液相色譜測(cè)定水產(chǎn)品中組胺含量不確定度評(píng)估

胡禮淵，孫高英，廖和菁

（廣西東興出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西東興538100）

液相色譜測(cè)定水產(chǎn)品中組胺含量不確定度評(píng)估

胡禮淵，孫高英，廖和菁

（廣西東興出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西東興538100）

根據(jù)GB/T 20768-2006魚(yú)和蝦有毒生物胺的測(cè)定原理，建立不確定度評(píng)定數(shù)學(xué)模型，評(píng)估該方法在分析過(guò)程中的不確定度來(lái)源，計(jì)算檢測(cè)過(guò)程中引入的各個(gè)不確定度分量，并計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的合成不確定度和擴(kuò)展不確定度。

高效液相色譜；組胺；不確定度

國(guó)際實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可合作組織（ILAC）在發(fā)布的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)17025中，要求認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用GUM評(píng)估和報(bào)告測(cè)量不確定度[1]。測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)[2]，隨著食品安全問(wèn)題受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注，測(cè)量不確定度可為食品檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性提供真實(shí)、有效依據(jù)。

組胺是一種低分子雜環(huán)族有機(jī)化合物，由組氨酸在摩根氏變形桿菌、組胺無(wú)色桿菌等細(xì)菌和組氨酸脫羧酶的作用下脫去羧基后形成，是生成致癌物質(zhì)和亞硝基類(lèi)物質(zhì)的前體，也是生物胺中毒性最大的胺類(lèi)，對(duì)人體健康的危害極大。我國(guó)規(guī)定鮐魚(yú)中組胺含量≤100mg/100 g，其他魚(yú)類(lèi)中組胺含量≤30mg/100 g。本次實(shí)驗(yàn)根據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定的通用準(zhǔn)則[1-2]對(duì)GB/T 20768—2006《魚(yú)和蝦中有毒生物胺的測(cè)定》進(jìn)行了不確定度評(píng)定，為該方法的控制和檢測(cè)報(bào)告的評(píng)估提供參考，最終給出測(cè)量結(jié)果的置信區(qū)間和置信水平。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 方法原理

試樣中的組胺用高氯酸溶液提取，經(jīng)丹酰氯衍生化后，用液相色譜—紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

1.2 設(shè)備和色譜條件

1.2.1 設(shè)備

AgiLent高效液相色譜儀1200：配有紫外檢測(cè)器；離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速5 000 r/min；均質(zhì)機(jī)，移液器10μL～100μL和100μL～1 000μL。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：AgiLentC18；流動(dòng)相：A 0.01moL/L乙酸銨；B水+乙腈（10+90）含0.01moL/L乙酸銨；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量：10μL。

1.3 測(cè)定步驟

稱(chēng)取2 g樣品，精確至0.01 g，置于50mL離心管中，加入10 mL 0.4 moL/L高氯酸溶液，均質(zhì)1 min，4 000 r/min離心5min，上清液移入25mL容量瓶中，沉淀物用10mL 0.4moL/L高氯酸溶液重復(fù)提取1次，合并上清液，用0.4moL/L高氯酸定容至刻度。取1.0mL提取液加入5m L容量瓶中，依次加入0.1m L 2moL/L氫氧化鈉溶液、0.3mL飽和碳酸氫鈉溶液和2mL 10mg/mL丹酰氯溶液，蓋塞，于40℃避光反應(yīng)45min，然后加入0.1mL 25%～28%氫氧化銨，靜置30min，用乙腈定容到刻度，取1mL過(guò)0.45μm濾膜進(jìn)樣，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。自動(dòng)進(jìn)樣器吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液10μL注入進(jìn)樣口，制得色譜圖。校準(zhǔn)曲線取5個(gè)濃度點(diǎn)，重復(fù)兩次進(jìn)樣，以峰面積響應(yīng)值對(duì)標(biāo)樣濃度繪制工作曲線，外標(biāo)法定量，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)平均峰面積。同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)，測(cè)量?jī)煞輼悠?，將樣品平均峰面積和標(biāo)準(zhǔn)平均峰面積比較計(jì)算。

2 數(shù)學(xué)模型

式中：X為樣品中組胺的含量，（mg/kg）；C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中組胺的濃度，（μg/mL）；V為試樣溶液定容體積，mL；m為最終試樣溶液所代表的試樣質(zhì)量，g。

3 不確定度來(lái)源及其評(píng)定

3.1 不確定度分量來(lái)源及構(gòu)成圖

根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程及數(shù)據(jù)模型分析，組胺含量測(cè)定的測(cè)量不確定度來(lái)源主要包括：測(cè)量重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、線性最小二乘法擬合曲線引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配置的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。其中，標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的不確定度由兩個(gè)部分組成。一部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身引起的不確定度；另一部分是標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程引起的不確定度，其中包括玻璃量器容量誤差引起的不確定度、定容體積、溫度的變動(dòng)以及天平稱(chēng)重引起的不確定度。具體構(gòu)成如圖1所示。

圖1 不確定度分量來(lái)源及構(gòu)成圖Fig.1 Sources of uncertainty components and structural diagram

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置引入的不確定度

3.2.1 質(zhì)量引起的不確定度

3.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的不確定度

組胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)標(biāo)明的純度為99%，不確定度為0.5%，按正態(tài)分布，擴(kuò)展因子K=3，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1reL=0.5/3×99=0.001 7

3.2.1.2 天平稱(chēng)重的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

用1/1 000天平稱(chēng)量0.016 57 g標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，證書(shū)給出：0≤M≤50 g稱(chēng)量誤差為±0.000 1 g，按矩陣分布考慮，擴(kuò)展因子。

3.2.2 溫度的變動(dòng)引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度是在20℃條件下標(biāo)定的，假設(shè)實(shí)驗(yàn)室溫度變化介于±2℃之間，按矩陣分布考慮，擴(kuò)展因子，水20℃的膨脹系數(shù)為2.1×10-4。

3.2.3 體積測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.2.3.1 定容體積引起的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液用10mL的容量瓶定容，根據(jù)JJG196-2006《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》，A級(jí)10mL容量瓶的最大允差為±0.02mL，按矩陣分布考慮。

3.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

配置標(biāo)準(zhǔn)溶液使用到1 000μL和100μL的移液器，根據(jù)檢定證書(shū)得知1 000μL的移液器不確定度為0.5%，100μL的移液器不確定度為0.1%，按矩形分布考慮。

體積測(cè)量引起的不確定度

因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液配置的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3 測(cè)量重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度

測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性主要受樣品處理過(guò)程操作的一致性、樣品均勻性和儀器性能的影響，屬于A類(lèi)評(píng)定，可以通過(guò)取標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度加標(biāo)測(cè)定，測(cè)定10個(gè)相同濃度標(biāo)樣的樣品，檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表1。

單次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差按下式計(jì)算：

在日常的分析中，測(cè)量?jī)煞輼悠?，?bào)告平均值。兩次測(cè)量結(jié)果平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：

表1 相同濃度的10個(gè)標(biāo)樣檢測(cè)結(jié)果Table 1 The same concentration of10 standard test results

此分量綜合體現(xiàn)了測(cè)量?jī)x器、體積測(cè)量、質(zhì)量測(cè)量和回收率等各方面的隨機(jī)影響。因此，在評(píng)定其它分量時(shí)不再考慮這些隨機(jī)影響。

3.4 定容后溶液濃度預(yù)估值的不確定度評(píng)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線取5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)進(jìn)樣2次，結(jié)果如表2。

表2 重復(fù)2次測(cè)5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的峰面積Table2 Repeat two times five standard points measured peak area

標(biāo)準(zhǔn)曲線一次方程為：Y=20.329X+4.585 7

樣品精制濃縮液定容后的濃度通過(guò)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線確定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按下式計(jì)算

式中：p為試樣平行測(cè)量次數(shù)；n為擬合直線的數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)；y為試樣測(cè)量響應(yīng)值（p個(gè)）的平均值；y為繪制擬合曲線響應(yīng)值（n個(gè)）的平均值；xp為試樣測(cè)量預(yù)估值；x為繪制擬合直線輸入值xi（n個(gè)）的總平均值；yi-yfi為是輸入值為xi時(shí)，儀器響應(yīng)值與擬合直線上對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值之差。

把xi分別代入Y=20.329X+4.5857得yfi，則。在本測(cè)量中，試樣測(cè)量響應(yīng)值y1=400.7，y2=392.5。利用擬合直線計(jì)算得到精致濃縮液定容后濃度：xp=19.3μg/mL。n=10，p=2，。

把相關(guān)數(shù)據(jù)代入上述公式計(jì)算得到由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：s（xp）=0.235 4μg/m L。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4 不確定度分量列表

測(cè)定水產(chǎn)品中組胺含量不確定度各影響量的相對(duì)不確定度見(jiàn)表3。

表3 水產(chǎn)品中組胺測(cè)量不確定度分量Table3 Aquatic histamine measurement uncertainty components

5 合成不確定度

標(biāo)樣中組胺含量X的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定計(jì)算如下：

6 擴(kuò)展不確定度

置信區(qū)間95%，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度為：U（X）=k×uc（X）=2×4.2=8.4mg/kg

7 結(jié)果報(bào)告

用高效液相色譜—紫外檢測(cè)法按GB/T 20768—2006規(guī)定的條件測(cè)定水產(chǎn)品中組胺的含量為（235.0± 8.4）mg/kg，包含因子k=2（95%置信區(qū)間）。

8 討論

從上述不確定度的評(píng)定分析得知，本方法測(cè)量結(jié)果的不確定度主要來(lái)源有三部分，其中，重復(fù)測(cè)量和擬合曲線引入的不確定度較為顯著，為主要來(lái)源。因此，在測(cè)量過(guò)程中，通過(guò)提高操作人員的檢測(cè)水平和熟練程度，保證樣品前處理過(guò)程的平行性，增加曲線中濃度點(diǎn)數(shù)值等措施，減小不確定度的數(shù)值，可獲得較為可靠的檢測(cè)結(jié)果。

[1]中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS-GL06:2006化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[M].北京:中國(guó)計(jì)量出版社,2006

[2] 國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJF1059-1999測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[M].北京:中國(guó)計(jì)量出版社,1999

[3] 國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJG196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京:中國(guó)計(jì)量出版社,2007

[4]中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 20768-2006魚(yú)和蝦中有毒生物胺的測(cè)定液相色譜-紫外檢測(cè)法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006

[5]曹玲,吳嫣艷,張妤琳,等.高效液相色譜法測(cè)定保健食品中西地那非的不確定度評(píng)定[J].廣州:現(xiàn)代食品科技,2012,28(7):890-893

[6]趙中輝,林洪,王林,等.常見(jiàn)水產(chǎn)品中生物胺的調(diào)查及分析[J].水產(chǎn)科學(xué),2012,31(6):363-366

Determination of Histamine Content Aquatic Evaluation of Uncertainty by HPLC

HU Li-yuan，SUN Gao-ying，LIAO He-jing
（Dongxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongxing 538100，Guangxi，China）

According to GB/T 20768-2006 toxic biogenic amines in fish and shrimp measurement principle，the establishment of Uncertainty mathematical model to evaluate the method in the analysis of the sources of uncertainty，calculate the detection process introduced various uncertainty component，and calculate test results combined uncertainty and expanded uncertainty.

HPLC；histamine；uncertainty

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.028

2013-08-16

胡禮淵（1979—），男（漢），助理工程師，主要從事水產(chǎn)品檢測(cè)工作。