綠茶水提物對大鼠CYP450酶活力和mRNA表達的調控作用

周子曄，金輝，王陳翔，黃愛芳，王賢親，林觀樣

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 藥學部，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 分析測試中心，浙江溫州 325035）

·論 著·

綠茶水提物對大鼠CYP450酶活力和mRNA表達的調控作用

周子曄1，金輝1，王陳翔1，黃愛芳1，王賢親2，林觀樣1

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 藥學部，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 分析測試中心，浙江溫州 325035）

目的：研究綠茶水提物對大鼠細胞色素P450（CYP450）酶活力和mRNA表達的影響。方法：SD大鼠隨機分組，連續(xù)灌胃綠茶水提物或水14 d后，同時給予探針藥非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲和咪達唑侖，采用液相色譜-質譜聯(lián)用技術（液質聯(lián)用）測定給藥后不同時間點血藥濃度，計算藥動學參數(shù)進而推測CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11和CYP3A1酶活力。此外，采用實時熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）技術測定CYP450的mRNA表達水平。結果：實驗組大鼠安非他酮與甲苯磺丁脲的藥動學參數(shù)與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），推測綠茶水提物能誘導大鼠CYP2B1酶活力和抑制CYP2C11，而非那西丁與咪達唑侖參數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，綠茶水提物能顯著上調大鼠CYP2B1 mRNA水平并下調CYP2C11 mRNA水平，對CYP1A2與CYP3A1沒有影響。結論：持續(xù)攝取綠茶會改變CYP2B1與CYP2C11酶活力和mRNA表達水平，可能會引起藥物相互作用的發(fā)生。

綠茶水提物；CYP450；酶活力；mRNA表達；大鼠

細胞色素P450（CYP450）超基因家族是人體內最重要的代謝酶系統(tǒng)，藥物相互作用通常是由于特定CYP450酶活力被其中一種合用藥物改變而引發(fā)，容易導致藥物治療失敗或者毒性反應[1]。除了化學藥物外，許多植物類提取成分也能夠對CYP450酶活力進行調節(jié)，近年來引起廣泛關注[2]?，F(xiàn)代流行病學數(shù)據表明，綠茶具有抗心血管疾病和防治癌癥的作用[3-5]，以及神經保護、抗氧化、抗高血壓等特性[6]。正是因為其在醫(yī)療保健方面的療效，近十年來綠茶消費量在世界范圍內猛增。一部分人群將飲用綠茶視為日常生活中的食物補充，甚至作為某些疾病的輔助治療，因此會出現(xiàn)與藥物合用的情況。在本研究中，我們通過探針藥物法和實時熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）法考察綠茶水提物對大鼠CYP450酶活力和基因表達的調控作用，進而推測其對藥物代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雄性SD大鼠，體質量210～240 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK（滬）-0005。

1.1.2 主要試劑：非那西丁（批號：STBB2177M9）和甲苯磺丁脲（批號：078K0725）購自美國Sigma-Aldrich公司，純度均＞98%；安非他酮（批號：100671-201001）、咪達唑侖（批號：171250-200401）和卡馬西平（批號：100142-201105）購自中國藥品生物制品檢定所；咪達唑侖注射液（批號：20100108）購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純；RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo Scientific公司；Power SYBR Green PCR Master Mix試劑購自美國Applied Biosystems公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；龍井綠茶（批號：20120905）購自杭州藝福堂茶業(yè)有限公司，綠茶稱質量后研碎按料液比9∶100加入沸水，超聲提取15 min后過濾，濾渣重復加入沸水提取2次，合并3次提取液，旋轉蒸發(fā)濃縮質量濃度為0.09 g/mL。

1.1.3 主要儀器：Agilent 1200高效液相色譜儀；Bruker Esquire HCT質譜儀；Beckman DU640核酸和蛋白分析儀；BIO-RAD MyCycler熱循環(huán)儀；Applied Biosystems 7500 RT-PCR儀。

1.2 Cocktail探針法測定綠茶水提物對大鼠CYP450酶活力的影響

1.2.1 動物給藥與取樣：12只SD大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組每日灌胃給予綠茶水提物9 mL/kg（劑量相當于60 kg成人每日飲用9 g綠茶茶湯），對照組灌胃給予等劑量水，連續(xù)灌胃14 d。于第15天分別灌胃給予非那西丁、安非他酮、咪達唑侖10 mg/kg及甲苯磺丁脲1 mg/kg，并于探針藥給藥前0 h與給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24和36 h取大鼠尾靜脈血0.3 mL置于肝素化EP管中，8 000 r/min離心10 min，分離得100 μL血漿置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血漿樣品處理：將含有卡馬西平（100 ng/ mL）的乙腈溶液200 μL加入100 μL血漿樣品中沉淀血漿蛋白，渦旋1.0 min后15 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL于自動進樣器的樣品瓶中，設定5 μL進樣檢測探針藥血藥濃度。

1.2.3 檢測條件：Zorbax SB-C18色譜柱（150 mm ×2.1 mm，3.5 μm）；流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；流動相A（0.1%甲酸），B（乙腈），梯度洗脫：0～1.0 min（10%～10% B），1.0～4.0 min（10%～80% B），4.0～7.0 min（80%～80% B），7.0～9.0 min（80%～10% B），9.0～13.0 min（10%～10% B）。ESI（電噴霧離子源），干燥氣（N2）流速7 L/min、溫度350 ℃，霧化氣（N2）壓力25 psi、電壓3 500 V。采用選擇離子監(jiān)測（SIM）模式進行定量，非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲、咪達唑侖和卡馬西平的分子離子峰[M+H]+分別為m/z 180、240、271、326和237。非那西丁、甲苯磺丁脲在50～10 000 ng/mL血藥濃度范圍，安非他酮和咪達唑侖在10～2 000 ng/mL血藥濃度范圍，制備標準曲線并進行方法學考察。

1.3 RT-PCR法測定綠茶水提物對大鼠CYP450酶mRNA表達的影響

1.3.1 動物給藥與取樣：8只SD大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組每日灌胃給予9 mL/kg綠茶水提物，對照組灌胃給予等劑量水，連續(xù)灌胃14 d。最后一次給藥后24 h處死，迅速取肝臟組織置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 總RNA提?。喊凑誖NA提取試劑盒說明書提取大鼠肝臟總RNA，于260 nm和280 nm測定吸光度，兩者比值介于1.8和2.0之間視為合格，同時根據260 nm吸光值將RNA濃度調整至1μg/μL，用cDNA反轉錄試劑盒進行反轉錄。

1.3.3 cDNA合成：取總RNA 1μg，分別加入random hexamer primer 1 μL，5×reaction buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，dNTP mix 2 μL，RebertAid M-MuLV Transcriptase 1μL和nucleasefree water 10 μL至終體積20 μL。反轉錄條件為25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，最后70 ℃ 5 min終止反應，得到的cDNA產物用于PCR反應或于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 RT-PCR法測定mRNA表達水平：取上述cDNA產物2 μL，分別加入2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，20 mmol/L上下游引物各0.5 μL，nucleasefree water 7 μL，使反應終體積為20 μL。PCR反應條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，進行40個循環(huán)。測定樣本CT值后，采用2-ΔΔCT法計算實驗組CYP450相對于對照組的基因表達倍數(shù)變化。大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11、CYP3A1和β-actin（內參）引物序列見表1。

表1 大鼠CYP450酶引物序列

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據以表示，藥動學參數(shù)由DAS 2.0計算，組間數(shù)據比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

如圖3所示，與對照組相比，實驗組大鼠CYP2B1 mRNA表達明顯上調（4.85倍），CYP2C11 mRNA表達顯著下降（為對照組的20%），而CYP1A2與CYP3A1 2組間數(shù)據比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2 結果

2.1 綠茶水提物對大鼠CYP450酶活力的影響 如圖1所示，在已建立的探針藥檢測方法學中，非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲、咪達唑侖與內標卡馬西平的保留時間分別為5.3、5.0、6.1、5.3和6.2 min，無雜質干擾。血漿中4種探針藥最低檢測限均為10 ng/mL，在線性范圍內4種探針藥日內精密度RSD均小于7%，日間精密度RSD均小于9%，相對回收率均在97%～103%，絕對回收率均大于80%。本方法具有較高專屬性，適用于同時測定大鼠血漿中4種探針藥的濃度。

運用建立的方法學對采集的血樣進行血藥濃度測定，繪制平均藥時曲線圖和計算藥動學參數(shù)，如圖2與表2所示。與對照組比較，實驗組大鼠連續(xù)給予綠茶水提物14 d后，安非他酮的Clz/F提高了53%，Vz/F增加了1.32倍，AUC（0-∞）減少了38%，Cmax降低了39%（P＜0.05），說明綠茶水提物對CYP2B1酶活力具有顯著誘導作用。同時實驗組甲苯磺丁脲的Clz/F降低了27%，AUC（0-∞）和Cmax分別為對照組的1.44倍和1.29倍（P＜0.05），說明綠茶水提物對CYP2C11酶活力具有顯著抑制作用。而非那西丁和咪達唑侖藥時曲線圖和藥動學參數(shù)均提示綠茶水提物對CYP1A2和CYP3A1酶活力無明顯影響。

2.2 綠茶水提物對大鼠CYP450 mRNA表達的影響

3 討論

人CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4和大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11、CYP3A1氨基酸序列分別具有70%、74%、77%、73%同源性[7]，因此大鼠CYP450酶活力和mRNA水平變化對于人CYP450具有積極的參考意義。CYP450酶活力評估可以通過研究對應底物的藥動學數(shù)據來獲得[8-11]。我們運用建立的cocktail探針法，通過探針藥非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲和咪達唑侖的藥動學改變來考察大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11、CYP3A1的酶活力變化。此外，RT-PCR法用于測定CYP450的mRNA表達水平。本實驗從酶活力和基因表達兩方面來推測綠茶水提物對CYP450的調控作用。

綠茶水提物在酶活力和mRNA水平對CYP2C11均具有顯著抑制作用，說明酶活力的下降可能是由于mRNA表達下調，進而降低了CYP2C11的蛋白翻譯，間接導致了酶活力的下降。人體內CYP2C9約占總CYP450含量的20%左右，負責約15%的臨床藥物的生物轉化，包括一些治療窗窄的藥物，如華法林、苯妥英鈉、格列苯脲和格列吡嗪等[12]。當持續(xù)攝取綠茶期間，如有服用以上藥物可能會使其在體內的代謝受到抑制，導致嚴重不良反應，需要密切關注。

圖1 探針藥在大鼠血漿中的液質檢測色譜圖

圖2 對照組與實驗組探針藥的平均藥時曲線圖（n=6）

表2 探針藥藥動學參數(shù)（n=6，）

表2 探針藥藥動學參數(shù)（n=6，）

注：AUC（0-∞）：曲線下面積；t1/2z：半衰期；CLz/F：清除率；Vz/F：表觀分布容積；Cmax：達峰濃度。與同探針藥對照組比：aP＜0.05

探針藥 組別 AUC（0-∞）（h·ng-1·mL-1） t1/2z（h）CLz/F（L·h/kg） Vz/F（L/kg） Cmax（ng/mL）非那西丁對照組 17 988.756±2 823.2280.846±0.3710.566±0.073 0.694±0.32610 089.742±2140.69實驗組 15 242.651±5 115.160.773±0.3390.711±0.202 0.76±0.30112 027.103±2971.627安非他酮對照組 2 007.898±673.9813.328±0.4855.396±1.57325.475±6.428 529.616±128.42實驗組 1 243.71±229.27a4.854±1.4988.245±1.356a59.065±27.504a322.224±55.465a甲苯磺丁脲對照組 88 574.076±9 018.0435.289±0.6150.011±0.001 0.086±0.007 7 404.869±511.591實驗組127 523.449±16 613.295a6.246±1.8760.008±0.001a0.071±0.018 9 531.455±1731.812a咪達唑侖對照組 2 740.648±1 158.3811.065±0.6214.232±1.758 5.485±1.442 1 526.608±677.481實驗組 2 467.634±1 152.6241.119±0.2775.067±2.916 7.419±2.518 1 390.64±324.765

圖3 對照組與實驗組大鼠CYP450 mRNA表達水平

綠茶水提物對CYP2B1酶活力和mRNA表達均具有顯著誘導作用，說明CYP2B1 mRNA表達上調間接促進了酶活力的提高。CYP2B6參與約7%臨床上常用藥物的體內代謝，如異丙酚、氯胺酮和哌替啶等麻醉藥物[13]，當具有飲茶習慣的人群給予相關藥物時可能會加速其在體內的代謝，引起藥效減弱，需引起關注。同時CYP2B6也是體內重要的毒物代謝酶，通過催化毒物使其成為非活性的代謝產物，從而起到解毒作用[14]，綠茶水提物能誘導CYP2B6酶活力從而使外源性毒物加速代謝失活，減少體內蓄積，降低毒性反應對機體的傷害，這可能是其抗癌特性的重要機制之一，有待進一步研究論證。

相對于化學藥物之間的相互作用，天然成分引起的藥物代謝改變較容易被忽視。近年來越來越多的研究表明，天然成分的生物活性也能使CYP450酶活力發(fā)生改變，進而影響特定酶的底物（藥物）在體內的代謝過程，引起相互作用。本研究探討了綠茶水提物對體內藥物代謝酶的調控作用，酶活性結果提示綠茶水提物對大鼠CYP2B1具有誘導作用，對CYP2C11具有抑制作用，而對CYP1A2與CYP3A1無影響。此外綠茶水提物對大鼠CYP450在酶活力和基因水平產生的誘導或抑制趨勢同步，說明綠茶水提物對酶活力的影響可能是通過調控mRNA表達水平來實現(xiàn)。

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（本文編輯：吳昔昔）

Modulation of green tea extract on activities and mRNA expressions of cytochrome P450 enzymes in

rats

ZHOU Ziye1, JIN Hui1, WANG Chenxiang1, HUANG Aifang1, WANG Xianqin2, LIN Guanyang1. 1.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Testing and Analysis Center, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate the potential effects of green tea extract on activities and mRNA expressions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes in rats. Methods: After treatment with tea extract or water for 14 days, treatment group rats and control group rats were given the mixture of 4 probe substrates including phenacetin, bupropion, tolbutamide and midazolam. The plasma concentrations of probes at a series of time-points were determined with liquid chromatography tandom mass spectrometry. The activities of CYP450s were evaluated according to the pharmacokinetic parameters of corresponding substrates. Real-time PCR was applied to assess the mRNA expression levels of CYP450s. Results: The pharmacokinetic parameters of bupropion and tolbutamide from treatment group showed significant differences compared with control group, which indicated that green tea extract induced CYP2B1 activity and inhibited CYP2C11 activity. And no significant difference was found in pharmacokinetic parameters of phenacetin or midazolam from treatment group and control group. In addition, treatment with green tea extract significantly up-regulated the mRNA expression of CYP2B1 and downregulated the mRNA expression of CYP2C11, whereas it had no impact on CYP1A2 and CYP3A1. Conclusion: Continuous ingestion of green tea can modulate the activities and mRNA expressions of CYP2B1 and CYP2C11, which may lead to an undesired interaction.

green tea extract; CYP450; enzyme activity; mRNA expression; rats

R969.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.008

2014-11-07

溫州市科技計劃項目（Y20110169）；溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院青年英才基金資助項目（qnyc010）。

周子曄（1981-），男，浙江溫州人，主管藥師，碩士。

林觀樣，主任藥師，Email：guanyanglinwzm@gmail. com。