慢性間歇低氧對(duì)大鼠肝細(xì)胞IRS-2、FoxO1表達(dá)的影響

李娜娜 任壽安

·論著·

慢性間歇低氧對(duì)大鼠肝細(xì)胞IRS-2、FoxO1表達(dá)的影響

李娜娜 任壽安

目的觀察慢性間歇低氧條件下,大鼠肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及胰島素受體底物-2(IRS-2)、叉頭框蛋白O1(FoxO1)的蛋白表達(dá)，并探討IRS-2、FoxO1與胰島素抵抗的相關(guān)性。方法取24只6周齡健康雄性Sprauge-Dawley大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(NC組)、慢性間歇低氧4周組(CIH4組)、慢性間歇低氧8周組(CIH8組)，每組8只。CIH4組和CIH8組暴露于間歇低氧艙內(nèi)：最低氧濃度6%～8%，持續(xù)時(shí)間8 h/d。NC組無間歇低氧暴露正常飼養(yǎng)，CIH4組、CIH8組和NC組分別于第4周、第8周及第8周禁食12 h后測定空腹血糖、空腹胰島素水平，并采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島素敏感性指數(shù)(ISI)評(píng)價(jià)胰島素抵抗，對(duì)肝組織行HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化，采用免疫組織化學(xué)方法測定肝細(xì)胞IRS-2、FoxO1蛋白表達(dá),以平均灰度值表示其蛋白表達(dá)量,二者成反比關(guān)系。結(jié)果與NC組相比，CIH4組、CIH8組空腹血糖、胰島素、HOMA-IR升高，ISI降低，且CIH8組更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.23～90.26，P均<0.05)。與NC組相比，CIH4組與CIH8組IRS-2蛋白表達(dá)降低，F(xiàn)oxO1蛋白表達(dá)增高且在核內(nèi)重新分布，CIH8組更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.46，618.94，P均<0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示：HMOA-IR與IRS-2平均灰度值呈正相關(guān)(r=0.857,P<0.05)，與FoxO1平均灰度值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.926,P<0.05)，ISI與IRS-2平均灰度值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.823,P<0.05)，與FoxO1平均灰度值呈正相關(guān)(r=0.848,P<0.05)。結(jié)論慢性間歇低氧條件下，大鼠肝細(xì)胞受損并發(fā)生胰島素抵抗，同時(shí)IRS-2和FoxO1蛋白表達(dá)異常，且隨暴露時(shí)間延長肝細(xì)胞損傷程度及胰島素抵抗程度均逐漸加重。

慢性間歇低氧；IRS-2；FoxO1；胰島素抵抗

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是一種常見的睡眠障礙性疾病,以患者睡眠中反復(fù)發(fā)生上氣道完全和(或)不完全阻塞導(dǎo)致呼吸暫停或低通氣為特征，其關(guān)鍵的病理生理機(jī)制是慢性間歇低氧(CIH)[1]。近年來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到OSAHS不僅對(duì)睡眠有影響，而且與心腦血管疾病、高血壓、2型糖尿病及由睡眠不足引起的突發(fā)事件密切相關(guān)[2]。關(guān)于OSAHS與2型糖尿病之間的聯(lián)系，國外研究顯示，OSAHS 患者中2型糖尿病的患病率超過40%，而2型糖尿病患者中OSAHS的患病率約為23%[3]。肝臟糖代謝紊亂對(duì)機(jī)體胰島素抵抗的發(fā)生具有重要意義。當(dāng)OSAHS患者處于低氧狀態(tài)時(shí)，葡萄糖有氧代謝減少，無氧酵解增加，部分丙酮酸未經(jīng)氧化還原成乳酸，進(jìn)入肝臟轉(zhuǎn)化成糖，血糖隨之升高。高血糖、高胰島素血癥、肝脂肪變、氧化應(yīng)激以及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常等都是胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制，而胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是形成胰島素抵抗的必要條件。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建CIH模型，觀察大鼠肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及胰島素信號(hào)分子胰島素受體底物(IRS)-2、叉頭框蛋白O1(FoxO1)的蛋白含量變化，探討CIH通過胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制，進(jìn)一步闡述OSAHS與2型糖尿病之間的關(guān)系，為 OSAHS合并2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料 24只6周齡健康雄性Sprauge-Dawley大鼠，體重(170±10)g，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器設(shè)備 便攜式測氧儀AX-300 (A Teledyne Technologies Company英國公司)；氮?dú)?、氧氣減壓表 (上海儀表廠)；電磁閥門JB-16(荷蘭)；血糖儀AW06336402B、血糖試紙 (美國強(qiáng)生醫(yī)療器械公司)；KB3127A大鼠胰島素ELISA試劑盒(海凱博生化試劑有限公司)；MK3型全自動(dòng)中文酶標(biāo)儀(上海雨晨生物技術(shù)有限公司)；IRS-2、FoxO1免疫組化一抗(北京博奧生物技術(shù)有限公司)；SABC二步法免疫組化試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司)；石蠟切片機(jī)、烘片機(jī)(LEICA)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組(NC組)、CIH4周組(CIH 4組)、CIH 8周組(CIH8組)，每組8只。

1.3.2 模型制備 間歇低氧艙制備：有機(jī)密封玻璃箱體積65 cm×45 cm×50 cm，艙體兩側(cè)各兩氣孔用以保持氣壓恒定，艙內(nèi)安裝測氧儀。由尼龍抗壓管將玻璃艙和外面的氮?dú)馄?、氧氣瓶及控制系統(tǒng)相連接。充氣模式如下：先充氮?dú)?5 s,艙內(nèi)氧濃度由21%降至(7±1)%持續(xù)10 s；接著充入氧氣45 s，使艙內(nèi)氧濃度逐漸恢復(fù)至21%，再持續(xù)10 s，循環(huán)一次持續(xù)110 s。模型建立方案：將CIH4組和CIH8組置于間歇低氧艙內(nèi)，自由飲水進(jìn)食，每天持續(xù)8 h，NC組呼吸正常空氣。CIH4組與CIH8組分別于4周、8周后停止間歇低氧暴露。

1.3.3 標(biāo)本取材 將NC組、CIH4組、CIH8組大鼠分別于第4周、第8周及第8周禁食12 h稱重、測血糖、腹腔麻醉、腹主動(dòng)脈采血，離心機(jī)離心10 min (3 000 r/min，r=190 mm)，取上層血清液放于-80℃冰箱備用；取肝組織浸泡于4%甲醛液48 h，石蠟包埋,免疫組織化學(xué)備用。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 空腹血糖檢測 大鼠稱重后分別取微量尾尖血滴于強(qiáng)生血糖儀配套試紙上，葡萄糖氧化酶法測血糖值，每只大鼠均測1次。

1.4.2 空腹血清胰島素檢測 采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法，將標(biāo)準(zhǔn)品、大鼠血清加入到預(yù)先包被大鼠胰島素多克隆抗體透明酶標(biāo)包被板中，37℃溫育，洗滌，加酶標(biāo)工作液，再37℃溫育，洗滌。依次加入底物A、B，加終止液后顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀450 nm波長下測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和所測大鼠胰島素的OD值，計(jì)算各組血清胰島素含量。

1.4.3 評(píng)估胰島素抵抗程度 采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=(空腹血糖×空腹胰島素)/22.5；胰島素敏感指數(shù)(ISI)=1/(空腹血糖×空腹胰島素)來評(píng)價(jià)胰島素抵抗。

1.4.4 IRS-2、FoxO1表達(dá)的檢測 采用SABC二步免疫組織化學(xué)方法：肝組織石蠟標(biāo)本切片，60℃烤箱過夜；次日脫蠟，3%H2O2封閉15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水、PBS各洗3次×5 min；高溫、高壓下枸櫞酸鈉緩沖液熱修復(fù)抗原，自然冷卻，PBS洗3次×5 min；5%BSA液封閉抗原，37℃孵育箱內(nèi)孵育30 min；加兔抗大鼠IRS-2、FoxO1一抗(濃度分別1∶100、1∶150)，4℃冰箱過液；次日室溫下復(fù)溫30 min，PBS洗3次×5 min；加山羊抗兔二抗，室溫下20 min，PBS洗3次×5 min；加SABC室溫下20 min,PBS洗3次×5 min,避光下DAB顯色，光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，自來水終止顯色反應(yīng)；蘇木素復(fù)染30 s，鹽酸酒精分化、水洗、氨水中反藍(lán)色；梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片置于顯微鏡下觀察、拍照，利用Image-Pro Plus圖像軟件進(jìn)行灰度定量分析。

1.4.5 肝細(xì)胞形態(tài)觀察 采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察各組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 血糖、胰島素及胰島素抵抗的結(jié)果 與NC組相比，CIH4組和CIH8組血糖、胰島素及HOMA-IR均升高，ISI降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，且CIH8組最為顯著(P<0.05)，見表1。

2.2 肝細(xì)胞IRS-2及FoxO1的表達(dá) IRS-2主要在肝細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，棕黃色顆粒呈散在或局灶狀分布，而匯管區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)更為明顯(圖1，封3)。圖像掃描分析顯示：與NC組相比，CIH4組和CIH8組肝細(xì)胞中IRS-2平均灰度值逐漸增加，蛋白表達(dá)水平逐漸降低，差異有顯著性(P均<0.05)；NC組FoxO1蛋白主要在肝細(xì)胞胞質(zhì)的表達(dá)呈散在分布的棕黃色顆粒，細(xì)胞核內(nèi)幾乎沒有表達(dá)，而CIH4組和CIH8組FoxO1在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，核內(nèi)呈棕黃色，圖像分析顯示：CIH4組、CIH8組FoxO1蛋白表達(dá)水平高于NC組，差異有顯著性(P均<0.05)，CIH4組與CIH8組相比，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2，圖2(封3)。

表1 各組血糖、胰島素、胰島素抵抗指標(biāo)比較

注：與NC組相比，aP<0.05；與CIH4組相比，bP<0.05；與CIH8組相比，cP<0.05；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)；ISI：胰島素敏感指數(shù)；NC組：正常對(duì)照組：CIH4組：慢性間歇低氧4周組；CIH8組：慢性間歇低氧8周組

表2 各組IRS-2、FoxO1蛋白平均灰度值比較

注：與NC組相比，aP<0.05；與CIH4組相比，bP<0.05；與CIH8組相比，cP<0.05；IRS-2：胰島素受體底物-2；FoxO1：叉頭框蛋白O1；NC組：正常對(duì)照組：CIH4組：慢性間歇低氧4周組；CIH8組：慢性間歇低氧8周組

2.4 相關(guān)性分析 HMOA-IR與IRS-2的平均灰度值呈正相關(guān)(r=0.857，P<0.05)，而與FoxO1的平均灰度值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.926，P<0.05)，ISI與IRS-2的平均灰度值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.823，P<0.05)，與FoxO1的平均灰度值呈正相關(guān)(r=0.848，P<0.05)。

3 討論

近年來OSAHS合并糖尿病已成為研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究可為臨床工作者提供進(jìn)一步的幫助。CIH是OSAHS主要的發(fā)病機(jī)制，而貫穿2型糖尿病整個(gè)發(fā)病過程中重要的病理生理機(jī)制是胰島素抵抗。其中肝臟的胰島素抵抗在2型糖尿病中起主導(dǎo)作用[4]。肝臟發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，一方面可導(dǎo)致肝糖輸出增加，引起空腹高血糖和高胰島素血癥；另一方面肝臟游離脂肪酸蓄積，游離脂肪酸作用于肝細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使胰島素抵抗程度加重。

OSAHS患者隨著病情加重，夜間缺氧再氧合的次數(shù)不斷增加，這種缺氧再氧合相當(dāng)于缺血再灌注，可以引起細(xì)胞內(nèi)活性氧簇增加，超量的活性氧簇是細(xì)胞和分子損傷的罪魁禍?zhǔn)?，從而破壞了原有抗氧化系統(tǒng)的平衡，引起氧化應(yīng)激[5]?；钚匝醮刂饕艉胸S富線粒體的肝臟，改變肝細(xì)胞膜及亞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死、凋亡[6]。另外活性氧簇和過氧化物還可以激活前炎性轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB及其所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)通路，核因子-κB依賴的炎性細(xì)胞因子出現(xiàn)過表達(dá)，氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)共同啟動(dòng)，相互刺激并加強(qiáng)，從而產(chǎn)生大量自由基和過氧化物酶體，造成肝細(xì)胞損害，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死、炎細(xì)胞浸潤等。同時(shí)破壞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，造成胰島素抵抗和代謝紊亂[7-8]。本實(shí)驗(yàn)觀察到CIH大鼠肝細(xì)胞胞膜破壞、胞質(zhì)稀疏、細(xì)胞水腫、核輕度深染及炎細(xì)胞浸潤，并隨暴露時(shí)間的延長肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞程度加重?？紤]CIH條件下，肝細(xì)胞的損傷可能與氧化應(yīng)激及全身炎性反應(yīng)相關(guān)。

胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常在胰島素抵抗過程中起關(guān)鍵作用。胰島素主要通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑調(diào)節(jié)糖代謝。該通路中任何環(huán)節(jié)受到干擾均會(huì)影響胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使葡萄糖表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)受限，最終導(dǎo)致血糖升高。IRS-2和FoxO1分別是PI3K信號(hào)通路上、下游重要的轉(zhuǎn)錄因子。目前IRS家族包括IRS-1、2、3、4，IRS-1在骨骼肌大量表達(dá)，IRS-2主要在肝臟和胰島β細(xì)胞表達(dá)，可調(diào)節(jié)肝臟胰島素活性，促進(jìn)肝糖原合成和抑制肝糖輸出。IRS-2低表達(dá)或磷酸化異?？赡苁且葝u素通過肝臟IRS-2/PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗加重的主要原因[9]。Valverde等[10]研究發(fā)現(xiàn)，敲除IRS-2基因的小鼠肝細(xì)胞PI3K活性與野生型鼠相比降低50%左右，造成下游信號(hào)分子磷酸化障礙，并且無法通過增加IRS-1蛋白含量或者提高酪氨酸磷酸化進(jìn)行代償。還有類似研究表明，一旦IRS-2的表達(dá)出現(xiàn)異常，機(jī)體將很快出現(xiàn)糖尿病樣癥狀[11]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與NC組相比，CIH4組及CIH8組肝細(xì)胞IRS-2蛋白表達(dá)明顯減少，且CIH8組更為顯著，表明CIH條件下IRS-2在肝細(xì)胞中表達(dá)受抑制。同時(shí)發(fā)現(xiàn)IRS-2的平均灰度值與HMOA-IR呈正相關(guān)、與ISI呈負(fù)相關(guān)，說明IRS-2蛋白表達(dá)量與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)，而與ISI呈正相關(guān)，CIH條件下大鼠肝細(xì)胞IRS-2蛋白表達(dá)受抑制，胰島素信號(hào)通路活化減少，從而發(fā)生胰島素抵抗，且隨暴露時(shí)間延長抵抗程度加重。

FoxO1是Forkhead基因家族O亞家族中發(fā)現(xiàn)最早的成員，廣泛表達(dá)于肝臟、 胰腺、腎臟和骨骼肌等多種組織器官。FoxO1可調(diào)節(jié)糖、脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，激活肝糖合成。其在肝臟中最主要的生物學(xué)效應(yīng)是激活磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及葡萄糖-6磷酸酶[12]。正常生理狀態(tài)下進(jìn)食后伴隨胰島素的釋放，蛋白激酶B可使FoxO1磷酸化，使其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)錄活性受到抑制，進(jìn)而抑制肝臟糖異生，降低血糖。如果FoxO1表達(dá)異常會(huì)影響正常的肝糖輸出，同時(shí)可能降低游離脂肪酸代謝酶的活性，使細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積，導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗的發(fā)生[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NC組FoxO1在胞質(zhì)中表達(dá)多，而CIH4組及CIH8組FoxO1表達(dá)部位從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，且表達(dá)量逐漸增加。相關(guān)性分析提示FoxO1的平均灰度值與HMOA-IR呈負(fù)相關(guān)、與ISI呈正相關(guān)。表明FoxO1蛋白表達(dá)量與HOMA-IR呈正相關(guān)，而與ISI呈負(fù)相關(guān)，隨CIH暴露時(shí)間延長，大鼠肝細(xì)胞FoxO1表達(dá)逐漸上調(diào)且在核內(nèi)重新分布，胰島素抵抗程度加重。有研究已證實(shí)，當(dāng)暴露于氧化應(yīng)激或高血糖環(huán)境下，F(xiàn)oxO1沒有被磷酸化，就會(huì)在核內(nèi)重新分布發(fā)揮作用[14]。而在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下FoxO1的表達(dá)及活性也會(huì)明顯增加，在各組織器官細(xì)胞核內(nèi)FoxO1的分布增多，轉(zhuǎn)錄活性激活，導(dǎo)致肝糖輸出增加，血糖升高。由此推測，F(xiàn)oxO1是氧化應(yīng)激與胰島素抵抗間一個(gè)重要的連接點(diǎn)。進(jìn)一步說明，CIH與胰島素信號(hào)通路及胰島素抵抗之間存在相關(guān)性。

綜上所述，CIH可能通過氧化應(yīng)激、全身炎性反應(yīng)等機(jī)制，破壞肝細(xì)胞，且影響胰島素信號(hào)通路相關(guān)分子，使胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，最終導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。提示胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在OSAHS并發(fā)胰島素抵抗過程中起著橋梁作用。從臨床角度出發(fā)，IRS-2和FoxO1可能成為OSAHS合并2型糖尿病治療和干預(yù)的潛在靶點(diǎn)，為臨床診治拓展思路。

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EffectsofchronicintermittenthypoxiaonIRS-2andFoxO1expressioninratheptocytes

LiNana*,RenShouan.

*ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China

ObjectiveTo observe the histomorphologic alteration and expression of insulin receptor substrate (IRS)-2 and FoxO1 in rat heptocytes, and investigate the association of IRS-2 and FoxO1 with insulin resistance induced by chronic intermitted hypoxia.MethodsTwenty-four healthy male Sprauge-Dawley rats at 6-week age were divided into normal control group (NC group), chronic intermittent hypoxia for 4 weeks group (CIH4 group) and chronic intermittent hypoxia for 8 weeks group (CIH8 group) according to random number table, with 8 rats in each group. CIH4 group and CIH8 group were placed in intermittent low oxygen cabin for 8 hours per day, the minimum oxygen concentration was 6%-8%. NC group was placed in normal air cabin. Fasting blood glucose and fasting insulin level were measured on 4th week, 8th week and after an overnight fast of 12 hours on 8th week in CIH4, CIH8 and NC group, respectively. Homeostatic model assessment of insulin resistance index (HOMA-IR) and insulin sensitive index (ISI) were used to evaluate insulin resistance. HE staining was used for morphologic study of liver. IRS-2 and FoxO1 expression in heptocytes were analyzed by immunohistochemistry. Average gray value was used to represent the protein expression, and which was inversely proportional to average gray value.ResultsCompared with NC group, CIH4 and CIH8 group had elevated fasting blood glucose, fasting insulin, HOMA-IR, and reduced ISI, especially in CIH8 group (F=50.23-90.26, allP<0.05). Compared with NC group, the expression of IRS-2 decreased in CIH4 and CIH8 group；the expression of FoxO1 increased in CIH4 and CIH8 group with the re-distribution in the nucleus, especially in CIH8 group(F=69.46,618.94, allP<0.05).Pearsoncorrelation analysis showed that HOMA-IR was positively correlated with the average gray value of IRS-2 (r=0.857,P<0.05), but was negatively correlated with the average gray value of FoxO1 (r=-0.926,P<0.05). ISI was negatively correlated with the average gray value of IRS-2(r=-0.823,P<0.05) and was positively correlated with the average gray value of FoxO1 (r=0.848,P<0.05).ConclusionsIn intermittent hypoxia, the liver is damaged along with the occurrence of insulin resistance and the abnormal expression of IRS-2 and FoxO1, which are aggravated with the exposure time of hypoxia.

Chronic intermittent hypoxia；IRS-2；FoxO1；Insulin resistance(IntJEndocrinolMetab，2015，35：1-5)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.01.001

山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013011048-4)

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)(李娜娜)；030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科(任壽安)

2014-10-10)