直乙交界處腸癌患者KRAS和BRAF基因突變138例分析

楊帆，蔡業(yè)豐，金浪平，張?bào)泸懀慕鹈?/p>

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 研究生院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江溫州 325015）

·論 著·

直乙交界處腸癌患者KRAS和BRAF基因突變138例分析

楊帆1，蔡業(yè)豐1，金浪平1，張?bào)泸?，瞿金妙2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 研究生院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江溫州 325015）

目的：檢測(cè)直乙交界處腸癌患者KRAS和BRAF基因的突變特征，分析KRAS和BRAF突變與患者臨床病理特征的相關(guān)性及其臨床意義。方法：收集138例直乙交界處腸癌患者的腫瘤組織，運(yùn)用直接測(cè)序法檢測(cè)組織標(biāo)本中KRAS基因外顯子2第12、第13位密碼子，外顯子3第61位密碼子以及BRAF基因外顯子15的突變狀態(tài)，分析該2個(gè)基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果：138例樣本中，KRAS和BRAF的突變率為34.05%（47/138）和5.07%（7/138）。KRAS基因有9種突變類型，其中包括1種全新的突變類型。BRAF基因全為V600E突變。在直乙交界處腸癌患者中，KRAS基因在男性（P=0.041）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.002）、高臨床分期（P=0.047）的患者中突變率更高，BRAF基因突變更常見(jiàn)于腫瘤多發(fā)（P=0.003）、低分化（P＜0.001）的患者中，KRAS和BRAF與年齡、腫塊大小、腫瘤病理形態(tài)、病理類型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)浸潤(rùn)等臨床病理特征均無(wú)顯著相關(guān)性。結(jié)論：直乙交界處腸癌有它的特殊性，KRAS基因在男性、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期晚期的患者中突變率更高，BRAF基因在多發(fā)、低分化的患者中突變率更高。KRAS、BRAF基因在不同部位的結(jié)直腸癌中改變情況并不一致。

直乙交界；腸腫瘤；臨床病理特征；KRAS基因；BRAF基因

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤。根據(jù)全國(guó)腫瘤登記中心的數(shù)據(jù)，2009年中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率為29.44/10萬(wàn)，病死率為14.23/10萬(wàn)，結(jié)直腸癌新發(fā)病例占全部惡性腫瘤的10.30%，死亡病例則占7.88%[1]。目前研究認(rèn)為結(jié)直腸癌是一類分子水平上高度異質(zhì)性的疾病，患者之間的遺傳背景、基因分型以及治療的敏感性等方面存在較大的個(gè)體差異。KRAS和BRAF基因是現(xiàn)在結(jié)直腸癌中研究的熱點(diǎn)，這些基因在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，并可以指導(dǎo)患者的個(gè)體化診療過(guò)程[2-4]。目前研究已經(jīng)報(bào)道不同部位的結(jié)直腸癌中KRAS、BRAF突變率存在差異[5-6]，然而還缺乏對(duì)于直乙交界處腸癌的KRAS和BRAF突變情況的研究。該處腫瘤國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，但臨床上并不少見(jiàn)。因此我們回顧性地分析了138例直乙交界處腸癌患者中KRAS、BRAF基因突變發(fā)生率、突變特征及其與臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討KRAS和BRAF基因在直乙交界處腸癌發(fā)生中的作用，研究其突變的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2000年1月至2013年12月期間于我院住院治療的結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理報(bào)告確診為結(jié)直腸癌；②結(jié)直腸癌術(shù)中及術(shù)后病理明確腫瘤位于直乙交界處；③在我院經(jīng)過(guò)完整規(guī)范化治療的結(jié)直腸癌患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在其他部位腫瘤的多原發(fā)腫瘤；②其他組織來(lái)源的腫瘤，如黑色素瘤、淋巴瘤等；③隨訪資料不完整者。詳細(xì)記錄符合標(biāo)準(zhǔn)的患者性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、大小、病理類型、病理形態(tài)、分化程度、臨床分期、Duke分期、癌結(jié)節(jié)、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理資料。所有標(biāo)本均為甲醛固定，石蠟包埋組織。腫瘤分期采用AJCC標(biāo)準(zhǔn)，所有患者的臨床病理資料見(jiàn)表1。

表1 直乙交界處腸癌患者臨床病理特征分析（n=138）

續(xù)表1

1.2 基因組DNA提取 按DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini-Kit，QIAGEN）說(shuō)明書(shū)提取石蠟標(biāo)本基因組DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增 根據(jù)KRAS、BRAF基因組DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，引物序列見(jiàn)表2，引物由浙江迪諾基因科技有限公司合成。每個(gè)反應(yīng)體系50 μL，其中包括10×PCR緩沖液5 μL，0.1 mol/L氯化鎂1.5 μL，25 mmol/L dNTP mix 2.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，10 μL rTaqDNA聚合酶，2 μL DNA模板，ddH2O 28 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)45次，最后72 ℃延伸4 min，每次反應(yīng)均設(shè)置陽(yáng)性及陰性對(duì)照，完成整個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳以鑒定PCR產(chǎn)物純度。

表2 KRAS、BRAF基因PCR擴(kuò)增與直接測(cè)序引物序列

1.4 DNA測(cè)序 送由浙江迪諾基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，所有病例均做KRAS基因第2、第3號(hào)外顯子和BRAF基因第15號(hào)外顯子突變檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)不同組別的突變率行x2值/t值檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS基因突變特征 138例直乙交界處腸癌中有47例檢出KRAS基因突變，其中KRAS基因12、13、61位密碼子突變率分別為22.46%（31/138），9.42%（13/138），1.44%（2/138），以及1例（1/138）全新的突變（見(jiàn)表3）。12密碼子共檢測(cè)到5種突變類型：GGT＞TGT（G12C），GGT＞GTT（G12V），GGT＞GAT（G12D），GGT＞GCT（G12A），GGT＞AGT（G12S）。13密碼子檢測(cè)到1種突變類型：GGC＞GAC（G13D）。61密碼子檢測(cè)到2種突變類型：CAA＞CTA（Q61L），CAA＞CAC（Q61H）（見(jiàn)圖1）。此外，我們發(fā)現(xiàn)了1例全新的突變，該突變導(dǎo)致第12密碼子第2、第3三個(gè)堿基間發(fā)生6 bp插入突變，插入堿基為AGCTGG，這種全新的突變導(dǎo)致第12和第13密碼子間插入2個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖2）。

表3 KRAS與BRAF基因突變類型

2.2 BRAF基因突變特征 138例直乙交界處腸癌中有7例BRAF基因突變，突變率為5.07%（7/138），均為V600E突變。未發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在KRAS和BRAF基因突變的患者，KRAS突變和BRAFV600E突變相互排斥。

2.3 KRAS及BRAF基因突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 KRAS基因在男性（P=0.041）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.002）、高臨床分期（P=0.047）的患者中突變率更高，與年齡、腫塊大小、腫瘤病理形態(tài)、腫瘤分化情況、病理類型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、多發(fā)、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)浸潤(rùn)等臨床病理特征均無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。BRAF基因突變更常見(jiàn)于多發(fā)（P=0.003）、低分化（P＜0.001）的患者中，而與性別、年齡、腫塊大小、病理形態(tài)、病理類型等臨床病理特征無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表4。

3 討論

圖1 KRAS、BRAF基因突變測(cè)序峰圖

圖2 全新的KRAS基因突變

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)受多基因、多步驟調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。作為表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的重要癌基因，KRAS基因在細(xì)胞的生長(zhǎng)以及血管生成中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[7-8]。2011年發(fā)布的美國(guó)《國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南（NCCN）》明確提出將KRAS基因狀態(tài)作為是否對(duì)結(jié)直腸癌患者使用抗EGFR單抗治療的標(biāo)準(zhǔn)。野生型KRAS基因需要在上游EGFR信號(hào)刺激下通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮調(diào)控作用，而突變型KRAS基因無(wú)需依賴其上游的EGFR信號(hào)刺激就可以通過(guò)自身磷酸化持續(xù)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。因此抗EGFR藥物對(duì)KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者無(wú)效[9-10]。目前報(bào)道的KRAS突變率、突變類型有一定差別。高靜等[5]報(bào)道國(guó)內(nèi)966例標(biāo)本中，結(jié)腸癌患者發(fā)生KRAS突變的頻率（為41%）高于直腸癌患者（為34.9%），并指出右半結(jié)腸癌患者發(fā)生KRAS突變與BRAF突變的頻率明顯高于左半結(jié)腸癌或直腸癌患者，同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)KRAS基因在女性中的突變率較高。而朱曉麗等[6]分析了557例標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，左半結(jié)腸癌KRAS突變率為36.3%，要低于直腸癌的42.2%，并提示KRAS突變率與女性、腫瘤部位相關(guān)。而我們測(cè)得直乙交界處腸癌的KRAS突變率為34%，可見(jiàn)現(xiàn)在報(bào)道結(jié)直腸癌在不同部位的KRAS突變率并不一致。我們?cè)谥币医唤缣幇l(fā)現(xiàn)一種全新的KRAS突變，該突變導(dǎo)致在第12和第13密碼子間插入了2個(gè)氨基酸。目前國(guó)內(nèi)鮮有此種新突變的臨床研究報(bào)道，因此我們推測(cè)這種突變是在直乙交界處腸癌所特有的。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變?cè)谀行?、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期晚期的患者中突變率更高，而與年齡、腫塊大小、腫瘤病理形態(tài)、腫瘤分化情況、病理類型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、多發(fā)、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)浸潤(rùn)等臨床病理特征無(wú)相關(guān)性，而具體機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究。鑒于在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床晚期的患者中KRAS突變率較高，在這些患者中開(kāi)展KRAS基因篩選工作，可能具有更為重要的臨床意義。

有研究報(bào)道部分KRAS基因野生型患者對(duì)抗EGFR單抗治療無(wú)效，而B(niǎo)RAF基因突變是導(dǎo)致這一部分結(jié)直腸癌患者產(chǎn)生耐藥反應(yīng)的原因[11-13]?，F(xiàn)在各家報(bào)道BRAF基因在結(jié)直腸癌患者中突變率較低，沈胤晨等[14]檢測(cè)了676例結(jié)直腸癌患者中，直腸癌的BRAFV600E突變率為1．03%，乙狀結(jié)腸癌的突變率為1.87%，而直乙交界處的突變率為0，并指出腫瘤分化程度越低，BRAF突變率越高。而曹祥龍等[15]報(bào)告BRAFV600E突變率為5.7%，更常見(jiàn)于老年（＞65歲）、（脾區(qū)）近端結(jié)腸、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。我們測(cè)得直乙交界處腸癌的BRAF突變率為5.07%，并且BRAF基因突變的患者多伴有多發(fā)病灶，且原發(fā)病灶呈低分化，而與性別、年齡、腫塊大小、病理形態(tài)、分化情況、病理類型、浸潤(rùn)深度、臨床分期等臨床病理特征無(wú)相關(guān)性。隨著腫瘤分化程度的降低，腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的潛能上升，因此對(duì)于BRAF突變的患者，臨床上應(yīng)該更加關(guān)注其是否存在病灶轉(zhuǎn)移和多發(fā)的情況。BRAF基因有望成為預(yù)測(cè)抗EGFR單抗治療新的療效指標(biāo)。

表4 KRAF和BRAF基因突變與直乙交界處腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性[n（%），]

表4 KRAF和BRAF基因突變與直乙交界處腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性[n（%），]

臨床病理資料例數(shù)KRAS基因BRAF基因野生型突變型x2/tP野生型突變型x2/tP性別 4.1650.04101男9356（60）37（40） 88（95）5（5）女4535（77）10（23）43（96）2（4）年齡（歲）13863.150±10.14065.702±10.518 1.3810.17063.67±10.2870.571±9.034 1.7380.084腫塊大?。╟m）1384.401±1.7034.353±1.260-0.1870.8524.397±1.5514.142±1.864-0.4190.676腫瘤病理形態(tài) 0.3090.643 0.6420.351潰瘍型11474（65）40（35）109（96）5（4）隆起型2417（70） 7（30）22（92）2（8）腫瘤分化情況 1.0280.58533.143＜0.001低分化5 4（80） 1（20）2（40） 3（60）中分化10671（67）35（33）102（96）4（4）高分化2716（59）11（41）27（100）0（0）病理類型 2.2190.373 3.3970.267管狀腺癌4530（66）15（34）43（96）2（4）腺癌8957（64）32（36）85（96）4（4）黏液腺癌4 4（100）0（0）3（75） 1（25）浸潤(rùn)深度 0.4710.656 0.0001.000 T1-T22820（71） 8（29）27（96）1（4）T3-T411071（65）39（35）104（95）6（5）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 0.9220.362 0.0431.000有5433（61）21（39）51（94）3（6）無(wú)8458（69）26（31）80（95）4（5）N分期 2.1720.350 1.0730.616 NO8458（69）26（31）80（95）4（5）N13825（66）13（34）35（92）3（8）N216 8（50） 8（50）16（100）0（0）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 9.9710.002 1.1790.593無(wú)11884（71）34（29）113（96）5（4）有20 7（35）13（65）18（90） 2（10）Dukes分期 2.8000.104 0.0001.000 A-B8158（72）23（28）77（95）4（5）C-D5733（58）24（42）54（97）3（3）臨床分期 7.9000.047 1.4530.722 I 2318（78） 5（22）21（95）1（5）II 5839（67）19（33）56（95）3（5）III 3726（70）11（30）36（97）1（3）IV20 8（40）12（60）18（90） 2（10）多發(fā) 0.0431.000 8.8250.003是2818（64）10（36）23（82） 5（18）否11073（66）37（34）108（98）2（2）

續(xù)表4

直腸乙狀結(jié)腸交界處位于第3骶椎前方，該處乙狀結(jié)腸以近90°與直腸相連接，是整個(gè)結(jié)腸最狹窄的部位[16]。雖然此處的腸癌國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，但臨床上并不少見(jiàn)。國(guó)內(nèi)幾項(xiàng)大樣本的研究報(bào)告直乙交界處結(jié)腸癌發(fā)生率占全部結(jié)直腸癌的2.2%～3.4%[17-18]。在回顧性收集2000年至2013年于我院行結(jié)直腸癌手術(shù)的3 280例患者中，我們發(fā)現(xiàn)了138例直乙交界處腸癌的患者，約占全部結(jié)直腸癌的4.2%，與之前報(bào)道基本一致?，F(xiàn)在對(duì)于直乙交界處腸癌應(yīng)該歸屬為結(jié)腸癌還是直腸癌，學(xué)界還存在爭(zhēng)議[19]。直乙交界處腸癌發(fā)生于乙狀結(jié)腸處的螺旋形黏膜上，從解剖上看屬于結(jié)腸。但在腹膜折返處直乙交界處和直腸共用一套血管系統(tǒng)，因此也有學(xué)者認(rèn)為該處腫瘤應(yīng)該歸屬于直腸腫瘤。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道直乙交界處腸癌的X線檢查極易漏診、誤診。而內(nèi)鏡則把乙狀結(jié)腸的螺旋形黏膜皺折作為分界線，其下方黏膜緊貼腸壁為直腸，其上方為乙狀結(jié)腸。因其位置距肛門(mén)約15 cm以上，指診多不能觸及[20]。直乙交界處腸癌臨床表現(xiàn)多無(wú)特異性，早期多表現(xiàn)為排便習(xí)慣與糞便性狀改變?yōu)橹鳌Ｍ砥诳沙霈F(xiàn)腸梗阻癥狀以及貧血、乏力、消瘦等全身癥狀。因此，該處的腫瘤早期診斷率較低。直乙交界處腸癌相對(duì)結(jié)、直腸腫瘤而言，發(fā)生腸梗阻的概率更高、手術(shù)切除率較低，因而直乙交界處腸癌具有它的特殊性。目前鮮有關(guān)于此處的腸癌與直腸癌、結(jié)腸癌預(yù)后及生存率有無(wú)差異的報(bào)道。

綜上所述，本研究檢測(cè)了138例直乙交界處腸癌患者中KRAS與BRAF基因突變狀態(tài)，突變率分別為34.05%與5.07%，并發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變與性別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，而B(niǎo)RAF基因突變?cè)诙喟l(fā)、低分化的患者中更常見(jiàn)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)了一種全新的KRAS基因突變類型?，F(xiàn)在各家報(bào)道的KRAS、BRAF基因狀態(tài)在不同部位的結(jié)直腸癌中改變情況并不一致。本研究針對(duì)直乙交界處的腸癌進(jìn)行KRAS和BRAF基因的突變情況進(jìn)行分析，而KRAS和BRAF基因在直乙交界處腸癌發(fā)生中的作用和機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：胡苗苗）

Clinicopathological characteristics of KRAS and BRAF mutation in 138 patients with rectosigmoid can-cer

YANG Fan1, CAI Yefeng1, JIN Langping1, ZHANG Xiaohua2, QU Jinmiao2. 1.Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Surgical Oncology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To identify the mutation rate and mutation feature of KRAS and BRAF gene in patients with rectosigmoid carcinoma, to analyse the association between KRAS/BRAF mutations and patients’clinicopathological characteristics, and discuss the clinical signifcance of KRAS/BRAF mutations. Methods: 138 patients with rectosigmoid carcinoma were collected. DNA sequencing was used to detect mutations in KRAS (codons12, 13 of exon2 and codons 61 of exon3) and BRAF (exon15). Statistically analyzing the relationships between gene mutations and clinicopathological characteristic. Results: In 138 cases, the mutation rate of KRAS and BRAF was 34.05% (47/138) and 5.07% (7/138). 9 mutation types were found in KRAS, including a new mutation type. BRAF mutation was all belong to V600E mutation. In patients with rectosigmoid carcinoma, KRAS mutation rate was higher in male (P=0.041), distant metastasis (P=0.002) and high clinical stages (P=0.047). BRAF mutation rate was higher in multiple (P=0.003) and poorly differentiate (P=0.001) carcinoma. No signifcant associations were observed between KRAS/BRAF mutations and age, tumor size, pathomorphism, pathological type, depth of invasion, lymph node metastasis, vessel infltration and nervous infltration (P＞0.05). Conclusion: Rectosigmoid carcinoma is unique. KRAS mutation rate is higher in male, distant metastasis and high clinical stages carcinoma. BRAF mutation rate is higher in multiple and poorly differentiate carcinoma. KRAS and BRAF mutations are variant in different location of colorectal cancer.

rectosigmoid; intestinal neoplasms; clinicopathological characteristic; KRAS gene; BRAF gene

R735.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.09.005

2014-12-22

溫州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（Y20140132）。

楊帆（1991-），男，浙江溫州人，碩士生。

瞿金妙，副主任醫(yī)師，Email：Oncologist_qjm@sina. com。