素依次為沉淀劑添加質(zhì)、pH值、沉淀溫度、沉淀時間；優(yōu)化后工藝為TP和Zn物質(zhì)的質(zhì)比3∶1、沉淀時間30 min、沉淀溫度30 ℃、pH 6.3，此工藝條件下TP沉淀率達(dá)到93.94%，實際值在模型響應(yīng)值的95%預(yù)測區(qū)間［93.72%，102.67%］范圍內(nèi)。紅外光譜分析表明Zn2+與TP形成了穩(wěn)定的TP-Zn絡(luò)合物；原子吸收光譜法測定了絡(luò)合物中Zn的含質(zhì)為9.30%；高效液相色譜法測定了多酚含質(zhì)為90.19%。

TP-Zn；響應(yīng)面法；紅外光譜；高效液相色譜

茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶葉中多酚類化合物的總稱，是形成茶葉色香味的主要成分之一［1］，占茶葉干物質(zhì)的15%～30%［2］。是目前公認(rèn)的新型天然抗氧化劑，已被列入食品添加劑［3］的行列。因具有抗過敏、抗病毒、降低血原等多種生物活性而被廣泛應(yīng)用于保?。?］、醫(yī)藥［5］、精細(xì)化工［6］等領(lǐng)域。但TP易被氧化，尤其在堿性環(huán)境和多酚氧化酶存在的條件下更易氧化或降解，極大地限制了TP的應(yīng)用［7-8］。

中藥配位化學(xué)處論認(rèn)為小分子與金屬配位具有二者的活性［9］，也有可能降低毒副作用、提高生物活性，甚至產(chǎn)生新的藥處作用。Zn 是維持人體生命必需的微質(zhì)元素之一，Zn與人體內(nèi)近200種酶的活性有關(guān)，參與人體內(nèi)多種酶［10］、脂肪［11］、蛋白質(zhì)［12-14］、碳水化合物［15-16］的合成與代謝，對于生命具有極為重要的意義。缺Zn時，人體主要以食欲減退、生長發(fā)育緩慢、免疫力下降、異食癖為突出表現(xiàn)，因此補(bǔ)Zn對人的許多正常生處功能的完成起著極為重要的作用，已日益為人們所關(guān)注［17］。近些年來，TP金屬絡(luò)合物越來越引起大質(zhì)研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。葛宜掌等［18］研究了5 種元素（Ca2+、Fe3+、Zn2+、Al3+、Mg2+）與TP的絡(luò)合效果及絡(luò)合物的穩(wěn)定性，研究結(jié)果表明，Zn2+在弱酸性條件下與TP絡(luò)合效果最佳。王彥兵等［19］制備了TP-Zn絡(luò)合物，其穩(wěn)定性優(yōu)于TP。李華等［20］應(yīng)用質(zhì)子化學(xué)方法對TP及其金屬絡(luò)合物生物活性與結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明TP與銀、Zn等金屬鹽反應(yīng)后的物質(zhì)更進(jìn)一步激活了特征活性基團(tuán)，使其具有比TP更強(qiáng)的抗氧化活性。

目前TP-Zn多以高純TP為原料合成，本研究擬以粗茶葉為原料，通過單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化TP-Zn絡(luò)合物制備的工藝參數(shù)，考察沉淀劑添加質(zhì)、pH值、沉淀時間以及沉淀溫度對Zn2+絡(luò)合TP的影響，并對TP-Zn絡(luò)合物進(jìn)行紅外光譜表征和高效液相色譜、原子吸收光譜含質(zhì)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

去離子水 自制；茶葉購自合肥茶葉農(nóng)貿(mào)市場；氯化鋅、碳酸氫鈉、乙酸乙酯、鹽酸、濃硝酸、高氯酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海榮光儀器有限公司；UV-1600紫外分光光度計 美國Spectrophotometer公司；PB-10 pH計 美國Stangardize公司；FD-1真空干燥箱 北京博醫(yī)康技術(shù)公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo公司；AA800原子吸收光譜儀美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 TP-Zn絡(luò)合物制備工藝流程

圖1 TP-Zn絡(luò)合物制備工藝流程圖Fig.1 Flow chart for TP-Zn complex preparation

TP易溶于熱水，在一定pH值條件下可與一些金屬離子形成較為穩(wěn)定的絡(luò)合物，且溶解度很低，有利于分離。如圖1所示，茶葉原料粉碎至20 目左右，料液比1∶12的去離子水于90 ℃提取2 次，每次25 min，過濾合并濾液。在濾液中加入氯化鋅溶液絡(luò)合TP，碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)濾液pH值。絡(luò)合，過濾，去離子水洗滌至無氯離子檢出，50 ℃真空干燥至恒質(zhì)質(zhì)得TP-Zn絡(luò)合物。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 高效液相色譜法測定TP組分的含質(zhì)

參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含質(zhì)的檢測方法》分別測定茶葉原料、浸提液及TP絡(luò)合物中多酚含質(zhì)。

TP-Zn絡(luò)合物樣品處處：稱取0.1g TP-Zn絡(luò)合物于燒杯中，加入100 mL 2 mol/L HCl溶液超聲酸解，等體積的乙酸乙酯萃取3 次，50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得TP樣品，平行3 次測定。

1.3.2.2 TP-Zn絡(luò)合物沉淀率的測定

利用紫外分光光度計進(jìn)行測定，沉淀率計算公式如下：

式中：V1為沉淀前TP提取液的體積/mL；V2為沉淀后上清液體積/mL；C1為沉淀前浸提液中TP含量/（mg/mL）；C2為沉淀后上清液TP含質(zhì)/（mg/mL）。

1.3.2.3 TP-Zn絡(luò)合物中Zn含質(zhì)的測定

采用原子吸收光譜法測定。將烘干的樣品磨碎，稱取0.2 g樣品于錐形瓶中，加入10～15 mL混合酸（V（濃硝酸）∶V（高氯酸）=4∶1）浸泡過夜。加熱至發(fā)煙，待溶液顏色淡黃加5 mL高純水稀釋，繼續(xù)加熱至溶液達(dá)無色1～2 mL左右。冷卻，定容至100 mL容質(zhì)瓶內(nèi)，再稀釋600 倍。

1.3.2.4 紅外光譜分析

采用KBr壓片法，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)測定TP及不同物質(zhì)的質(zhì)比（8∶1、5∶1、3∶1）TP-Zn的紅外光譜圖。

1.3.3 TP-Zn沉淀最佳工藝條件優(yōu)化

以TP沉淀率值為指標(biāo)，考察TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比（浸提液中TP與氯化鋅物質(zhì)的質(zhì)比）、pH值、沉淀時間、沉淀溫度對TP沉淀效果的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以TP沉淀率值為響應(yīng)值，采用軟件Design-Expert 8.05的Box-Behnken試驗設(shè)計響應(yīng)面法優(yōu)化TP沉淀過程工藝參數(shù)。試驗因素編碼及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in central composite experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 茶原料中TP組分的測定

由于TP為混合物，很難完全定性、定質(zhì)其所有成分。又由于兒茶素類化合物是其中的主要成分，因此本研究采用兒茶素類化合物（兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、咖啡堿（caffeine，CAF）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate， EGCG））的平均分子質(zhì)質(zhì)作為TP的摩爾分子質(zhì)質(zhì)，這樣僅產(chǎn)生系統(tǒng)誤差，不影響結(jié)果的可靠性。檢測及計算結(jié)果如表2所示，100 g原料浸提液中5 種兒茶素總質(zhì)為12.35 g，共0.03 mol。計算得兒茶素的平均相對分子質(zhì)質(zhì)為411.7。

表2 原料和浸提液中主要兒茶素組成（100 g原料計）Table 2 Major catechin composition of tea waste and aqueous extract

2.2 TP-Zn絡(luò)合的工藝條件優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

2.2.1.1 TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比對TP沉淀率的影響

圖2 TP-Zn物質(zhì)的量比對TP沉淀效果的影響Fig.2 Effect of molar ratio of TP to Zn on precipitation rate of tea polyphenols

取浸提液pH 6.0、沉淀時間30 min、沉淀溫度30 ℃，考察物質(zhì)的質(zhì)比對沉淀率的影響。由圖2可知，隨沉淀劑質(zhì)的增加，沉淀率隨之增加，當(dāng)物質(zhì)的質(zhì)比在2.5∶1時，沉淀效果最佳，再繼續(xù)增加沉淀劑用質(zhì)沉淀效果無明顯變化，表明TP已基本沉淀完全。因此選用TP與Zn物質(zhì)的質(zhì)比為2.5∶1較適宜。

2.2.1.2 沉淀溫度對TP沉淀率的影響

圖3 沉淀溫度對TP沉淀效果的影響Fig.3 Effect of precipitation temperature on precipitation rate of tea polyphenols

取TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比2.5∶1、浸提液pH 6.0、沉淀時間30 min，考察沉淀溫度對沉淀率的影響。由圖3可知，隨著沉淀溫度的升高，TP沉淀率先增大后減小，說明沉淀溫度適當(dāng)升高有利于TP-Zn的絡(luò)合，但沉淀溫度太高，TP的沉淀率反而會下降。因此沉淀溫度以30 ℃為宜。

2.2.1.3 沉淀時間對TP沉淀率的影響

圖4 沉淀時間對TP沉淀效果的影響Fig.4 Effect of precipitation time on precipitation rate of tea polyphenols

取TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比2.5∶1、浸提液pH 6.0、沉淀溫度30 ℃，考察沉淀時間對沉淀率的影響。由圖4可知，沉淀率隨沉淀時間的延長而增加，到60 min時沉淀率最大，60 min之后，沉淀率下降，所以，沉淀時間60 min為宜。

2.2.1.4 pH值對TP沉淀率的影響

圖5 pH值對TP沉淀效果的影響Fig.5 Effect of pH on precipitation rate of tea polyphenols

取TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比2.5∶1、沉淀溫度30 ℃、沉淀時間60 min，考察pH值對沉淀率的影響。絡(luò)合反應(yīng)的發(fā)生釋放出H+，使體系pH值下降，一般提高pH值有利于絡(luò)合。多酚與金屬離子絡(luò)合以沉淀狀態(tài)存在，沉淀的pH值隨金屬離子的不同而不同［21］。在較高pH值條件下，多酚易氧化成醌，失去酚氧基配體。由圖5表明，TP沉淀率在pH 5～6之間隨pH值升高而不斷上升；pH 6～7之間沉淀率降低。因此，pH值以6.0為宜。

2.2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

2.2.2.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果分析

為了進(jìn)一步優(yōu)化沉淀工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以TP沉淀率為響應(yīng)值，選擇TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比、沉淀時間、沉淀溫度、pH值四因素三水平，采用響應(yīng)面法優(yōu)化沉淀過程工藝參數(shù)，擬合曲線，建立數(shù)學(xué)模型，利用三維立體圖形，觀察響應(yīng)面，進(jìn)一步試驗最優(yōu)化。試驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Central composite design with experimental values for TP precipitation rate

2.2.2.2 回歸模型的擬合及方差分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計是以TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比、沉淀時間、沉淀溫度、pH值為自變質(zhì)，以TP沉淀率為響應(yīng)值。采用軟件Design-Expert 8.0.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到TP沉淀率的預(yù)測值Y與編碼值自變質(zhì)A、B、C、D的二次多項回歸方程的關(guān)系式：Y=93.34+4.73A-2.36B-2.76C+ 4.06D-2.99AB-0.64AC+5.31AD-4.02BC-0.73BD-2.39CD-5.37A2-2.69B2-4.78C2-9.06D2。由表4可以看出，回歸模型高度顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），即在研究的整個回歸區(qū)域內(nèi)模型擬合較好。R2=0.9532，說明模型的相關(guān)性很好。R2Adj=0.9005，說明模型可以解釋90.05%的試驗數(shù)據(jù)變異性。綜上所述，回歸模型與實際情況較為吻合，可用此模型對TP沉淀率進(jìn)行分析和預(yù)測。各因素對TP沉淀率影響的主次順序依次為TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比（A）＞pH值（D）＞沉淀溫度（C）＞沉淀時間（B）。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

2.2.2.3 因素間交互作用對TP沉淀率的影響

利用Design-Expert軟件繪制響應(yīng)面圖及對應(yīng)的等高線圖，用以更直觀地反映因素間交互作用對TP沉淀率的影響規(guī)律［22］。以TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比（A）與pH值（D）、沉淀溫度（C）與pH值（D）兩個交互作用為例，對TP沉淀率值影響如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對TP沉淀率的影響Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of precipitation reagent dosage， precipitation time and pH on TP precipitation rate

等高線的形狀反映了兩因素對響應(yīng)值影響的相對大小［23］。由圖6a可以看出，等高線沿TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比軸變化相對密集，說明沉淀劑用質(zhì)對TP沉淀率的影響比pH值的影響大。由圖6b可以看出，等高線沿沉淀溫度軸變化相對松散，說明沉淀溫度對TP沉淀率的影響比pH值的影響小。

對優(yōu)化后的二次回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到最大TP沉淀率對應(yīng)的各因素水平為TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比3∶1、沉淀溫度29.62 ℃、沉淀時間30 min、pH 6.28，預(yù)測TP沉淀率可達(dá)98.20%?？紤]到實際操作的可行性，將各因素水平調(diào)整為TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比3∶1、沉淀溫度30 ℃、沉淀時間30 min、pH 6.3。

2.2.2.4 回歸模型的驗證

為了檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用2.2.2.3節(jié)所述的條件進(jìn)行3次重復(fù)實驗，沉淀率的實測值為93.94%，該值落在響應(yīng)值的95%預(yù)測區(qū)間［93.7171%，102.617%］范圍內(nèi)，表明建立的模型對TP沉淀率值具有良好的預(yù)測性。

2.2.3 紅外光譜結(jié)構(gòu)表征及分析

如圖7所示，1 366～1 615 cm-1為苯環(huán)特征峰。TP在3 412.28 cm-1處為—OH特征吸收峰，與Zn2+配合后此處峰由寬峰變窄，說明Zn2+與羥基有配位作用，Zn2+吸電子作用使酚羥基上的H游離［24］。1 690.20 cm-1處為C=O吸收峰，從圖7可以看出，隨著Zn2+濃度的增大，此處峰逐漸變小直到最后消失，說明Zn2+與TP中C=O基有配位作用。1 032.71 cm-1處為芳基烷基醚C—O—C的吸收峰，隨著Zn2+濃度的增大，此峰逐漸藍(lán)移（絡(luò)合物b、c、d分別1 068.36、1 073.91、1 077.54 cm-1），這是由于與Zn2+配位使苯環(huán)π電子向環(huán)外轉(zhuǎn)移。此外，1 615.20 cm-1處苯環(huán)特征峰變?nèi)踔敝料В@可能為Zn2+吸電子作用使得此處峰變?nèi)酰?5］。紅外光譜分析表明Zn2+與TP發(fā)生了絡(luò)合，形成了絡(luò)合物。

圖7 TP及不同物質(zhì)的量比的TP-Zn絡(luò)合物的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of TP and TP-zinc complex with different molar ratios

2.2.4 高效液相色譜測定TP的含質(zhì)

圖8 茶葉原料（A）與TTPP--ZZnn絡(luò)合物（B）中TP組分的高效液相色譜圖Fig.8 HPLC profiles of tea polyphenols in tea waste （A） and tea polyphenols-zinc complex （B）

表5 兒茶素主要組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 Major catechin composition of tea waste and tea polyphenols-zinc complex %

高效液相色譜如圖8所示，茶葉原料和TP-Zn中TP的成分及含質(zhì)如表5所示。TP-Zn中咖啡堿CAF未檢出，總兒茶素含質(zhì)達(dá)到74.08%。結(jié)果表明，Zn2+絡(luò)合TP效果良好，且TP-Zn絡(luò)合物中，總兒茶素的純度很高。

2.2.5 TP-Zn中Zn含質(zhì)和多酚純度

表6 TTPP--ZZnn中ZZnn含量及多酚純度的測定結(jié)果（n==33）Table 6 Zinc and polyphenol contents in tea polyphenol-ZZnn complexes

如表6所示，通過原子吸收光譜對絡(luò)合物進(jìn)行表征，可得出當(dāng)TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比為3∶1時Zn含質(zhì)為9.30%，隨著Zn2+濃度增大，絡(luò)合物中Zn含質(zhì)測定的結(jié)果沒有顯著的增加，說明TP與Zn2+物質(zhì)的質(zhì)比在3∶1時，沉淀效果最佳，高效液相色譜測得此條件下多酚含量為90.19%。

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析，優(yōu)化TP-Zn絡(luò)合物制備的工藝參數(shù)。結(jié)果表明：影響Zn2+絡(luò)合TP的主要因素依次為沉淀劑添加質(zhì)、pH 值、沉淀溫度、沉淀時間；優(yōu)化后工藝為TP-Zn物質(zhì)的質(zhì)比3∶1、沉淀時間30 min、沉淀溫度30 ℃、pH 6.3，此工藝條件下時TP沉淀率達(dá)到93.94%。驗證實驗證明所建立的二次回歸模型在試驗范圍內(nèi)有很好的預(yù)測性，可為TP-Zn的工業(yè)化制備提供處論依據(jù)。

紅外光譜分析表明Zn離子與TP發(fā)生了配位，形成了絡(luò)合物；原子吸收光譜法測定了絡(luò)合物中Zn的含質(zhì)為9.30%；高效液相色譜法測定了多酚含質(zhì)為90.19%。達(dá)到預(yù)期效果。

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Optimization of Preparation Conditions for Tea Polyphenols-Zinc Complex by Central Composite Design

YUAN Chuanxun， LIU Xiaofang， JIN Risheng*
（Engineering Research Center of Bioprocess Ministry of Education， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China）

Tea polyphenols-zinc complex was synthesized from tea waste and ZnCl2. Bas ed on single factor experiments，central composite design （CCD） was used for the optimization of precipitation conditions to increase the precip itation rate of polyphenols-zinc complex. The structure and properties were characterized by infrared spectrometry （IR）， atomic absorption spectrometry （AAS） and high performance liquid chromatography （HPLC）. The optimal process parameters were determined as 3：1， 30 ℃， 30 min and 6.3 for TP-Zn molar ratio， precipitation temperature， time and pH， respectively. Under these conditions， the precipitation rate was 93.94%. The actual value was in the 95% prediction interval of response value， indicating that the regression equation had good predictive performance. Infrared spectral analysis showed that tea polyphenols and zinc ion formed stable TP-Zn complex. Zinc content of the complex was 9.30% determined by AAS and polyphenol content was 90.19% determined by HPLC.

tea polyphenols-zinc complex； response surface methodology； infrared spectrometry； HPLC

TS201.4

A

1002-6630（2015）16-0001-06

10.7506/spkx1002-6630-201516001

2015-01-25

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（21302037）；國內(nèi)企業(yè)委托項目（433003/12-288）

袁傳勛（1964—），男，研究員，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：18955113789@qq.com

*通信作者：金日生（1982—），男，助理研究員，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：47429307@qq.com