奶牛bTAP蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及其在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

張小靈，葛俊偉，李玉龍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，哈爾濱 150069）

奶牛bTAP蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及其在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

張小靈1，2，葛俊偉1，李玉龍2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，哈爾濱 150069）

奶牛氣管抗菌肽是一種具有較強(qiáng)抗菌活性的抗菌小肽。實(shí)驗(yàn)從奶牛氣管組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，用奶牛氣管抗菌肽特異性PCR引物擴(kuò)增奶牛氣管抗菌肽基因，然后將其連入載體pCMV-C-eGFP中構(gòu)建奶牛氣管抗菌肽的真核表達(dá)載體bTAP-GFP，并將此載體轉(zhuǎn)染進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，分別運(yùn)用熒光蛋白觀察和細(xì)菌記數(shù)等方法檢測bTAP-GFP蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)大腸桿菌的抗菌活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)成功的建立了奶牛氣管抗菌肽的真核表達(dá)載體bTAP-GFP，并且此重組載體能在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中正常表達(dá)具有抗大腸桿菌活性的bTAP-GFP蛋白。

奶牛氣管抗菌肽；真核表達(dá)載體；奶牛乳腺上皮細(xì)胞；基因表達(dá)

牛氣管抗菌肽(bTAP)是一種從牛氣管黏液的酸性抽提物中分離到的陽離子型抗微生物多肽。bTAP有很廣泛的抗菌譜，它對(duì)對(duì)革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、真菌等具有明顯殺傷作用，而對(duì)哺乳動(dòng)物沒有不良影響。雖然bTAP有很好的抗菌活性，然而人們對(duì)它的開發(fā)與利用卻很少。Yarus等最先在小鼠乳腺中表達(dá)bTAP，為bTAP作用機(jī)制研究和基因工程產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。近些年，bTAP在原核表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)等的表達(dá)也偶見報(bào)道。

本試驗(yàn)構(gòu)建了bTAP的真核表達(dá)載體bTAP-GFP，并將此載體轉(zhuǎn)染進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，成功的表達(dá)了具有抗大腸桿菌活性的bTAP-GFP蛋白。本試驗(yàn)為bTAP的基因工程產(chǎn)品的開發(fā)及其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

奶牛乳腺上皮細(xì)胞、大腸桿菌（Escherichia coli）菌株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心高學(xué)軍教授贈(zèng)送，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、Trizol試劑、脂質(zhì)體2000購于GIBCO公司，構(gòu)建表達(dá)載體的相關(guān)試劑購于寶生物試劑公司，真核表達(dá)載體pCMV-C-eGFP購于碧云天，PCR引物合成及產(chǎn)物測序在英俊公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 bTAP真核表達(dá)載體的構(gòu)建Trizol法提取奶牛氣管組織中總RNA,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板，用bTAP特異性引物（上游引物：5-CGGAATTCATGAGGCTCCATCACCTGCT-3，下劃線標(biāo)記的為EcoR I酶切位點(diǎn)；下游引物：5-GCGTCGAC CTTCTTTCTACAGCATTTTACT-3，下劃線標(biāo)記的為Sal I酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物連T載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑陽性克隆測序。測序正確的序列雙酶切，連表達(dá)載體pCMV-C-eGFP，雙酶切鑒定，陽性克隆即為構(gòu)建的bTAP真核表達(dá)載體，標(biāo)記為bTAP-GFP。將陽性克隆菌種搖菌，提質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法見文獻(xiàn)。試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（B）、轉(zhuǎn)空載體組（GFP）和轉(zhuǎn)bTAP-GFP組（bTAP-GFP）。

1.2.3 bTAP的表達(dá)及其抗菌活性的檢測bTAP表達(dá)的檢測：細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)液，10倍濃縮，熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白bTAP-GFP的表達(dá)。

bTAP抗菌活性的檢測：大腸桿菌（Escherichia coli）用液態(tài)LB培養(yǎng)基37℃搖床培養(yǎng)至細(xì)菌數(shù)約為105CFU/mL培養(yǎng)液。取100μL細(xì)胞培養(yǎng)液（收集過程同前文所述）加入1mL大腸桿菌菌液中，37℃搖床孵育1h，然后計(jì)算各組菌液中的細(xì)菌數(shù)。試驗(yàn)分組同上。

2 結(jié)果

2.1 bTAP真核表達(dá)載體的構(gòu)建

如圖1所示，用bTAP特異性引物進(jìn)行PCR后，可見明顯的目的條帶(～200bp)（圖1A）；將PCR擴(kuò)增得到的bTAP基因克隆進(jìn)pCMV-C-eGFP載體，構(gòu)建的bTAP-GFP表達(dá)載體用EcoR I和Sal I雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，一條為表達(dá)載體（5010bp），一條為bTAP基因（～200bp）（圖1B），且陽性克隆經(jīng)英俊公司測序，結(jié)果與NCBI中bTAP mRNA（NM_174776. 1）序列完全一致。結(jié)果表明，本試驗(yàn)成功的構(gòu)建了bTAP的真核表達(dá)載體bTAP-GFP。

圖1：bTAP真核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.2bTAP-GFP表達(dá)的檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染bTAP-GFP 48h后，熒光顯微鏡檢測培養(yǎng)液中綠色熒光的表達(dá)。結(jié)果如圖2，轉(zhuǎn)染bTAP-GFP的細(xì)胞的培養(yǎng)液中可見綠色熒光，而沒轉(zhuǎn)染的空白細(xì)胞的培養(yǎng)液中無綠色熒光。結(jié)果表明，表達(dá)載體bTAP-GFP轉(zhuǎn)染進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，并成功的表達(dá)了。

圖2：bTAP-GFP表達(dá)的檢測

2.3 bTAP抗菌活性的檢測

將1mL大腸桿菌菌液與100μL細(xì)胞培養(yǎng)液混合，37℃搖床孵育1h后，計(jì)算各組菌液中的細(xì)菌數(shù)，檢測bTAP的抗菌效果。結(jié)果如圖3所示，在B組和GFP組中，菌液中細(xì)菌數(shù)明顯大于105CFU/mL，而在bTAP-GFP組中，菌液中細(xì)菌數(shù)明顯小于105CFU/mL，且顯著低于B組和GFP組。此結(jié)果表明，重組表達(dá)的bTAP-GFP蛋白對(duì)大腸桿菌有顯著抑制效果。

圖3：bTAP抗菌活性的檢測

3 討論

bTAP有廣泛的抗菌活性，尤其對(duì)引起細(xì)菌性奶牛乳房炎的主要致病菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有很好的抗菌活性。bTAP基因是一個(gè)利用基因技術(shù)治療奶牛乳房炎的的候選目標(biāo)基因。但因bTAP的分子量太小，故一般情況下不易檢測與純化，所以目前對(duì)bTAP在治療奶牛乳房炎方面的研究還很少。本試驗(yàn)將擴(kuò)增出的bTAP序列克隆進(jìn)pCMV-C-eGFP中，使之能表達(dá)bTAP-GFP融合蛋白。GFP為綠色熒光蛋白，在熒光顯微鏡下具有示蹤的效果，使得融合的bTAP-GFP蛋白能在熒光顯微鏡下直接觀察到，且GFP蛋白本身分子量為27kDa，與bTAP融合表達(dá)后也避免了bTAP蛋白分子量過小不利于純化的問題，所以本試驗(yàn)所表達(dá)的bTAP-GFP蛋白既有很好的直觀可視性有利于分離純化。

在自然條件下，bTAP在奶牛中的表達(dá)以呼吸系統(tǒng)，尤其是氣管中表達(dá)量高。但也有研究表明，在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等菌的誘導(dǎo)下，牛乳腺上皮細(xì)胞中TAP的表達(dá)水平明顯提高，即牛TAP基因在多個(gè)器官和組織中均可表達(dá)，且其表達(dá)量與病原微生物的誘導(dǎo)有一定的關(guān)系。本試驗(yàn)將構(gòu)建好的bTAP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，并成功的表達(dá)了對(duì)大腸桿菌具有顯著的抗菌活性的重組bTAP-GFP蛋白，其結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

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