固態(tài)發(fā)酵食醋生產(chǎn)過程中主要微生物及風(fēng)味生成的探討

蘇迎會(huì)

（河北保定槐茂有限公司，河北保定071011）

固態(tài)發(fā)酵食醋生產(chǎn)過程中主要微生物及風(fēng)味生成的探討

蘇迎會(huì)

（河北保定槐茂有限公司，河北保定071011）

實(shí)驗(yàn)研究了不同時(shí)間、不同醋醅層次的微生物分布和數(shù)量變化規(guī)律，探索影響風(fēng)味形成的因素。結(jié)果表明，發(fā)酵前5 d，酵母菌和乳酸菌迅速增殖，第5天酵母菌數(shù)達(dá)到最高3.4×107CFU/g，乳酸菌最高為3.2×107CFU/g，以乳酸為主的不揮發(fā)酸同時(shí)也生成較快；醋酸菌前3 d增長迅速，之后緩慢增長并以生成揮發(fā)性的醋酸為主，第11天醋酸菌數(shù)量達(dá)到峰值為4.0×107CFU/g，13 d以后逐漸消亡。醋酸發(fā)酵初期，pH值迅速下降，不揮發(fā)酸迅速增加，不揮發(fā)酸占總酸的比值最大在第7天，為87.22%；總酸在發(fā)酵中期的7～13 d增幅最大。乳酸菌的消長影響著不揮發(fā)酸的生成，醋酸菌的消長影響著總酸的生成，醋酸發(fā)酵過程中控制合適的發(fā)酵條件，使兩者的相互協(xié)調(diào)生長，有利于產(chǎn)品口感風(fēng)味的調(diào)和。

釀造食醋；酵母菌；醋酸菌；乳酸菌；風(fēng)味

釀造食醋是指單獨(dú)或混合使用各種含有淀粉、糖的物料或酒精，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成的液體調(diào)味品[1]。食醋作為酸性調(diào)味品，其中的主要成分是酸性物質(zhì)，通常稱為總酸，食醋中的酸類成分又以醋酸為主，其他的不揮發(fā)有機(jī)酸類物質(zhì)以乳酸為主，還有少量的琥珀酸、酒石酸、葡萄糖酸、檸檬酸等。除有機(jī)酸類外，食醋中還含有糖類、氨基酸類以及少量和微量的醇類、醛類、酚類、酮類[2]。這些物質(zhì)共同存在于食醋中，各成分之間相互作用，共同構(gòu)成了食醋的風(fēng)味和口感，使其酸味柔和、鮮美、醇厚。

在固態(tài)發(fā)酵食醋生產(chǎn)工藝中，其影響風(fēng)味及口感的因素很多，如釀造工藝、原料的選擇、原料配比以及淀粉含量、醋醅水分含量、參與發(fā)酵的微生物種類及酶系、發(fā)酵階段生化反應(yīng)控制條件、發(fā)酵過程醋醅溶氧或厭氧條件、發(fā)酵溫度以及生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生條件等。

食醋釀造是多種微生物共同作用的過程，主要微生物為霉菌、酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[3]。食醋發(fā)酵過程分為淀粉糖化、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵3個(gè)階段，期間有不同種類的微生物生長繁殖并產(chǎn)生各種酶類，對(duì)食醋原料進(jìn)行分解利用，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物化學(xué)變化最終形成食醋。本試驗(yàn)對(duì)固態(tài)發(fā)酵過程中微生物的生長變化規(guī)律進(jìn)行研究，同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵過程中醪液的pH值、總酸及不揮發(fā)酸，探索各指標(biāo)與風(fēng)味形成的關(guān)系，對(duì)固態(tài)發(fā)酵食醋工藝條件及生產(chǎn)控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碎米、麩皮、稻殼、食鹽：市售；耐高溫α-淀粉酶（酶活力20 000 U/m L）、糖化酶（酶活力100 000 U/m L）：棗莊市杰諾生物酶有限公司；活性干酵母：廣東丹保利酵母有限公司。

酵母菌培養(yǎng)基采用孟加拉紅培養(yǎng)基[4]：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀1 g、無水硫酸鎂0.5 g、瓊脂20 g、孟加拉紅0.033 g、氯霉素0.1 g、蒸餾水1 000 m L。

乳酸菌培養(yǎng)基采用MRS培養(yǎng)基[5]：蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1 m L、K2HPO4·7H2O 2 g、三水醋酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、瓊脂粉15 g、水1 000 m L、pH 6.2。

醋酸菌培養(yǎng)基[6]：1%酵母膏、1%葡萄糖、2.5%瓊脂、滅菌后加入1%無菌CaCO3、4%無水乙醇。

蛋白胨：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；酵母粉、瓊脂、CaCO3：北京化學(xué)試劑公司。

葡萄糖（分析純）、無水乙醇（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀（分析純）：北京紅星化工廠；無水硫酸鎂（分析純）：天津市化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

醋酸發(fā)酵池（13 m×1.5 m×1.5 m）：河北保定槐茂有限公司自制；PB-20酸度計(jì)：北京賽多利斯有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 采樣方法

酒精發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)入醋酸發(fā)酵階段，每天翻醅。每隔3 d取樣一次，檢測(cè)醋酸發(fā)酵階段食醋中各理化指標(biāo)（pH值[7]、總酸[8]及不揮發(fā)酸[1]）的變化情況。

酒精發(fā)酵結(jié)束后，酒醪與輔料混合入池，采用自然界中的醋酸菌，每天進(jìn)行翻醅。每隔2 d取樣一次，分別取上、中、下層的醋醅，采用無菌操作，各取樣200 g，分別在酵母菌培養(yǎng)基、乳酸菌培養(yǎng)基、醋酸菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)酵母菌、乳酸菌、醋酸菌，培養(yǎng)后分別計(jì)數(shù)，檢測(cè)醋酸發(fā)酵階段醋醅中微生物的變化情況。

醋酸發(fā)酵21 d時(shí)，根據(jù)工藝的需要，采取加鹽處理，主要是防止過氧化的現(xiàn)象產(chǎn)生。加鹽抑制各種菌的生長，故不再進(jìn)行檢測(cè)。但是各種菌的酶系依然存在于醋醅中，其理化指標(biāo)會(huì)產(chǎn)生小幅的變化，故將理化指標(biāo)檢測(cè)到醋酸發(fā)酵結(jié)束，即27 d時(shí)。

1.3.2 測(cè)定方法

總酸測(cè)定采用GB/T 12456—2008《食品中總酸測(cè)定》中的方法；pH值測(cè)定采用酸度計(jì)法；不揮發(fā)酸的測(cè)定采用GB 18187—2000《釀造食醋》中的方法。

微生物計(jì)數(shù)采用稀釋平板法。酵母菌于28℃培養(yǎng)5 d后計(jì)數(shù)，乳酸菌36℃厭氧培養(yǎng)（48±2）h后計(jì)數(shù)，醋酸菌30℃培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸發(fā)酵階段微生物的變化情況

不同發(fā)酵時(shí)間不同層次上醋醅中主要微生物的數(shù)量見表1。

2.1.1 醋酸發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量變化趨勢(shì)

醋醅各層次酵母菌隨發(fā)酵時(shí)間的變化如圖1所示。由圖1可以看出，在整個(gè)發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量呈現(xiàn)先快速升高后緩慢降低的趨勢(shì)且在不同層次上隨著深度增加而減少。上層酵母菌增長速度快并且數(shù)量高于中層和下層菌。發(fā)酵前期醋醅溫度較低，在26～29℃，淀粉糖化階段提供較高的糖源，有利于酵母菌自身繁殖，第5天上層酵母菌數(shù)達(dá)到最高3.4×107CFU/g，由于溶解氧的存在，上層菌增殖速度要高于中層及下層菌。隨著醋醅中氧氣的耗盡，厭氧環(huán)境下酵母菌基本停止繁殖而主要進(jìn)行酒精發(fā)酵作用，酒精逐漸增多，產(chǎn)生大量CO2使醋醅溫度升高，同時(shí)醋酸菌利用酒精進(jìn)行醋酸發(fā)酵，酒精的增多以及酸的產(chǎn)生不適宜酵母的生長繁殖，因此在第7天以后隨發(fā)酵時(shí)間延長，酵母菌的數(shù)量呈減低趨勢(shì)。

2.1.2 醋酸發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量變化趨勢(shì)

醋醅各層次乳酸菌隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況如圖2所示。由圖2可知，在發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量總體呈現(xiàn)先升高后減少的趨勢(shì)。中層乳酸菌數(shù)量在第5天最先達(dá)到峰值為3.2×107CFU/g，上層菌第11天達(dá)到最多為6.0×106CFU/g，下層菌第11天數(shù)量最多為1.8×107CFU/g。乳酸菌與醋酸菌同屬細(xì)菌，微耗氧到厭氧，主要發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸，少量產(chǎn)生乙酸，醋醅發(fā)酵前期1～5 d主要為酒化階段，厭氧條件下乳酸菌生長繁殖并產(chǎn)生大量乳酸，醋酸菌也產(chǎn)生少量醋酸，中層菌在較低含量氧氣環(huán)境下最先達(dá)到峰值。通過每天翻醅，隨后上層和中層乳酸菌產(chǎn)酸速率開始減慢，醋酸菌產(chǎn)酸速率提高，而醋醅底層的乳酸菌通過厭氧發(fā)酵繼續(xù)產(chǎn)生一定量的乳酸。隨著醋醅營養(yǎng)物質(zhì)的減少，乙酸持續(xù)生成，醋醅pH下降，最終使乳酸菌數(shù)量下降。

圖2 乳酸菌數(shù)量變化曲線Fig.2 Changing curve of lactic acid bacteria count

醋酸發(fā)酵初期醋醅處于弱酸性，醅料中溶氧量較少，適合乳酸菌的生長繁殖，乳酸菌利用較簡(jiǎn)單的碳水化合物糖類生成乳酸，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，醋醅下層的無氧條件為乳酸菌提供了生長的場(chǎng)所。

2.1.3 醋酸發(fā)酵過程中醋酸菌數(shù)量變化趨勢(shì)

醋醅各層次醋酸菌隨發(fā)酵時(shí)間的變化如圖3所示。由圖3可以看出，在發(fā)酵過程中醋酸菌的變化趨勢(shì)為是先上升后下降，中間水平階段持續(xù)時(shí)間較長。第11天上層醋酸菌數(shù)量達(dá)到峰值為4.0×107CFU/g，中層和下層菌數(shù)量略低于上層。發(fā)酵前期醋醅中含有豐富的糖源，隨著酵母菌發(fā)酵作用的進(jìn)行，空氣中醋酸菌逐漸進(jìn)入醋醅中并開始生長繁殖。醋酸菌產(chǎn)酸是耗氧的，在經(jīng)過短暫增殖過程后，醋酸菌進(jìn)入發(fā)酵產(chǎn)酸階段，醋酸菌數(shù)量不再繼續(xù)增長。醋醅中微生物的活動(dòng)不是單獨(dú)進(jìn)行的，酵母菌利用糖類產(chǎn)酒精的同時(shí)，醋酸菌在適宜的條件下氧化酒精最終生成乙酸，隨著酒精含量的減少，醋酸濃度升高、醋醅pH值降低，這些條件都會(huì)抑制醋酸菌的生長。酸度不再上升即酒精氧化將完時(shí)，加入食鹽并壓實(shí)醋醅能抑制醋酸菌繁殖與發(fā)酵，防止醋酸分解，即進(jìn)入后熟期。

圖3 醋酸菌數(shù)量變化曲線Fig.3 Changing curve of acetic bacteria count

醋醅不同層次上醋酸菌數(shù)量無太大變化，下層略低，翻醅一方面是為了使整個(gè)醋醅微生物分配均勻，另一方面防止由于多種微生物共同作用導(dǎo)致中上層局部溫度過高而造成燒醅。耐酸耐酒精等優(yōu)勢(shì)醋酸菌利用醋醅中充足的營養(yǎng)條件進(jìn)入發(fā)酵環(huán)境并開始作用，發(fā)酵后期下層酸度高因此增加了醋酸菌的消亡速度。

2.2 醋酸發(fā)酵階段各理化指標(biāo)的變化情況

醋酸發(fā)酵階段，食醋中pH值、總酸及不揮發(fā)酸的變化情況，其結(jié)果見表2。

由表2可知，醋酸發(fā)酵前期（1～7 d），pH值迅速降低，pH值從4.55降至3.94。總酸和不揮發(fā)酸都迅速增加，不揮發(fā)酸占總酸的比值第7天達(dá)到最大，為87.22%，也就是以乳酸為主的不揮發(fā)酸的增加幅度更大。隨著發(fā)酵天數(shù)的延長，總酸不斷的增加，在發(fā)酵最旺盛的7～13 d增幅最大，由3.13%增加至5.37%，平均每天增加0.37%，而pH值和不揮發(fā)酸在此階段卻變化不大。發(fā)酵前期，乳酸菌利用較簡(jiǎn)單的碳水化合物糖類生成乳酸，使不揮發(fā)酸迅速增加。酵母菌將糖類轉(zhuǎn)成酒精，底物減少，不揮發(fā)酸增長減少。同時(shí)，醋酸菌利用酒精生成醋酸加快，總酸在7～13 d時(shí)迅速增加。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，醋液中各種物質(zhì)（酸類、含氮物質(zhì)、糖類、醇類、醛類以及微量的離子物質(zhì)等微量元素）成分含量及種類越來越多，這些物質(zhì)的存在構(gòu)成了醋液的緩沖體系，醋液中的有效成分越多，其緩沖范圍越大，pH值變化就不明顯了。同時(shí)pH值越低，食醋的風(fēng)味口感越有刺激性，反而則食醋的風(fēng)味口感就越加柔和醇厚。不揮發(fā)酸是大分子的有機(jī)酸，其口味無刺激性，在總酸中占30%時(shí)，產(chǎn)品口感柔和、醋香濃郁，若比值偏小，則醋酸刺激味強(qiáng)，若比值偏大，則醋香氣不濃郁。

表2 醋酸發(fā)酵階段pH值、總酸及不揮發(fā)酸的變化Table 2 pH value,total acid and non-volatile acid changes during acetic acid fermentation

3 結(jié)論

固態(tài)發(fā)酵作為傳統(tǒng)食醋發(fā)酵工藝，是多種微生物共同作用、生化反應(yīng)復(fù)雜的工藝過程。酵母菌、乳酸菌和醋酸菌整體呈現(xiàn)先增長后逐漸消亡的趨勢(shì)。酵母菌前期快速增長，第5天達(dá)到最高3.4×107CFU/g，酵母菌主要作用為在缺氧的條件下分解糖類物質(zhì)產(chǎn)生酒精，所以此階段應(yīng)將料溫控制在30℃左右；乳酸菌在第5天時(shí)達(dá)到最高數(shù)量為3.2×107CFU/g，作用緩慢持續(xù)時(shí)間較長，以產(chǎn)乳酸為主，乳酸和醋液中的糖類、酯類等大分子物質(zhì)，共同增加食醋的醇厚柔和口感；醋酸菌為醋醅中的優(yōu)勢(shì)菌，第11天達(dá)到最高為4.0×107CFU/g，自始至終發(fā)揮著重要的作用，將乙醇氧化成乙酸，決定著食醋的產(chǎn)率。

總酸生成得越高，產(chǎn)品的產(chǎn)率也就越高，但是只有當(dāng)不揮發(fā)酸占總酸的比值在一定的范圍內(nèi)時(shí)，食醋產(chǎn)品口感柔和、醋香濃郁。乳酸菌的消長影響著不揮發(fā)酸的生成，醋酸菌的消長影響著總酸的生成，醋酸發(fā)酵過程中控制合適的發(fā)酵條件，使兩者相互協(xié)調(diào)生長，有利于產(chǎn)品口感風(fēng)味的調(diào)和。

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[5]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 4789.35—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

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Microorganisms and flavor formation in vinegar production with solid-state fermentation

SU Yinghui
(Hebei Baoding Huai Mao Co.,Ltd.,Baoding 071011,China)

The microbial distribution and quantity changes in different layers of vinegar fermented grains at different time were studied,and the factors affecting flavors formation were discussed.Results showed that yeast and lactic acid bacteria rapidly proliferated in the first five days,at the fifth day, the yeast count reached the highest of 3.4×107CFU/g,lactic acid bacteria was the highest of 3.2×107CFU/g,non-volatile acid(mainly lactic acid) generated fast.The acetic acid bacteria rapidly proliferated in the first three days,whereafter,it increased slow ly and mainly produced acetic acid.At the eleventh day,the number of acetic acid bacteria reached a peak of 4.0×107CFU/g,and then decreased after thirteen days.At the beginning of acetic acid fermentation,the pH value decreased rapidly,but non-volatile acid increased rapidly,and the maximum ratio of non-volatile acid accounted for the ratio of the total acid was acquired at the seventh day,which was 87.22%.The grow ing rate of total acid during 7-13 d of medium fermentation stage increased maximally.The grow th of lactic acid bacteria affected non-volatile acids generation,the growth of acetic acid bacteria affected total acid generation.Suitable fermentation conditions control during acetic fermentation could coordinate their grow th and reconcile the taste.

fermented vinegar;yeast;acetic acid bacteria;lactic acid bacteria;flavor

TS264.2

A

0254-5071（2015）03-0137-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.033

2014-11-24

蘇迎會(huì)（1975-），女，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)檎{(diào)味品釀造技術(shù)及新產(chǎn)品開發(fā)。