藤茶總多酚提取工藝優(yōu)化及生物活性初步研究

陳忠正，陳銀燁，魏超田，李曉玲，張媛媛，李斌

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642）

藤茶總多酚提取工藝優(yōu)化及生物活性初步研究

陳忠正，陳銀燁，魏超田，李曉玲，張媛媛，李斌*

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642）

以藤茶為材料，通過單因素和正交試驗，優(yōu)化了總多酚熱水提取工藝，采用DPPH法測定了其抗氧化活性，以小鼠巨噬細胞Raw 264.7為模型，測定了其抗炎活性。結果表明，藤茶總多酚的最佳提取條件為提取時間1.5 h、提取溫度100℃、料液比1∶25（g/m L），此時總多酚得率為28.61%。藤茶水提物對DPPH自由基有良好的清除效果，同時具有一定的抗炎活性，并呈現(xiàn)明顯的量效關系。

藤茶；總多酚；提取工藝；生物活性

藤茶[Ampelopsis grossedentata（Hand.Mazz）W.T. Wang]是葡萄科、蛇葡萄屬的一種野生藤本植物[1]，又名甜樹茶、甜茶藤、茅巖霉茶、山甜茶、甘露茶、白毛猴、白茶等，其幼嫩莖葉中含有豐富的多酚、黃酮類化合物、多糖、氨基酸、維生素等[2]。近代藥理研究表明，藤茶及其提取物具有抑菌、降血脂、降血壓、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、降血糖、抗炎鎮(zhèn)痛、保肝護肝以及減輕乙醇中毒等功效[3-9]。多酚是其藥理功能的一類重要成分，但是目前關于藤茶的研究主要集中在藤茶的栽培、繁育及黃酮類化合物的功能活性等方面，而對藤茶的多酚類物質(zhì)研究較少。本文主要對藤茶多酚的提取工藝進行了優(yōu)化，并測定了藤茶水提物的抗氧化和抗炎活性，旨在為藤茶資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶：廣州市售；小鼠巨噬細胞Raw 264.7，購于美國模式培養(yǎng)物儲存庫（ATCC）。

沒食子酸：天津市大茂化學試劑廠；碳酸鈉、福林酚：均為分析純；DPPH自由基：日本東京化成工業(yè)株式會社；胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素購于Life公司；脂多糖購于Sigma公司；Griess試劑盒，購于Promega公司；DMEM（無酚紅）培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺購于Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 藤茶總多酚的提取

1.2.1.1 藤茶總多酚提取單因素實驗

1）提取時間：設定提取溫度為80℃，料液比1∶30（g/m L），提取時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

2）提取溫度：設定料液比1∶30（g/mL）、提取時間1.5 h，分別于60、70、80、90、100℃提取藤茶總多酚。

3）料液比：設定提取時間1.5 h，提取溫度100℃，在1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶30（g/mL）不同料液比下提取藤茶總多酚。

1.2.1.2 藤茶總多酚提取正交試驗

采用L9（34）試驗設計進行三因素三水平正交試驗，如表1所示。

表1 藤茶總多酚提取正交唐君,劉靖,等.紫山藥的引種與標平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

1.2.2 藤茶總多酚的測定

福林酚比色法[10]。標準曲線為y=0.004 8x+0.005 8，R2=0.998 5。

1.2.3 藤茶水提物的提取

以一級水作為溶劑提取藤茶樣品，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥、氮吹干燥等制成初提取樣品。

1.2.4 藤茶樣品對DPPH自由基清除率的測定

將藤茶水提取樣品倍比稀釋為質(zhì)量濃度：100.00、50.00、…、3.13μg/mL。分別取各濃度測試液100μL和DPPH溶液100μL混合，其他處理及測定與計算參考文獻方法[8]。

1.2.5 NO抑制率測定

1）接種細胞：取小鼠巨噬細胞Raw 264.7接種于96孔板，每孔5×105細胞/m L，于37℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；

2）加樣：棄去舊培養(yǎng)液，添加100μL藤茶不同濃度提取物的新鮮培養(yǎng)液，100μL的脂多糖溶液，混勻，培養(yǎng)24 h；

3）測定：取出96孔板，取100μL培養(yǎng)液到新的96孔板，向新96孔板加入Griess試劑A液和B液，用酶標儀測定542 nm吸光值。

以上實驗均重復3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 藤茶總多酚提取工藝參數(shù)的確定

2.1.1 提取時間對藤茶總多酚提取效果的影響

本實驗固定提取溫度為80℃，料液比1∶30，分別提取不同時間，藤茶總多酚得率如圖1所示。

圖1 提取時間對藤茶總多酚得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction efficiency of total polyphenols from Ampelopsis grossedendata

由圖1可知，藤茶總多酚得率隨提取時間的延長呈上升趨勢，當提取時間達到1.5 h后，總多酚得率沒有明顯變化。多重比較結果表明，1.5 h的總多酚得率與2.0、2.5、3.0 h均無顯著差異。本著節(jié)能、省時原則，選擇1.5 h為后續(xù)提取實驗參數(shù)。

2.1.2 提取溫度對藤茶總多酚提取效果的影響

本實驗固定料液比1∶30（g/mL）、提取時間1.5 h，在不同溫度下提取藤茶總多酚，結果如圖2所示。

圖2 提取溫度對藤茶總多酚得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of total polyphenols from Ampelopsis grossedendata

由圖2可見，藤茶總多酚得率隨溫度升高而增加。在60℃～80℃之間，總多酚得率增長較快，當溫度達80℃后，總多酚得率增長變緩，當溫度為100℃時，總多酚得率達最大值。多重比較結果表明，90℃與100℃之間無顯著差異，因沸騰狀態(tài)的水易于控制溫度，故后續(xù)實驗以100℃為提取溫度。

2.1.3 料液比對藤茶總多酚提取效果的影響

本實驗固定提取時間1.5 h，提取溫度100℃，在不同料液比下提取藤茶總多酚，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，藤茶總多酚得率隨溶劑用量增加而增加。當料液比達到1∶20g/mL后，總多酚得率變化不明顯。ANOVA分析表明，1∶20（g/m L）與1∶25（g/m L）、1∶30（g/mL）和1∶35（g/mL）的總多酚得率之間均無顯著差異，故選擇茶水比1∶20（g/mL）為后續(xù)實驗提取參數(shù)。

圖3 料液比對藤茶總多酚得率的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction efficiency of total polyphenols from Ampelopsis grossedendata

2.1.4 藤茶總多酚最佳提取工藝參數(shù)的優(yōu)選

在單因素實驗基礎上，采用L9（34）正交試驗設計進行提取時間、提取溫度和料液比的正交試驗，結果如表2所示。

表2 藤茶總多酚提取正交試驗設計與結果Table2 Scheme and experimental results of orthogonal array design

表2極差分析顯示，影響藤茶總多酚提取效果的因素依次為提取溫度＞提取時間＞料液比，綜合實驗結果得出藤茶總多酚的最佳工藝組合為A2B3C2，即料液比1∶25（g/mL）、時間1.5 h、溫度100℃。在最佳工藝條件下進行3次平行實驗，藤茶總多酚得率平均值為（28.61±0.03）%，與正交試驗結果相符。

2.2 藤茶水提物生物活性研究

2.2.1 藤茶水提物對DPPH自由基的清除效果

本實驗將藤茶水提物進行DPPH自由基清除能力分析，結果如圖4所示。

圖4 藤茶總多酚對DPPH自由基的清除效果Fig.4 Scavenging capability of total polyphenols from Ampelopsis grossedendata on DPPH free radicals

藤茶水提物對DPPH自由基清除效果明顯，且呈明顯的量效關系。

2.2.2 藤茶水提取物抑制NO的活性

將藤茶水提物配成1 mg/mL的初始質(zhì)量濃度并進行倍比稀釋，測定其抑制NO活性，結果如圖5所示。

圖5 藤茶粗提物誘導抑制NO效果Fig.5 NO inhibiting activities of crude extracts from Ampelopsis grossedendata

藤茶水提物具有抗炎活性，隨著濃度升高，其抑制率上升，在濃度為1 000μg/mL時，抑制NO活性達到50%，呈現(xiàn)量效關系。

3 結論

本研究通過單因素和正交試驗得到藤茶總多酚的最佳提取工藝為：提取時間1.5 h、提取溫度100℃、料液比1∶25，在此工藝條件下，藤茶總多酚的提取率可達到28.61%。藤茶水提物具有較好的抗氧化能力，對DPPH自由基具有良好的清除效果，并表現(xiàn)出明顯的量效關系；采用小鼠巨噬細胞Raw 264.7模型體外測定表明，藤茶水提物具有一定的抗炎作用。這一研究結果，為進一步開展藤茶總多酚的開發(fā)利用及功能性飲料的開發(fā)打下了前期的研究基礎。

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Extraction of Total Polyphenols from Ampelopsis grossedentata and the Biological Activity of Water Extracts

CHEN Zhong-zheng，CHEN Yin-ye，WEI Chao-tian，LI Xiao-ling，ZHANG Yuan-yuan，LI Bin*
（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

The water extraction of total polyphenols from Ampelopsis grossedentata and the biological activity of its extracts were studied.The results showed that the optimal extraction conditions were achieved to be extraction at 100℃for 1.5 h with a 25-fole volume of water as the extraction solvent.Under the optimal extraction conditions，the yield of total polyphenols was 28.61%.The water extracts of Ampelopsis grossedentata showed high reducing power and excellent scavenging effect on DPPH free radicals in a dosedependent manner，and also showed some activity on anti-inflammatory.

Ampelopsis grossedentata；total polyphenols；extraction conditions；biological activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.006

2013-07-26

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-23)

陳忠正（1974—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品科學、食品生物技術等。

*通信作者：李斌（1960—），女，教授，博導，博士，研究方向：食品化學與營養(yǎng)。