LHβ亞基在羅非魚(yú)腺中的表達(dá)及精巢中細(xì)胞定位

吳風(fēng)瑞 ，蘇咪咪，劉 勇，丁 彪，李文雍,2

(1. 阜陽(yáng)師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院, 安徽 阜陽(yáng) 236037；2. 胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 阜陽(yáng) 236037)

LHβ亞基在羅非魚(yú)腺中的表達(dá)及精巢中細(xì)胞定位

吳風(fēng)瑞1,2，蘇咪咪1，劉 勇1,2，丁 彪1,2，李文雍1,2

(1. 阜陽(yáng)師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院, 安徽 阜陽(yáng) 236037；2. 胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 阜陽(yáng) 236037)

近年來(lái)大量研究表明魚(yú)類(lèi)促性腺激素不僅在垂體中表達(dá)和分泌，性腺局部也是產(chǎn)生促性腺激素的場(chǎng)所。為驗(yàn)證尼羅羅非魚(yú)LHβ是否也在性腺中表達(dá)，本研究采用RT-PCR方法檢測(cè)了LHβ亞基在羅非魚(yú)垂體、卵巢和精巢中轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)通過(guò)免疫組化的方法觀察了LHβ亞基在羅非魚(yú)精巢中表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除垂體外，LHβ亞基在羅非魚(yú)卵巢和精巢中均有表達(dá)，且表達(dá)于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步揭示羅非魚(yú)促性腺激素功能提供基礎(chǔ)的理論依據(jù)，也對(duì)魚(yú)類(lèi)的人工繁育具有重要意義。

LHβ亞基；RT-PCR；免疫組織化學(xué)；精巢；羅非魚(yú)

脊椎動(dòng)物垂體分泌的促性腺激素包括促濾泡激素(Follicle-stimulatinghormone，F(xiàn)SH)和促黃體激素(Luteinizinghormone，LH)兩類(lèi)，由結(jié)構(gòu)亞基α和激素特異型亞基β構(gòu)成的異質(zhì)二聚體[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，人們都認(rèn)為魚(yú)類(lèi)促性腺激素僅在垂體中表達(dá)和分泌，受“下丘腦-垂體-性腺”管理功能軸調(diào)控。然而越來(lái)越多的研究表明，促性腺激素三個(gè)亞基不僅在垂體中表達(dá)，在魚(yú)類(lèi)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的性腺局部和其他組織也可檢測(cè)到其mRNA表達(dá)信號(hào)，如南方鲇[2]、 黑鯛[3]、 金頭海鯛[4]、 花鰻鱺[5]和半滑舌鰨[6]等，達(dá)到調(diào)節(jié)配子的發(fā)生、成熟和精子和卵子排放的目的。

尼羅羅非魚(yú)((Oreochromisniloticus))為熱帶魚(yú)類(lèi)，隸屬鱸形目(Perciformes)、麗魚(yú)科(Cichlidae)，其成熟時(shí)間短(雄魚(yú)大約為半年，雌魚(yú)大約為8個(gè)月)，產(chǎn)卵周期短，是研究性別決定和性腺發(fā)育的好材料[7]。為研究羅非魚(yú)LHβ亞基在精巢中的表達(dá)及細(xì)胞定位，本研究采用RT-PCR結(jié)合半定量分析的方法檢測(cè)了LHβ亞基在羅非魚(yú)垂體和性腺中轉(zhuǎn)錄水平，利用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)LHβ亞基mRNA在精巢中表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行分析。本研究結(jié)果不僅表明促性腺激素的垂體外分泌是硬骨魚(yú)類(lèi)中廣泛存在的現(xiàn)象，也為進(jìn)一步研究促性腺激素在羅非魚(yú)性腺發(fā)育、配子成熟和釋放過(guò)程中的功能提供基礎(chǔ)的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

本實(shí)驗(yàn)中所用羅非魚(yú)購(gòu)自本地水產(chǎn)市場(chǎng)，雌雄均性成熟，于室內(nèi)35×35×50cm3玻璃水族箱內(nèi)暫養(yǎng)，自然光照。本實(shí)驗(yàn)所用PCR引物由上海立菲生物技術(shù)公司合成，RNA提取試劑、Taq酶、DNaseI(RNasefree)購(gòu)自Takara公司，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2RT-PCR

提取羅非魚(yú)成魚(yú)垂體、性腺總RNA，經(jīng)DNaseI(RNasefree)處理后逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，采用RT-PCR的方法研究羅非魚(yú)LHβ亞基在垂體、卵巢和精巢中的表達(dá)。用LHβ正向引物(5′-GAATGCTCCTTGCTCTGATG-3′)和LHβ反向引物(5′-CCAGGTGGGCAATCGGGAAG-3′)、β-actin正向引物(5′-GGCATCACACCTTCTACAACGA-3′)和β-actin反向引物(5′-ACGCTCTGTCAGGATCTTCA′)擴(kuò)增LHβ和β-actin開(kāi)放閱讀框部分片段。反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)條件依次為：94 ℃預(yù)變性 3min，變性94 ℃ 30s，退火57 ℃ 30s，延伸72 ℃ 30s，PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，用Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)成像，進(jìn)行半定量分析，數(shù)據(jù)用3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用GraphPadPrism5 (GraphPadSoftware,SanDiego,CA)進(jìn)行相關(guān)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)，認(rèn)為差異極顯著。

1.3 免疫組織化學(xué)

取羅非魚(yú)垂體和精巢組織，用固定液為Bouin氏液(飽和苦味酸75mL+ 甲醛25mL+ 冰醋酸 5mL)。材料常規(guī)包埋、連續(xù)切片，厚度為5μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，1×PBS洗5次，再用3%H2O2室溫避光處理10分鐘以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS清洗5次，血清封閉15min，滴加石斑魚(yú)LHβ抗體(其他實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))37 ℃孵育30min后，同時(shí)含有一張以與一抗同一來(lái)源的動(dòng)物血清替代一抗的切片作為陰性對(duì)照，以羅非魚(yú)芳香化酶cyp19a1a抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。清洗后滴加羊抗兔辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(博士德，中國(guó)武漢)室溫孵育30min，DAB(3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride，Sigma)顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，脫水透明封片后，奧林巴斯BX51顯微成像。

2 結(jié)果

2.1 羅非魚(yú)LHβmRNA在垂體、卵巢和精巢中的表達(dá)

PCR結(jié)果表明，羅非魚(yú)LHβmRNA在垂體、卵巢和精巢中均具有表達(dá)水平，其在垂體中表達(dá)水平最高，卵巢次之，而在精巢中表達(dá)水平最低，結(jié)果如圖1所示。

圖1 羅非魚(yú)LHβ mRNA在垂體、卵巢和精巢中的表達(dá)模式。P，垂體；O，卵巢；T，精巢；+，陽(yáng)性對(duì)照；-，陰性對(duì)照；底端為內(nèi)參β-actin

隨后我們又采用了半定量分析對(duì)凝膠電泳圖進(jìn)行光密度分析，羅非魚(yú)LHβmRNA在垂體中的表達(dá)水平大約是其在卵巢和精巢中的3-4倍(圖2)，且差異顯著(0.01

圖2 羅非魚(yú)LHβ mRNA在垂體、卵巢和精巢中的表達(dá)模式。圖中橫坐標(biāo)示羅非魚(yú)垂體、卵巢、精巢組織，縱坐標(biāo)為L(zhǎng)Hβ相對(duì)內(nèi)參β-actin表達(dá)水平，*P<0.05

2.2 羅非魚(yú)LHβ在垂體和精巢中表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，LHβ在羅非魚(yú)垂體主要表達(dá)于近端部。而在精巢中，表達(dá)于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中。陽(yáng)性對(duì)照cyp19a1a表達(dá)與該時(shí)期卵巢間質(zhì)細(xì)胞，而陰性對(duì)照無(wú)顯色，結(jié)果如圖3所示。

3 分析與討論

硬骨魚(yú)類(lèi)促黃體激素LH主要是由垂體產(chǎn)生和釋放，并通過(guò)血液運(yùn)送到其靶器官。本研究通過(guò)RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)LHβ不僅在垂體中表達(dá)，在卵巢和精巢中也檢測(cè)到mRNA表達(dá)信號(hào)。結(jié)合我們前期[2]在南方鲇的研究和其他已有相關(guān)報(bào)道，我們認(rèn)為這種垂體以外的促性腺激素的表達(dá)模式是硬骨魚(yú)類(lèi)中普遍存在的現(xiàn)象。

圖3 羅非魚(yú)LHβ在垂體和精巢中表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型。PI，中間部；PPD，近端部；RPD，喙部；SG，精原細(xì)胞；SC，精母細(xì)胞；SPT，精子；OC，卵母細(xì)胞；IS，間質(zhì)細(xì)胞；OCV，卵巢腔，圖中40、100、200、400×示放大倍數(shù)

序列同源性分析表明，羅非魚(yú)LHβ氨基酸序列和石斑魚(yú)具有94%相似性[8]，特別是12個(gè)半胱氨酸殘基和N末端糖基化位點(diǎn)。Li等采用石斑魚(yú)LHβ多克隆抗體發(fā)現(xiàn)LHβ主要在石斑魚(yú)垂體近端部表達(dá)[8]，我們以該抗體為一抗通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)LHβ也表達(dá)于垂體近端部，表明此抗體在羅非魚(yú)也具有良好的特異性。進(jìn)而我們又采用該抗體研究了LHβ在羅非魚(yú)精巢中表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LHβ在羅非魚(yú)精巢生殖細(xì)胞如精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中表達(dá)，以促進(jìn)精子發(fā)生、成熟，提高精子質(zhì)量[9]。在金頭海鯛中，通過(guò)原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)LH在I、II和III期卵母細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)一步暗示促黃體激素可以直接在性腺局部中產(chǎn)生并直接作用于性腺，促進(jìn)配子的成熟和釋放。大量研究表明，許多性腺局部的旁分泌因子同促性腺激素一起組成性腺局部的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)細(xì)胞通訊過(guò)程，共同促進(jìn)性腺生殖細(xì)胞的最終成熟[10-12]。基于本研究和其他結(jié)果，我們推測(cè)精巢中促黃體激素LH可作為自分泌或旁分泌分子，增進(jìn)了精巢體細(xì)胞和生殖細(xì)胞之間的相互作用，直接或間接地影響性腺發(fā)育、配子發(fā)生和成熟過(guò)程。

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ExpressionofLHβsubunitintilapiagonadandcelllocalizationintestis

WUFeng-rui1,2，SUMi-mi1，LIUYong1,2，DINGBiao1,2，LIWen-yong1,2

(1.SchoolofBiologicalScienceandFoodEngineering,FuyangNormalUniversity,FuyangAnhui236037,China；2.KeyLaboratoryofEmbryoDevelopmentandReproductiveRegulation,FuyangAnhui236037,China)

Ithasbeenreportedthatfishgonadotropinwasexpressedinpituitary,butalsoinlocalgonad.ToconfirmwhethertilapiaLHβsubunitisexpressedingonadornot,RT-PCRwasperformedtodetectthetranscriptionlevelintilapiapituitary,ovaryandtestis.Moreover,thegonadalcelltypewhereLHβexpresswasfurtheranalyzedbyImunohistochemistry.TheresultsshowedthattilapiaLHβwasexpressedbothinovaryandtestisbesidespituitary,andtheexpressionlevelofLHβinpituitarywasas3-4timesthaninovaryandtestis.Meanwhile,LHβwasfoundinspermatocytes,spermatogoniumandspermatidsintestis.Together,theseresultswillprovidebasicdataforfurtherindicatingthefunctionofgonadotropinintilapia,andcouldbebeneficialforartificialinseminationinfish.

LHβsubunit；RT-PCR；Imunohistochemistry；testis；Tilapia.

安徽省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(1408085QC65)，安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2013A202)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(AH201410371083)資助。

吳風(fēng)瑞(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：胚胎發(fā)育的分子機(jī)制。

Q952

A

1004-4329(2015)04-066-03

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2015)04-066-03

投稿日期：2015-6-17