利用NMR技術(shù)研究極性二肽與金屬離子間的相互作用

劉 絮 ， 彭苗苗 ， 郭艷春， 曹書霞， 趙玉芬,2

(1.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 福建 廈門 361005)

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利用NMR技術(shù)研究極性二肽與金屬離子間的相互作用

劉 絮1， 彭苗苗1， 郭艷春1， 曹書霞1， 趙玉芬1,2

(1.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 福建 廈門 361005)

利用核磁滴定法研究了極性鏈狀二肽(均為L(zhǎng)L構(gòu)型)與金屬離子之間的相互作用.極性二肽在與一價(jià)金屬離子相互作用時(shí)，兩者間的化學(xué)計(jì)量比為1∶1，并求得Li+與10種極性二肽結(jié)合常數(shù)的大小，其中與L-Glu-L-Glu的結(jié)合常數(shù)最大，這可能與L-Glu-L-Glu含有較多的富電子原子有關(guān).在此基礎(chǔ)上又研究了Cu2+，Zn2+，Co2+3種二價(jià)金屬離子與極性二肽間的相互作用，結(jié)果表明，二價(jià)金屬離子與二肽間的相互作用是通過兩步完成的.

核磁共振； 極性二肽； 金屬離子； 結(jié)合常數(shù)

0 引言

分子識(shí)別是生物體系的基本特征，是一種有目的、有選擇的過程，此過程可能引起體系的電學(xué)、光學(xué)性質(zhì)及構(gòu)象的變化，也可能引起化學(xué)性質(zhì)的變化，從而引起化學(xué)信息的存儲(chǔ)、傳遞及處理.因此，分子識(shí)別在信息處理及傳遞、分子及超分子器件制備過程中起著重要作用[1].分子識(shí)別屬于超分子化學(xué)范疇，是研究一個(gè)給定的受體或主體分子與底物或客體分子的相互作用.在生物體內(nèi)，各類氨基酸以及肽類化合物經(jīng)常與不同的金屬離子結(jié)合形成超分子化合物，此類化合物在生物體的生命活動(dòng)中起著重要的作用[2-3].

核磁共振法是一種比較直觀地反映主、客體之間相互作用的方法，此方法的多種參數(shù)使它成為研究溶液中分子結(jié)構(gòu)的有力工具.通過測(cè)定1H，13C，15N，31P及各種二維譜，可以得到有關(guān)化學(xué)位移、耦合常數(shù)、化學(xué)交換和擴(kuò)散系數(shù)等方面的信息[4-6].化學(xué)位移是最直觀反映分子間相互作用的參數(shù)，核的化學(xué)位移的變化反映了核周圍的磁場(chǎng)變化，由此可以推斷是否有分子間相互作用的存在以及分子構(gòu)象是否發(fā)生改變等.隨著NMR技術(shù)解析得到的蛋白質(zhì)和核酸的數(shù)量越來越多，化學(xué)位移數(shù)據(jù)庫不斷完善，使化學(xué)位移成為除耦合常數(shù)和NOE以外的大分子結(jié)構(gòu)計(jì)算的重要參數(shù)[7-8].文[9]利用核磁共振和紫外光譜研究了水溶性的纖維低聚糖與CBDN1間的相互作用，并根據(jù)NMR-1H，15N化學(xué)位移和紫外吸收的變化，計(jì)算出不同低聚糖與CBDN1作用的結(jié)合常數(shù).文[10]運(yùn)用核磁共振技術(shù)研究了金屬鈣離子與蛋白之間的相互作用，并進(jìn)行了三級(jí)結(jié)構(gòu)的解析，為蛋白與金屬間相互作用的研究提供了很好的參考數(shù)據(jù).肽是指氨基酸之間以酰胺鍵連接的一類化合物，可以由兩個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸脫水縮合得到，是蛋白的主要組成成分.二肽是其中最簡(jiǎn)單的分子，通常根據(jù)構(gòu)成二肽的氨基酸的極性特征，將二肽分為極性二肽和非極性二肽.即連有極性側(cè)鏈的氨基酸構(gòu)成的二肽，稱為極性二肽；反之，連有非極性側(cè)鏈的氨基酸構(gòu)成的二肽，稱為非極性二肽.作者通過核磁共振技術(shù)，利用核磁滴定法測(cè)定了10種極性二肽分子與Li+間的結(jié)合常數(shù)，并探討了這10種極性二肽與3種二價(jià)金屬離子間的相互作用，為完善金屬離子與二肽之間相互作用的理論研究以及揭示超分子識(shí)別作用的機(jī)制奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

Bruker DPX 400 MHz核磁共振儀，Sartorius BP211D分析天平，TGL-16臺(tái)式離心機(jī)，XW-80A漩渦混合器.

LiCl和CsCl購自上海市新華化工廠；NaCl購自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；KCl購自北京市雙環(huán)化學(xué)試劑廠；Cu(NO3)2·3H2O購自天津市化學(xué)試劑三廠；Zn(NO3)2·6H2O購自上海市振欣試劑廠；Co(NO3)2·6H2O購自天津市科密歐化學(xué)試劑公司；d6-DMSO由北京市崇熙科技孵化器有限公司提供；L-Asp-L-Asp，L-Glu-L-Glu，L-Thr-L-Thr，L-Arg-L-Arg，L-His-L-Lys，L-Tyr-L-Arg，L-Asp-L-Tyr，L-Gln-L-Gly，L-Asp-L-Pro和Gly-Gly二肽均購于吉爾生化(上海)有限公司，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 極性二肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of polar dipeptides

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的配制

圖2 L-Glu-L-Glu與Li+的NMR Job plot曲線Fig.2 NMR Job plot of L-Glu-L-Glu toward Li+

以氘代的DMSO為溶劑，配制0.2 mol/L的極性鏈狀二肽溶液和一系列不同濃度的金屬離子溶液，將二者等體積混合，使得極性鏈狀二肽的最終濃度均為0.1 mol/L，同時(shí)極性鏈狀二肽的濃度與金屬離子的濃度比分別為1∶0，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，1∶15和1∶20.對(duì)各組樣品進(jìn)行1H-NMR檢測(cè).

2.2 結(jié)合常數(shù)的計(jì)算

首先利用核磁滴定法測(cè)定二肽與一價(jià)金屬離子的化學(xué)計(jì)量比，圖2為L(zhǎng)-Glu-L-Glu與Li+的NMR Job plot曲線.不斷改變L-Glu-L-Glu濃度(ca)與金屬離子濃度(cb)，而保持二者的總濃度為0.1 mmol/L.隨著二者濃度比例的改變，L-Glu-L-Glu氨基上N—H的化學(xué)位移也會(huì)隨之變化，根據(jù)離子濃度與氨基上N—H化學(xué)位移的變化值，利用 Job plot 方程擬合[11]，可知L-Glu-L-Glu與Li+的化學(xué)計(jì)量比為1∶1.

當(dāng)兩者結(jié)合比為1∶1時(shí)，極性鏈狀二肽與一價(jià)金屬離子相互作用的結(jié)合常數(shù)，是由極性鏈狀二肽氨基上N—H的化學(xué)位移值對(duì)加入的金屬離子的濃度進(jìn)行非線性最小二乘法擬合得到的.在滴定過程中，隨著金屬離子濃度的不斷增加，直鏈二肽N—H的化學(xué)位移隨之改變.根據(jù)化學(xué)位移的變化可以計(jì)算兩者的結(jié)合常數(shù)，相應(yīng)的計(jì)算公式如下[9]：

Ka=fci/(0.1fci2-fci[Lt]i-0.1fci+[Lt]i)，

(1)

其中,fci=(δi- δf)/( δc- δi),δf為未加金屬離子時(shí)二肽N—H的化學(xué)位移值；δc為金屬離子與二肽完全結(jié)合時(shí)二肽N—H的化學(xué)位移值；δi為核磁滴定時(shí)任一狀態(tài)下二肽N—H的化學(xué)位移值；[Lt]i為任一時(shí)刻金屬離子的濃度.

對(duì)于二價(jià)金屬離子，由于離子勢(shì)、離子半徑等不盡相同并且其本身具有順反磁性，可以采用固定金屬離子濃度的方法，逐漸滴加二肽，根據(jù)N—H化學(xué)位移的變化來定性比較它們之間相互作用的強(qiáng)弱.

3 結(jié)果與討論

3.1 極性鏈狀二肽與一價(jià)金屬離子的相互作用

分別研究了10種極性鏈狀二肽與4種一價(jià)金屬離子(Li+，Na+，K+和Cs+)的相互作用.現(xiàn)主要以L-Glu-L-Glu在加入Li+后氨基N—H化學(xué)位移的變化來說明它們之間的相互作用.

3.1.1 L-Glu-L-Glu與Li+的結(jié)合常數(shù) L-Glu-L-Glu與Li+以不同的濃度配比1∶0，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，1∶15，1∶20對(duì)其進(jìn)行1H-NMR的測(cè)定，相應(yīng)N—H的化學(xué)位移值δi分別為8.188 4，8.415 1,8.488 2,8.527 4,8.548 9,8.564 6,8.575 8,8.583 3,8.589 5,8.593 7,8.597 9,8.615 2，8.618 4.當(dāng)二肽與金屬離子的濃度比ca∶cb=1∶0時(shí)，δi即為δf.

為了更直觀地觀察L-Glu-L-Glu氨基N—H化學(xué)位移變化規(guī)律，以ca∶cb為橫坐標(biāo)，δi(N—H)為縱坐標(biāo)作圖.如圖4所示，當(dāng)Li+的濃度配比不斷增加時(shí)，N—H的化學(xué)位移也會(huì)隨之增大，但其增大的幅度在不斷減小.當(dāng)二肽與金屬離子的濃度比為1∶15時(shí)，隨著金屬離子濃度的增大，N—H的化學(xué)位移值變化不再明顯，此時(shí)可認(rèn)為兩者之間的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，即使再增大金屬離子濃度也不會(huì)引起化學(xué)位移值明顯的變化，此時(shí)的N—H化學(xué)位移值即為δc.

圖3 L-Glu-L-Glu中的N—H化學(xué)位移隨Li+的 加入其核磁堆積圖Fig.3 The stack 1H-NMR spectra of N—H chemical shifts in L-Glu-L-Glu with adding Li+

圖4 N—H化學(xué)位移變化規(guī)律Fig.4 The change rule of N—H chemical shifts

將不同濃度比下L-Glu-L-Glu中N—H的化學(xué)位移值代入公式(1)，即可計(jì)算出兩者之間相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka=36.4 L/mol.

3.1.2 極性鏈狀二肽與Li+的結(jié)合常數(shù) 根據(jù)以上計(jì)算方法，運(yùn)用公式(1)可以求出Gly-Gly，L-Asp-L-Asp，L-Arg-L-Arg，L-Thr-L-Thr，L-Glu-L-Glu，L-His-L-Lys，L-Tyr-L-Arg，L-Gln-L-Gly，L-Asp-L-Tyr，L-Asp-L-Pro與Li+相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka，結(jié)果分別為7.4，11.6，29.5，34.3，36.4，31.1，22.8，16.3，14.8，10.0 L/mol.

由于不同的極性鏈狀二肽含有不同的側(cè)鏈基團(tuán)，當(dāng)它們與金屬離子作用時(shí)，其結(jié)合能力也各不相同.L-Glu-L-Glu與L-Asp-L-Asp相比，前者側(cè)鏈比后者多兩個(gè)碳原子，更易于折疊彎曲，能更好地與金屬離子結(jié)合，因此前者與Li+的結(jié)合常數(shù)較后者大.L-Glu-L-Glu，L-Thr-L-Thr，L-His-L-Lys以及L-Arg-L-Arg這4種二肽因?yàn)楹休^多的富電子原子，如N，O等，能夠更好地向缺電子的Li+提供電子，因而其結(jié)合常數(shù)比其他二肽大.尤其是L-Glu-L-Glu，因其含有較多的氧原子以及更長(zhǎng)的碳鏈，更易于折疊扭曲，其與Li+的結(jié)合常數(shù)為最大.與之相反，Gly-Gly不僅沒有側(cè)鏈基團(tuán)，而且其在氘代試劑中溶解度很小，所以與Li+的結(jié)合能力最弱.由于Na+，K+和Cs+形成的鹽在各種氘代試劑中的溶解性極小，導(dǎo)致利用NMR法測(cè)定它們與二肽的結(jié)合常數(shù)均很小，且重現(xiàn)性不好，不能真實(shí)反映二者間相互作用的能力，故未列出.

3.2 極性鏈狀二肽與二價(jià)金屬離子的相互作用

圖5 L-Gln-L-Gly與Cu2+之間相互作用的線性關(guān)系圖Fig.5 The linear graph of the interaction between L-Gln-L-Gly and Cu2+

圖6 L-Gln-L-Gly與Zn2+之間相互作用的線性關(guān)系圖Fig.6 The linear graph of the interaction between L-Gln-L-Gly and Zn2+

圖7 L-Gln-L-Gly與Co2+之間 相互作用的線性關(guān)系圖Fig.7 The linear graph of the interaction between L-Gln-L-Gly and Co2+

從3個(gè)關(guān)系圖中可以看出，固定某種金屬離子的含量不變，當(dāng)不斷向體系中滴加二肽時(shí)，N—H的化學(xué)位移并不像一價(jià)金屬離子那樣呈規(guī)律性增加，而是出現(xiàn)隨著二肽的滴加，N—H的化學(xué)位移值不斷減小或者不斷增大的現(xiàn)象，并且在減小和增大的過程中有拐點(diǎn)出現(xiàn)，即在作圖時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩條斜率不同的直線.這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與金屬離子本身具有一定的磁性(Cu2+,Zn2+為抗磁性，Co2+為順磁性)以及由于電荷離域化而誘導(dǎo)出接觸位移有關(guān).研究[14-15]表明，在金屬離子和有機(jī)分子相互作用的過程中，所呈現(xiàn)出來的線性關(guān)系圖的斜率跟結(jié)合常數(shù)直接相關(guān).由此可以判定，二價(jià)金屬離子與二肽的相互作用是通過兩步進(jìn)行的.根據(jù)線性關(guān)系圖的斜率，可以定性地判斷極性鏈狀二肽與Co2+的結(jié)合能力稍強(qiáng)于與Zn2+的結(jié)合能力.

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(責(zé)任編輯：孔 薇)

Study of the Interaction Between Polar Dipeptides and Metal Ions by NMR

LIU Xu1， PENG Miao-miao1， GUO Yan-chun1， CAO Shu-xia1， ZHAO Yu-fen1,2

(1.CollegeofChemistryandMolecularEngineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China;2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,XiamenUniversity,Xiamen361005,China)

The interactions of 10 polar chain dipeptides(L-L configuration) with metal ions were examined by NMR. These polar chain dipeptides exhibited a tremendous selectivity toward monovalent mental ion, showing a stoichiometric binding with 1∶1, and the association constants of dipeptides with Li+were acquired. The results showed that L-Glu-L-Glu had stronger binding ability toward Li+ions than other dipeptides, and suggested the electron-rich atoms in L-Glu-L-Glu molecular were favorable for the interaction with metal ions. Furthermore, the interactions of divalent metal ions(Cu2+, Zn2+, Co2+) with 10 polar chain dipetieds were studied, which implied the interaction between them was carried out in two stages.

NMR； polar dipeptide； metal ion； association constant

2015-03-11

國(guó)家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目，編號(hào)21105091．

劉絮(1983-)，女，河南駐馬店人，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事生物化學(xué)研究，E-mail:lxcod@zzu.edu.cn；通訊作者：郭艷春(1972-)，女，河南鄭州人，講師，博士，主要從事有機(jī)磷化學(xué)研究，E-mail:ycguo@zzu.edu.cn．

劉絮，彭苗苗，郭艷春，等.利用NMR技術(shù)研究極性二肽與金屬離子間的相互作用[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2015，47(3)：82-86.

O482.53

A

1671-6841(2015)03-0082-05

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.03.016