產(chǎn)四甲基吡嗪微生物菌株的選育

趙德義，湯丹丹，曹建全，王瑞明，劉 雪*

（1.山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東安丘262119；2.齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250353）

產(chǎn)四甲基吡嗪微生物菌株的選育

趙德義1，湯丹丹2，曹建全1，王瑞明2，劉 雪1*

（1.山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東安丘262119；2.齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250353）

從中溫大曲中分離篩選了一株產(chǎn)四甲基吡嗪的菌株MJS183，以葡萄糖為主要碳源，37℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)120 h，四甲基吡嗪產(chǎn)量達(dá)11.42 g/L，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)發(fā)酵液成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，代謝主產(chǎn)物為四甲基吡嗪。根據(jù)菌落形態(tài)特征、生理生化特性試驗(yàn)及16S rDNA序列分析，該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。為獲得純度較高的四甲基吡嗪，對(duì)菌體和蛋白質(zhì)去除率進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，添加0.8 g/L的殼聚糖，37℃、200 r/m in振蕩30 min后靜置，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾，濾液4℃自然結(jié)晶，提純得到的晶體呈白色針狀。聯(lián)合使用氣質(zhì)聯(lián)用色譜、傅里葉變換紅外分光光度計(jì)對(duì)晶體進(jìn)行定性分析，檢測(cè)結(jié)果表明該晶體為四甲基吡嗪。

四甲基吡嗪；枯草芽孢桿菌；篩選鑒定；晶體分析

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又稱川芎嗪，屬生物堿類，是一種含氮雜環(huán)化合物，天然存在于大豆食品、咖啡、乳制品中，具有堅(jiān)果、烤面包、熟花生、榛子、可可豆的香味[1]。同時(shí)四甲基吡嗪也是醬香型、芝麻香型白酒的重要香氣成分之一[2]。四甲基吡嗪不僅可以作為食品添加劑提升香氣，而且作為中藥川芎的活性成分在臨床上也有重要的用途，現(xiàn)已作為一種新型鈣離子拮抗劑廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、慢性腎功能衰竭疾病等的臨床治療[3]。

目前，四甲基吡嗪的生產(chǎn)主要是直接提取法、化學(xué)合成法。直接提取法是以傘形科植物川芎為原料，但四甲基吡嗪在川芎中的含量不足0.02%，且提取過程復(fù)雜[4]，從而導(dǎo)致直接提取法成本高，無法適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法采用的底物不盡相同，如王向宇等[5]利用三苯基膦鈀（Pd-PPh3）催化劑催化二乙酰一肟加氫反應(yīng)合成四甲基吡嗪；鄧澤庭等[6]以3-氨基丁酮為原料，經(jīng)原料自身縮合，進(jìn)一步氧化制得四甲基吡嗪。原料來源不足、工藝復(fù)雜、環(huán)境污染嚴(yán)重、反應(yīng)條件劇烈、對(duì)設(shè)備要求高、產(chǎn)物非天然等問題嚴(yán)重制約了四甲基吡嗪的規(guī)?；a(chǎn)。相比之下，生物發(fā)酵法因其原料來源豐富、產(chǎn)品綠色天然、成本低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等諸多優(yōu)勢(shì)而使它成為關(guān)注的熱點(diǎn)。1962年，KOSUGE T等[7]報(bào)道了枯草芽孢桿菌具有生物合成四甲基吡嗪的能力，此后微生物發(fā)酵法合成四甲基吡嗪的文獻(xiàn)報(bào)道逐漸增多，產(chǎn)生菌主要是枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌是一種傳統(tǒng)的酶制劑工業(yè)生產(chǎn)菌株，生長(zhǎng)迅速、易于培養(yǎng)、不分泌內(nèi)毒素，具有較好的生物安全性。本研究以曲樣為材料，分離出高產(chǎn)四甲基吡嗪的芽孢桿菌，并以該菌的發(fā)酵液為原料，以蛋白去除率、菌體去除率為主要指標(biāo)工藝，上清液經(jīng)降溫自然結(jié)晶、真空冷凍干燥，旨在獲得純度較高的四甲基吡嗪，得到的四甲基吡嗪晶體經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）與傅立葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）綜合分析，純度高于99.9%。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

中溫大曲：山東景芝酒業(yè)股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

四甲基吡嗪標(biāo)樣（純度≥98.0%）、三羥基丁酮（純度≥98.0%）：中華試劑網(wǎng)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基[8]

芽孢桿菌富集培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母粉3 g/L，淀粉3 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，KH2PO42 g/L，Na2HPO42 g/L，pH值為7.8，1×105Pa滅菌20 m in。

分離培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH值為7.0，向該培養(yǎng)基中添加2%瓊脂，1×105Pa滅菌20min，用于平板分離純化。

VP培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，pH值為7.0，1×105Pa滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：同分離培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨30 g/L，酵母粉10 g/L，磷酸氫二銨30 g/L，pH值為7.0，葡萄糖單獨(dú)滅菌后加入，其余成分1×105Pa滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-12電泳儀：北京市六一儀器廠；ChampGel5500凝膠成像系統(tǒng)：北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；PCR所用引物：上海生工生物工程有限公司；Mutimode 8 Nanoscope V system掃描探針顯微鏡：德國(guó)Bruker公司；GCMS-QP2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、IRPrestige-21傅立葉變換紅外光譜儀：日本島津公司；Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡：美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選[9]

（1）富集培養(yǎng)：稱取1 g曲粉加到50 m L無菌水中（帶有5粒玻璃珠），200 r/min振蕩30 min，使之充分混勻，于85℃水浴鍋中處理30min，靜置，吸取1m L上清液加至裝有50m L富集培養(yǎng)基的250 m L三角瓶中，37℃、200 r/m in培養(yǎng)過夜。

（2）分離純化：將過夜培養(yǎng)的菌液適當(dāng)稀釋涂布，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。挑取表面不光滑，邊緣不整齊的特征菌落，再次劃線分離，將得到的單菌落保藏于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，待菌落長(zhǎng)出后，4℃冰箱保藏備用。

（3）菌株初篩：KOSUGE T等[7]提出發(fā)酵體系中的四甲基吡嗪的前體物質(zhì)即乙偶姻，為此，借助VP試驗(yàn)[10]檢測(cè)乙偶姻的產(chǎn)量篩選四甲基吡嗪高產(chǎn)菌株。將菌種接種至裝有10 m L VP培養(yǎng)基的試管中，每株一管，37℃、200 r/min培養(yǎng)72 h，發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)乙偶姻的產(chǎn)量，挑選呈陽(yáng)性反應(yīng)且吸光度值高的菌株作為進(jìn)一步復(fù)篩菌株。

（4）菌株復(fù)篩：將初篩菌株接種至裝有50m L發(fā)酵培養(yǎng)基的500m L三角瓶中，37℃、200 r/m in培養(yǎng)120h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定四甲基吡嗪的產(chǎn)量，挑選產(chǎn)量高且遺傳性穩(wěn)定的菌株。

1.3.2 檢測(cè)方法

（1）比色法檢測(cè)乙偶姻[11]

乙偶姻在堿性條件下可被氧化為2,3-丁二酮，2,3-丁二酮與帶有胍基的肌酸反應(yīng)，可產(chǎn)生粉紅色復(fù)合物，甲萘酚的存在可加速此反應(yīng)，該粉紅色復(fù)合物在波長(zhǎng)530 nm處有最大吸收峰，在0.3～0.9范圍內(nèi)吸光度值與乙偶姻的濃度呈線性關(guān)系。

（2）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）檢測(cè)四甲基吡

氣相色譜（GC）條件：毛細(xì)管DB-5MS（30 m×0.25 mm× 0.25 μm），進(jìn)樣口溫度240℃，載氣為高純氦氣（純度≥99.999%），柱流量1.0 m L/m in；程序升溫：70℃保持2 m in，10℃/m in升至210℃，保持2min。進(jìn)樣量1μL；分流比20∶1。

質(zhì)譜（MS）條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI），離子源溫度230℃，全掃描方式掃描譜圖進(jìn)行組分定性。

1.3.3 菌種鑒定

（1）形態(tài)及生理生化特征

按文獻(xiàn)[12-13]中的方法對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特征的鑒定。

（2）16S rDNA序列分析[14]

利用柱式細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），正向引物27f為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492r為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，25 μL反應(yīng)體系中，加入1.5 μL模板，27f、1492r各0.5 μL，三磷酸脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleoside-5′-triphosphate，dNTPs）（10 μmol/L）2.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，DNA聚合酶0.5 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足體系。PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃5 min，變性94℃30 s，退火54℃30 s，延伸72℃2 min，循環(huán)30次，72℃繼續(xù)延伸10 min，將PCR產(chǎn)物送北京華大基因公司測(cè)序。

1.3.4 絮凝與抽濾結(jié)合除蛋白質(zhì)、菌體

將發(fā)酵液（終pH 6.0）均分成5份，按0.6 g/L的添加量分別添加聚丙烯酰胺（陽(yáng)離子型）、殼聚糖、聚乙二醇、海藻酸鈉、堿式氯化鋁，蒸餾水作空白，置于37℃搖床中200 r/min振蕩30 min，靜置，得上清液測(cè)定菌體、蛋白質(zhì)含量，考察不同絮凝劑的絮凝能力。

以絮凝效果最佳的絮凝劑為考察對(duì)象，其他條件不變的情況下，向均分的6份發(fā)酵液中添加絮凝劑，使其終質(zhì)量濃度分別為0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L，考察絮凝劑的最適用量。

將絮凝后得到的上清液，經(jīng)0.22 μm超濾膜真空抽濾除殘余蛋白與菌體。

1.3.5 降溫結(jié)晶

參照文獻(xiàn)[15-16]，四甲基吡嗪溶解度降低而顯著減小。將除蛋白、菌體后的上清液置于未使用過的50 m L離心管中放入4℃冰箱中靜置，使其從飽和溶液中自然結(jié)晶。3 d后，得到大量晶體，蒸餾水（預(yù)先置于4℃冰箱，避免洗滌過程晶體損失）洗滌晶體，于30℃真空干燥箱內(nèi)干燥，得到白色針狀晶體。

1.3.6 分析方法

以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值OD600nm。發(fā)酵液菌體去除率計(jì)算公式如下：

考馬斯亮藍(lán)法[17]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。發(fā)酵液蛋白去除率計(jì)算公式如下：

式中：C1為絮凝前蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/L；C2為絮凝后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/L；V1為絮凝前樣品體積，mL；V2為絮凝后樣品體積，mL。

1.3.7 傅立葉紅外光譜與氣質(zhì)聯(lián)用對(duì)產(chǎn)物分析

精確稱取一定量晶體溶于無水乙醇中，定容使其質(zhì)量濃度為1 g/L，氣質(zhì)聯(lián)用分析晶體的純度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中四甲基吡嗪的質(zhì)量濃度。

取1mg晶體與適量KBr均勻研磨混合，壓片，在4 000～400 cm-1范圍掃描。對(duì)晶體產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)作進(jìn)一步的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

表1 篩選菌株傳代培養(yǎng)結(jié)果Table 1 Subculture results of the screened strains

自曲粉中篩選得到196株芽孢桿菌，通過VP試驗(yàn)以篩選目的菌株，得到51株VP陽(yáng)性菌株。對(duì)此51株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，得到7株四甲基吡嗪產(chǎn)量突出的菌株，選此7株高產(chǎn)菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)5代，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可知，篩選菌株M JS183四甲基吡嗪產(chǎn)量明顯高于其他菌株，且在連續(xù)傳代培養(yǎng)中，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）低，反映其穩(wěn)定性高，因此將菌株MJS183作為目的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

菌株MJS183于分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌落呈圓形，邊緣不整齊，灰白色，表面粗糙有褶皺，黏稠能拉絲，菌落中央稍有突起，或呈火山口狀。液體靜置培養(yǎng)條件下液面形成較厚的白色菌膜。鏡檢發(fā)現(xiàn)菌株呈短小直桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色陽(yáng)性，有芽孢。

高度標(biāo)尺：-256.3～599.5 nm，明亮區(qū)代表較高區(qū)域，暗區(qū)代表低洼區(qū)域，反映樣品表面的起伏粗糙程度。a分離培養(yǎng)基上菌落形態(tài)（培養(yǎng)36 h）；b原子力顯微鏡下菌的形態(tài)；c液體培養(yǎng)12 h后革蘭氏染色圖（10×100）

菌株MJS183的部分生理生化特性見表2。

表2 菌株MJS183生理生化特性測(cè)試結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain MJS183

由表2可知，菌株M JS183可利用的糖范圍較廣，如葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖。能夠利用檸檬酸鹽，可在10% NaCl中生長(zhǎng)，可在55℃條件下生長(zhǎng)，與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的枯草芽孢桿菌模式菌株進(jìn)行對(duì)照，二者的生理生化特征一致，初步判斷該菌株屬于枯草芽孢桿菌。

利用分子生物學(xué)方法PCR擴(kuò)增獲得菌株M JS183的16S rDNA序列并進(jìn)行序列的測(cè)定，將測(cè)得的核苷酸序列通過NCBI-BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，選取相關(guān)菌種的同源性高的序列，利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-jointing算法多序列連配分析后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。由圖2可知，菌株MJS183與多株枯草芽孢桿菌達(dá)到99%，與模式菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B-F06處于同一分支，結(jié)合生理生化特性試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定，可鑒定JMS183為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2 基于16S rDNA基因序列同源性構(gòu)建的菌株MJS183系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain MJS183 based on the 16S rDNA gene homology

2.2 菌株MJS183代謝產(chǎn)物的GC-MS分析

將發(fā)酵液5 000 r/min離心10min以除去菌體，取上清液與無水乙醇等體積混合后進(jìn)行蒸餾，收集餾分，對(duì)餾分進(jìn)行GC-MS分析，總離子流色譜圖見圖3，1號(hào)峰的質(zhì)譜解析結(jié)果見圖4。

由圖3、圖4可知，保留時(shí)間8.308 m in處有強(qiáng)峰，將此物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對(duì)，與四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品相似度為94%，可以確定菌株MJS183具備發(fā)酵產(chǎn)四甲基吡嗪的能力。

圖3 菌株MJS183代謝產(chǎn)物的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of strain MJS183 metabolite

圖4 菌株MJS183代謝產(chǎn)物(A)及四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品(B)質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of strain MJS183 metabolite(A)and tetramethylpyrazine standard(B)

2.3 發(fā)酵液的除菌、除蛋白質(zhì)

取100 m L發(fā)酵液于燒杯中，分別加入一定量的聚丙烯酰胺、殼聚糖、聚乙二醇、海藻酸鈉、堿式氯化鋁，攪拌30 min，靜置30 min后測(cè)菌體及蛋白質(zhì)的去除率，結(jié)果如圖5所示。取100 m L發(fā)酵液于燒杯中，添加不同量的殼聚糖，攪拌30 min，靜置30 min后測(cè)菌體及蛋白質(zhì)的去除率，結(jié)果如圖6所示。

由圖5可知，不同絮凝劑的絮凝效果差異很大，其中殼聚糖的效果最佳。菌體去除率達(dá)92.8%，蛋白質(zhì)去除率近78.4%，因此選擇殼聚糖作為去除發(fā)酵液中菌體和蛋白的最佳絮凝劑。

由圖6可知，殼聚糖的用量對(duì)絮凝效果影響較顯著，絮凝劑量過少，菌體不能完全吸附；絮凝劑量過多，飽和絮凝顆粒之間不再相互交聯(lián)，很難形成大的絮凝團(tuán)。將上清液（絮凝劑量為0.8 g/L時(shí)）經(jīng)0.22 μm濾膜真空抽濾后，菌體去除率99.7%，蛋白去除率94.8%，但是濾孔容易堵塞，影響抽濾的效果。綜合考慮菌體和蛋白的去除率，選擇絮凝劑殼聚糖的最佳用量為0.8 g/L。

圖5 不同絮凝劑對(duì)菌體、蛋白質(zhì)去除率的影響Fig.5 Effect of different flocculating agent on bacteria and protein removing rate

圖6 殼聚糖用量對(duì)菌體、蛋白質(zhì)去除率的影響Fig.6 Effect of chitosan addition on bacteria and protein removing rate

2.4 晶體分析

發(fā)酵液上清液經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾，濾液于4℃自然結(jié)晶，得到白色針狀晶體。晶體溶液經(jīng)HPLC檢測(cè)，呈單一、狹窄的對(duì)稱峰，說明晶體組分均一。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算樣品的純度為99.98%，可知所得晶體的純度較高。將晶體進(jìn)行傅里葉紅外光譜檢測(cè)，結(jié)果見圖7。

圖7 晶體紅外光譜Fig.7 Infrared spectrum of crystal

由圖7可知，芳環(huán)的指紋區(qū)和特征區(qū)均存在吸收峰，說明該晶體屬于芳香族化合物。1 630～1 690 cm-1之間的強(qiáng)峰代表了C=N雙鍵的存在，1 450～1 650 cm-1間的峰是苯環(huán)C=C雙鍵的特征峰，1 375 cm-1處是甲基的一個(gè)明顯特征峰。結(jié)果表明，晶體的結(jié)構(gòu)是含氮雜環(huán)、甲基取代的有機(jī)物。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，將晶體溶于無水乙醇中，進(jìn)行GC-MS分析-確定經(jīng)純化得到的晶體即為四甲基吡嗪。

3 結(jié)論

本研究從中溫大曲粉中篩選得到一株高產(chǎn)四甲基吡嗪的菌株，經(jīng)過生理生化特性測(cè)試和16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。經(jīng)過搖瓶實(shí)驗(yàn)，菌株MJS183的四甲基吡嗪產(chǎn)量可達(dá)11.42 g/L，已達(dá)中上水平，后期通過代謝控制發(fā)酵、菌株改良等手段，四甲基吡嗪的產(chǎn)量還會(huì)進(jìn)一步提高。本實(shí)驗(yàn)對(duì)純化得到的晶體進(jìn)行了HPLC、FTIR、GC/MS結(jié)合分析，可以鑒定該晶體為四甲基吡嗪，經(jīng)HPLC計(jì)算其純度為99.98%，為下一步對(duì)發(fā)酵液中四甲基吡嗪大規(guī)模提取提供了可靠的基礎(chǔ)。

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Screening of tetramethylpyrazine-producing strain

ZHAO Deyi1,TANG Dandan2,CAO Jianquan1,WANG Ruiming2,LIU Xue1*
(1.Shandong Jingzhi Liquor Co.,Ltd.,Anqiu 262119,China;2.Shandong Key Laboratory of Microbial Engineering, QiLu University of Technology,Jinan 250353,China)

In this study,a tetramethylpyrazine-producing strain MJS183 was screened from medium temperature Daqu.When the strain was incubated at 37℃with a shake-flask culture of 200 r/m in for 120 h,the maximum tetramethylpyrazine concentration was up to 11.42 g/L using glucose as main carbon source.The fermentation broth was analyzed by GC-MS,and results showed that the major metabolite was tetramethylpyrazine.Strain MJS183 was identified as Bacillus subtilis based on its morphology,physiology,and biochemical characteristics as well as 16S rDNA sequence analysis.In order to obtain high pure tetramethylpyrazine,the removing technology of protein and cell from fermentation broth were studied.Results showed that the optimal condition was chitosan addition 0.8 g/L,temperature 37℃with a speed of 200 r/min for 30 m in.The supernatants were disposed by0.22 μm filter membrane ultrafiltration,and then the filtrate was crystallized at 4℃,and the purified crystal was white and aciform.The crystal was qualitatively analyzed by GC-MS and fourier transform infrared spectrometer,the detected results showed the crystal was tetramethylpyrazine.

tetramethylpyrazine;Bacillus subtilis;screening and identification;crystal analysis

Q 939.97

A

0254-5071（2015）03-0102-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.024

2015-01-10

趙德義（1967-），男，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：劉雪（1986-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣I(yè)微生物菌種選育與鑒定。