• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新型核殼型親水聚合物-硅膠雜化填料的合成及其在蛋白質N-糖鏈富集中的應用

    2015-12-26 01:58:26白海紅沈丙權鄧玉林潘一廷秦偉捷錢小紅
    色譜 2015年3期
    關鍵詞:糖鏈糖蛋白雜化

    白海紅, 范 超, 沈丙權, 田 芳, 鄧玉林,潘一廷 , 秦偉捷* , 錢小紅

    (1. 北京理工大學生命學院,北京100081;2. 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所,北京蛋白質組研究中心,蛋白質組學國家重點實驗室,北京102206;3. 北京石油化工學院化學工程學院,北京102617)

    N-糖基化修飾作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾,參與了幾乎所有重要的生理過程,例如受精、發(fā)育、免疫應答、細胞間識別及通訊等[1,2]。蛋白質N-糖鏈的組成和結構對糖基化蛋白質的構象、功能以及與其他生物分子的相互作用都具有巨大的影響。大量研究表明,多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都伴隨著蛋白質N-糖鏈組成和結構的改變,如腫瘤、自身免疫疾病、糖尿病等[3,4]。因此,發(fā)展高通量、高靈敏度的蛋白質N-糖鏈鑒定技術對于闡明糖鏈在各個生理過程和疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及篩選臨床診斷標志物尤為重要。但是N-糖鏈本身含量有限,并具有高度微不均一性,同時質譜分析信號易受高豐度蛋白質、肽段、核酸及鹽類等的干擾[5],因此,對N-糖鏈進行高效、高選擇性的富集是實現(xiàn)其高靈敏度鑒定的必要前提。

    目前常用的N-糖鏈富集方法主要有凝集素法[6,7]、硼酸富集法[8,9]及親水相互作用色譜法[10,11]等。其中,親水相互作用色譜法利用較強親水性的N-糖鏈可以與氨基、酰胺基、羥基等親水基團形成氫鍵、偶極作用和靜電相互作用的特性,使用鍵合了親水基團的色譜填料有效保留糖鏈,達到特異性富集并與蛋白質和多肽分離的目的。常用的親水填料一般是在硅膠填料表面鍵合單層兩性離子、乙二醇結構或酰胺等基團,但其親水性有限,對于復雜樣品中低豐度N-糖鏈的分離富集選擇性不高[12,13]。我們利用表面引發(fā)-原子轉移自由基聚合(SI-ATRP)方法,以帶有雙鍵的氨基葡萄糖為單體(GMAG),成功制備了新型核殼型親水聚合物-硅膠雜化填料(pGMAG-SiO2),并將其用于麥芽七糖(DP7)、雞卵清蛋白(OVA)的N-糖鏈及人血漿中糖蛋白N-糖鏈的富集。SI-ATRP 方法可以在硅膠填料表面原位接枝高密度的聚合物,形成致密的親水聚合物層。由于聚糖結構含有大量的羥基,在保持了硅膠填料較好的機械強度的同時,顯著提高了填料的親水性,有利于N-糖鏈的富集。本文以DP7 和OVA 的N-糖鏈為研究對象,考察了pGMAG-SiO2填料對N-糖鏈的富集效果,并將該填料用于人血漿中糖蛋白N-糖鏈的富集,共鑒定到47 種糖型。以上結果說明該填料可用于復雜生物樣本中蛋白質N-糖鏈的高選擇性富集,并有助于提高糖蛋白質組數(shù)據(jù)的全面性。

    1 實驗部分

    1.1 試劑和儀器

    OVA 和胰蛋白酶(Trypsin,15 276 u/mg)購自美國Promega 公司;N-糖苷酶F(PNGase F)購自英國New England Biolabs 公司;2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、三氟乙酸(TFA)、甲酸(FA)、DP7、三甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA),N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺、氨基葡萄糖鹽酸鹽、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-APTES)、氰基硼氫化鈉、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)和5-甲氧基水楊酸均購自美國Sigma 公司;硅球(粒徑10 μm,孔徑20 nm)購于天津艾杰爾公司;去離子水由Milli-Q A10 純水系統(tǒng)制備;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。人血漿由中國人民解放軍空軍總醫(yī)院提供。

    掃描電子顯微鏡(S4800 Field-Emission SEM):工作電壓為20 kV;熱重分析儀(SDT Q600,美國TA 公司):升溫速率5 ℃/min,氮氣保護。

    基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)儀(4800 Proteomic Analyzer,AB SCIEX)用于糖鏈檢測:數(shù)據(jù)采集模式為正離子反射模式(positive reflector mode),加速電壓20 kV,掃描范圍為m/z 900 ~3 000,激光能量為6 000,總激光發(fā)射脈沖次數(shù)為1 000,將質譜圖平均累計得到最終的質譜圖。在進行數(shù)據(jù)采集之前,用馬心肌紅蛋白(Myo)的胰蛋白酶酶解肽段作為標準物校準儀器,使其絕對準確度達到0.1 Da,相對標準偏差達到10×10-6(10 ppm)。用Date Explorer Software 4.5進行譜圖分析?;|為10 mg/mL 2,5-二羥基苯甲酸的50% (v/v)乙腈和50% (v/v)的0.1% 三氟乙酸溶液。取1 μL 待分析樣品置于不銹鋼板上使其自然風干,然后取1 μL 基質使樣品充分結晶以待分析。將MALDI-TOF MS 生成的原始文件上傳到由Haslam 等[14]編寫的軟件GlycoWorkbench,以確定糖鏈結構。將實驗所得的質譜峰和Carbbank 庫(美國復合糖研究中心(CCRC)創(chuàng)建)中收錄的糖鏈的m/z 值進行匹配,得到糖鏈的結構,最后將所有匹配的糖型結構采用報告的形式呈現(xiàn)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 pGMAG-SiO2的制備

    首先制備GMAG,具體步驟如下:將1 mL GMA 和0.2 mol/L 硫酸混合后置于50 ℃水浴中加熱4 h,加入終濃度為10 mmol/L 的高碘酸鈉,室溫下避光放置1 h。將處理好的GMA 逐滴加到溶解有0.4 g 氫氧化鈉和2 g 氨基葡萄糖鹽酸鹽的20 mL 甲醇中,同時加入10 mmol NaBH3CN,攪拌直至溶液變?yōu)辄S色透明液,減壓蒸干至膏狀,密閉充氮氣后放置于4 ℃下保存。

    然后制備pGMAG-SiO2雜化填料,具體步驟如下:引發(fā)劑制備參照文獻[15,16]中描述的步驟進行。在硅膠顆粒(粒徑10 μm,孔徑20 nm)中加入1 mol/L 的鹽酸(按1 g 硅膠顆粒中加入10 mL 1 mol/L 鹽酸的比例),超聲處理30 min,浸泡12 h 后用去離子水洗滌數(shù)次,直至pH 為中性。離心去除液體并將所得硅膠顆粒在80 ℃真空干燥箱中放置3 h。將處理后的硅膠與引發(fā)劑混合過夜,然后用甲醇清洗數(shù)次,加入ATRP 反應液(0.01 mol/L CuCl,0.015 mol/L N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺,0.001 mol/L CuCl2和2 mol/L GMAG),室溫下反應24 h。聚合反應結束后,用甲醇清洗以去除未反應的反應物和其他雜質。將制備得到的pGMAG-SiO2雜化填料在真空下干燥后備用。

    1.2.2 糖蛋白N-糖鏈的制備

    標準糖蛋白:將0.1 mg OVA 溶解于0.1 mL 50 mmol/L NH4HCO3溶液(pH 7.8)中,在95 ℃水浴中加熱10 min,冷卻后加入PNGase F 酶(按0.1 mg蛋白質對應10 U 酶的比例),于37 ℃下放置12 h,得到其N-糖鏈。

    人血漿樣品:將人血漿在4 ℃、16 000 g 離心力下離心30 min 除脂。然后使用50 mmol/L NH4HCO3溶液將其蛋白質的質量濃度稀釋至1 mg/mL。余下操作同標準糖蛋白N-糖鏈的制備。

    1.2.3 pGMAG-SiO2雜化填料富集純化N-糖鏈

    使用pGMAG-SiO2填料自制固相萃取柱用于DP7 寡糖和N-糖鏈的富集,主要操作步驟如下:稱取1 ~2 mg pGMAG-SiO2填料,用乙腈分散后裝填于200 μL 的tip 頭中;將填充的小柱活化平衡好之后,將糖鏈用乙腈/水(80 ∶20,v/v)溶液溶解,慢慢注入小柱中;隨后用100 μL 乙腈/水/甲酸(80 ∶20 ∶0.1,v/v/v)淋洗小柱3 次以去除蛋白質和其他非極性物質;最后用乙腈/水/甲酸(10 ∶90 ∶0.1,v/v/v)洗脫劑洗脫糖鏈,并將洗脫液置于MALDI-TOF MS 樣品靶上,加入基質進行質譜分析。

    2 結果與討論

    2.1 pGMAG-SiO2 的制備與表征

    2.1.1 pGMAG-SiO2的掃描電鏡譜圖

    首先,將單體GMA 上的環(huán)氧基氧化為醛基,利用醛基和氨基葡萄糖上氨基的共價反應制備帶有雙鍵可用于ATRP 反應的含糖單體GMAG。然后,合成SI-ATRP 引發(fā)劑,該引發(fā)劑一端為ATRP 引發(fā)劑,另一端為能與硅膠填料表面鍵合的硅烷偶聯(lián)劑,可以利用硅烷偶聯(lián)劑與硅膠填料表面的硅羥基共價連接,將SI-ATRP 引發(fā)劑固定在硅膠顆粒表面。最后,以GMAG 為單體,氯化亞銅為催化劑,N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺為配體,在硅膠顆粒表面引發(fā)ATRP 反應原位生成葡萄糖聚合物鏈,制備新型核殼型親水聚合物-硅膠雜化填料pGMAGSiO2。利用掃描電鏡對聚合物修飾的硅膠顆粒和沒有處理的硅膠顆粒進行表征。從圖1 中可以看出,未經(jīng)修飾的硅膠顆粒表面比較光滑,經(jīng)過聚合物修飾之后的顆粒表面粗糙度增加。證明通過SI-ATRP 方法在硅膠顆粒表面成功修飾了親水聚合物。

    圖1 (a)未經(jīng)修飾的硅膠顆粒和(b)pGMAG-SiO2顆粒的掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of (a)bare silica particles and (b)pGMAG-SiO2 particles

    2.1.2 熱重分析

    pGMAG-SiO2填料包含可熱分解的聚合物層和不可熱分解的硅膠顆粒兩部分。從圖2 可看出,未經(jīng)任何處理的硅膠填料在40 ~990 ℃溫度范圍內隨熱處理溫度的提高無明顯的質量損失;而經(jīng)親水聚合物修飾的硅膠雜化填料隨熱處理溫度的提高,質量損失高達20%,這是硅膠上的pGMAG 聚合物熱分解所導致的。這證明通過SI-ATRP 法可以在硅膠填料表面原位聚合生成大量的親水聚合物pGMAG。大量羥基的存在增強了pGMAG-SiO2雜化填料的親水性,從而提高了其對N-糖鏈的保留作用,有望對N-糖鏈有高效的富集。

    圖2 未經(jīng)修飾的硅膠填料和pGMAG-SiO2 雜化填料的熱重分析圖Fig.2 Thermogravimetric analysis of bare silica microparticles and pGMAG-SiO2 packing

    2.2 pGMAG-SiO2 對糖蛋白N-糖鏈的富集

    基于pGMAG-SiO2雜化填料的蛋白質N-糖鏈富集路線如圖3 所示。將蛋白質變性后,使用PNGase F 酶將糖鏈釋放,隨后用pGMAG-SiO2雜化填料對N-糖鏈進行富集,將蛋白質、多肽和其他雜質淋洗去除后,洗脫糖鏈并進行質譜鑒定。

    圖3 基于pGMAG-SiO2 雜化填料的糖蛋白N-糖鏈富集路線圖Fig.3 Schematic diagram of N-glycan enrichment by pGMAG-SiO2 packing

    2.2.1 pGMAG-SiO2對標準寡糖樣品的富集

    首先使用標準寡糖DP7 評價了該親水填料在微量糖鏈富集鑒定中應用的可能性。按照圖3 所示流程,將1 μg DP7 上樣、淋洗、洗脫后進行MALDITOF MS 鑒定。富集前DP7 的質譜絕對信號強度為2.4×104(m/z 1 175.0)(見圖4a);使用乙腈/水/甲酸(80 ∶20 ∶0.1,v/v/v)淋洗之后,淋洗液在m/z 1 175處只有極弱的質譜峰(見圖4b);使用乙腈/水/甲酸(10 ∶90 ∶0.1,v/v/v)洗脫后,在m/z 1 175 處觀測到較強的質譜峰信號(見圖4c),且信號強度和富集前相差不多。這說明糖鏈可以在高比例的有機相條件下通過親水相互作用保留在該親水性硅膠雜化填料上,在高比例水相的條件下被洗脫,因此可以濃縮糖鏈樣品提高質譜檢測的信號強度。同時我們也考察了糖鏈在pGMAG-SiO2填料上的回收率,通過測定不同濃度的DP7 在m/z 1 175 處對應的質譜峰面積,建立標準曲線,使用外標法計算得到pGMAGSiO2雜化填料對DP7 的回收率為91.2%,說明pGMAG-SiO2雜化填料對糖鏈具有較高的回收率。

    圖4 DP7 經(jīng)(a)pGMAG-SiO2 雜化填料富集前、(b)淋洗液和(c)富集后的MALDI-TOF MS 譜圖Fig.4 MALDI-TOF MS spectra of DP7 (a)before enrichment,(b)washing and (c)after enrichment by pGMAG-SiO2 packing

    2.2.2 pGMAG-SiO2對標準糖蛋白N-糖鏈的富集

    為了進一步評價pGMAG-SiO2雜化填料在糖蛋白N-糖鏈富集檢測中的應用,我們對標準糖蛋白上釋放的N-糖鏈進行了富集檢測。使用PNGase F釋放OVA 標準糖蛋白的N-糖鏈,經(jīng)pGMAG-SiO2雜化填料富集之后進行MALDI-TOF MS 分析。從圖5a 可以看出,未經(jīng)任何富集處理只能檢測到14個糖鏈對應的質譜峰,且信號強度較弱,信噪比(S/N)較低。經(jīng)過pGMAG-SiO2雜化填料富集后可以鑒定到21 個糖鏈(對應的糖型結構見表1),與文獻[17]報道數(shù)量一致,并且信號強度較強,S/N 較高(見圖5b)。對于富集前、后均檢測到的糖型信號,富集后的信號強度為富集之前的1 ~9.7 倍(見表1)。以上數(shù)據(jù)證明了pGMAG-SiO2雜化填料由于包裹了致密的葡萄糖聚合物層,具有較強的親水性,對不同糖型的N-糖鏈均有良好的保留能力,適用于N-糖鏈的無偏性富集鑒定。

    圖5 OVA 的N-糖鏈經(jīng)pGMAG-SiO2(a)富集前和(b)富集后的MALDI-TOF MS 譜圖Fig.5 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans from OVA (a)before and (b)after enrichment by pGMAG-SiO2 packing

    表1 pGMAG-SiO2 富集前、后質譜鑒定到的OVA 的N-糖鏈的糖型Table 1 Identified N-glycoforms of OVA before and after enrichment by pGMAG-SiO2

    2.2.3 pGMAG-SiO2用于人血漿中糖蛋白N-糖鏈的富集

    已經(jīng)有文獻報道,人血漿中糖蛋白的糖型結構改變和多種癌癥的發(fā)生有密切關系,例如乳腺癌、前列腺癌及肝癌等[18-20]。因此鑒定人血漿中糖蛋白的N-糖鏈結構有利于發(fā)現(xiàn)多種癌癥診斷生物標志物,為這些疾病的臨床研究及藥物研發(fā)提供有價值的數(shù)據(jù)。對血漿糖蛋白經(jīng)PNGase F 酶解釋放的N-糖鏈直接進行MALDI-TOF MS 檢測,只能鑒定到11 種糖型,并且信號強度較差,S/N 較低(見圖6a)。使用本文制備的新型核殼型pGMAG-SiO2雜化填料富集后,可以鑒定到47 種糖型(見圖6b),包含了N-糖鏈的3 種糖型構型(高甘露糖型、復合型和雜合型),比文獻報道的42 種糖型有所增加[21]。而且信號強度和S/N 也得到顯著改善,例如,MALDI-TOF MS 譜圖中的m/z 1 647.7 質譜峰對應的是IgG 釋放的N-糖鏈Hex4HexNAc4Fuc1,經(jīng)過該親水填料富集之后S/N 提高了16 倍。N-糖鏈質譜信號和信噪比的提高得益于該親水雜化填料能夠有效濃縮富集N-糖鏈,且在富集的同時又能夠有效去除血漿樣品中的非極性雜質(如蛋白質及多肽等),降低了其對N-糖鏈質譜信號的抑制。以上結果進一步說明了該親水雜化填料可以用于復雜生物樣本中N-糖鏈的高效且無偏性富集。

    圖6 人血漿糖蛋白N-糖鏈經(jīng)pGMAG-SiO2(a)富集前和(b)富集后的MALDI-TOF MS 譜圖Fig.6 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans from human plasma proteins

    3 結論

    采用SI-ATRP 反應在硅膠表面原位生成親水葡萄糖聚合物層,成功制備了新型核殼型葡萄糖聚合物-硅膠雜化填料。由于葡萄糖親水聚合物的修飾,該填料具有高度親水性,特別適合親水作用色譜(HILIC)模式下糖鏈的富集分離。該雜化填料已被成功應用于標準糖蛋白和復雜生物樣本中糖蛋白的N-糖鏈富集,從人血漿糖蛋白中成功富集鑒定到47種糖型,顯示了其在糖蛋白質組學研究中的應用潛力。

    [1] Zaia J. Nat Methods,2011,8(1):55

    [2] Lau K S,Partridge E A,Grigorian A,et al. Cell,2007,129(1):123

    [3] Balog C I A,Stavenhagen K,F(xiàn)ung W L J,et al. Mol Cell Proteomics,2012,11(9):571

    [4] Robajac D,Masnikosa R,F(xiàn)ilimonovic D,et al. J Med Biochem,2012,31(3):205

    [5] Anderson N L,Anderson N G. Mol Cell Proteomics,2002,1(11):845

    [6] Ruiz-May E,Hucko S,Howe K J,et al. Mol Cell Proteomics,2014,13(2):566

    [7] Ruiz-May E,Catalá C,Rose J K. Methods Mol Biol,2014,1072:633

    [8] Xu Y,Bailey U M,Punyadeera C,et al. Rapid Commun Mass Spectrom,2014,28(5):471

    [9] Zhang Y T,Ma W F,Li D,et al. Small,2014,10(7):1379

    [10] Wan H H,Yan J Y,Yu L,et al. Analyst,2011,136(21):4422

    [11] Ma C,Pan Y T,Zhang Q,et al. Chinese Journal of Chromatography (馬成,潘一廷,張琪,等. 色譜),2013,31(11):1057

    [12] Regnier F E,Noel R. J Chromatogr Sci,1976,14:316

    [13] Jackowska M,Bocian S,Buszewski B. Analyst,2012,137(19):4610

    [14] Tissot B,Ceroni A,Powell A K,et al. Anal Chem,2008,80(23):9204

    [15] Song Z F,Zhang Q L,Zhang Y J,et al. Chinese Journal of Chromatography (宋子鳳,張慶林,張養(yǎng)軍,等. 色譜),2012,30(6):549

    [16] Fan C,Song Z F,Qin W J,et al. Chinese Journal of Chromatography (范超,宋子鳳,秦偉捷,等. 色譜),2013,31(5):423

    [17] Lattova E,Perreault H N,Krokhin O,et al. J Am Soc Mass Spectrom,2004,15(5):725

    [18] Zhong Y,Shen S,Zhou Y D,et al. Med Oncol,2014,31(3):864

    [19] Vermassen T,Speeckaert M M,Lumen N,et al. Clin Chim Acta,2012,413(19/20):1500

    [20] Lai Q,Avolio A W,Graziadei I,et al. J Hepatol,2014,60(6):1332

    [21] Bereman M S,Young D D,Deiters A,et al. J Proteome Res,2009,8(7):3764

    猜你喜歡
    糖鏈糖蛋白雜化
    基于FFPE組織切片的膀胱癌N-連接糖鏈原位酶解及分析*
    精準捕獲“糖鏈”有助揭示病毒侵染機制
    植物N-糖鏈檢測技術研究進展
    α-細辛腦脂質聚合物雜化納米粒的制備及表征
    制川烏、白芍配伍對大鼠海馬區(qū)P-糖蛋白表達的影響
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:03:56
    天然海藻色素糖蛋白誘導Hela細胞凋亡作用
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:20
    尿al-酸性糖蛋白在早期糖尿病腎病診斷中的應用價值
    花生致敏糖蛋白Ara h1糖鏈決定簇的質譜分析
    元素雜化阻燃丙烯酸樹脂的研究進展
    中國塑料(2016年1期)2016-05-17 06:13:00
    化學教學中的分子雜化軌道學習
    国产高清三级在线| 岛国在线观看网站| 在线国产一区二区在线| 99久久精品一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日日夜夜操网爽| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久精品国产综合久久久| 中文资源天堂在线| 亚洲午夜理论影院| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美区成人在线视频| 一区二区三区激情视频| av在线蜜桃| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日韩免费av在线播放| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲精品一区av在线观看| 色在线成人网| 国产99白浆流出| 波野结衣二区三区在线 | 久久久久精品国产欧美久久久| 成人18禁在线播放| 中文在线观看免费www的网站| 免费观看精品视频网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 成年女人永久免费观看视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久香蕉国产精品| 免费看美女性在线毛片视频| 日本免费a在线| av在线天堂中文字幕| 亚洲国产欧美人成| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 中国美女看黄片| 黄色片一级片一级黄色片| 午夜福利成人在线免费观看| 精品久久久久久久久久久久久| 99精品在免费线老司机午夜| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| av中文乱码字幕在线| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲无线在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产69精品久久久久777片| 午夜久久久久精精品| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 看黄色毛片网站| 精品久久久久久成人av| 少妇的丰满在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲成人久久爱视频| 久久久久久九九精品二区国产| 午夜两性在线视频| 黄色日韩在线| 无限看片的www在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 狂野欧美激情性xxxx| 国产成人欧美在线观看| 一进一出抽搐动态| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| av女优亚洲男人天堂| tocl精华| 欧美成狂野欧美在线观看| 日本 欧美在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品电影一区二区在线| 99视频精品全部免费 在线| 国语自产精品视频在线第100页| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产精品 欧美亚洲| 亚洲av不卡在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 精品无人区乱码1区二区| 男插女下体视频免费在线播放| 哪里可以看免费的av片| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产久久久一区二区三区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 99久久精品国产亚洲精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久6这里有精品| 国产高清有码在线观看视频| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲国产欧美人成| 日韩欧美免费精品| 少妇的逼好多水| 久久久久久大精品| 久久久久九九精品影院| 亚洲最大成人手机在线| 极品教师在线免费播放| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 十八禁网站免费在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 免费人成在线观看视频色| 人人妻人人看人人澡| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产黄片美女视频| 国产视频一区二区在线看| av在线蜜桃| 悠悠久久av| 免费看a级黄色片| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲国产欧美人成| 91在线精品国自产拍蜜月 | 窝窝影院91人妻| 人人妻人人看人人澡| 国产精品乱码一区二三区的特点| av天堂中文字幕网| 精品国产亚洲在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品 欧美亚洲| av片东京热男人的天堂| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产伦人伦偷精品视频| 在线免费观看的www视频| 欧美又色又爽又黄视频| 国产老妇女一区| 国产伦一二天堂av在线观看| 两个人看的免费小视频| 久久久国产成人精品二区| 毛片女人毛片| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜免费观看网址| 久久人人精品亚洲av| 又紧又爽又黄一区二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 两人在一起打扑克的视频| 日韩欧美精品免费久久 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 日本一本二区三区精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品影院久久| 9191精品国产免费久久| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲无线在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| av国产免费在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 看片在线看免费视频| 狂野欧美激情性xxxx| 在线观看日韩欧美| 露出奶头的视频| www.色视频.com| 身体一侧抽搐| 波野结衣二区三区在线 | 内射极品少妇av片p| 国内精品久久久久精免费| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美日韩福利视频一区二区| 日本a在线网址| 久久精品国产清高在天天线| 91av网一区二区| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美日韩国产亚洲二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 99热这里只有精品一区| 国产精华一区二区三区| 亚洲无线在线观看| 亚洲激情在线av| 精品电影一区二区在线| www国产在线视频色| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲内射少妇av| 国产男靠女视频免费网站| 欧美日韩精品网址| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品精品国产色婷婷| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国产久久久一区二区三区| 亚洲国产色片| 欧美在线一区亚洲| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品98久久久久久宅男小说| 看免费av毛片| 国产色爽女视频免费观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产视频一区二区在线看| xxx96com| 久久草成人影院| 午夜激情福利司机影院| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美在线一区亚洲| 成年女人永久免费观看视频| 色吧在线观看| 美女黄网站色视频| 无遮挡黄片免费观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| www日本在线高清视频| 香蕉久久夜色| 黄色日韩在线| 欧美最新免费一区二区三区 | 波多野结衣高清无吗| 亚洲中文字幕日韩| 小说图片视频综合网站| 免费av不卡在线播放| 一本综合久久免费| 成人性生交大片免费视频hd| 国产真实乱freesex| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲精华国产精华精| 18禁在线播放成人免费| 超碰av人人做人人爽久久 | 少妇的逼水好多| 午夜精品一区二区三区免费看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 又爽又黄无遮挡网站| 日本黄色片子视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产一区二区在线av高清观看| 国产一区二区在线av高清观看| 国产精品一及| 久久精品国产自在天天线| 无限看片的www在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久久久性生活片| 久99久视频精品免费| 国产精华一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 91在线精品国自产拍蜜月 | 久久精品国产自在天天线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 色哟哟哟哟哟哟| 不卡一级毛片| 亚洲专区国产一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 怎么达到女性高潮| 一级毛片女人18水好多| 亚洲人成网站高清观看| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 美女cb高潮喷水在线观看| 一级作爱视频免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲男人的天堂狠狠| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产成人福利小说| 女人被狂操c到高潮| 一进一出好大好爽视频| 在线免费观看的www视频| 久久99热这里只有精品18| 精品国产美女av久久久久小说| 久久精品国产自在天天线| 麻豆成人av在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲国产精品合色在线| 免费av不卡在线播放| 一级黄色大片毛片| 少妇高潮的动态图| 一个人看视频在线观看www免费 | 午夜福利成人在线免费观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| xxxwww97欧美| 在线观看日韩欧美| 真人一进一出gif抽搐免费| 日韩亚洲欧美综合| 成人午夜高清在线视频| 免费电影在线观看免费观看| 婷婷六月久久综合丁香| 香蕉av资源在线| 久久99热这里只有精品18| 美女黄网站色视频| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲美女视频黄频| 免费电影在线观看免费观看| 在线免费观看的www视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产主播在线观看一区二区| 两个人的视频大全免费| 日本五十路高清| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产不卡一卡二| 亚洲av免费在线观看| 天堂动漫精品| 天美传媒精品一区二区| 国产美女午夜福利| 老司机午夜福利在线观看视频| 高清在线国产一区| 国产精品一区二区免费欧美| 久久精品国产综合久久久| 欧美高清成人免费视频www| 国产亚洲精品av在线| 国产精品亚洲美女久久久| 日本成人三级电影网站| 婷婷精品国产亚洲av| 国产视频一区二区在线看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 91字幕亚洲| 无遮挡黄片免费观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 九九热线精品视视频播放| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩高清综合在线| 国产精华一区二区三区| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲一区高清亚洲精品| 黄色丝袜av网址大全| 两个人看的免费小视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久性视频一级片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一区二区三区免费毛片| 国产成人影院久久av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久6这里有精品| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲国产色片| 久久久久国内视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 99久久精品国产亚洲精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 久久久久久人人人人人| 日本成人三级电影网站| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产免费一级a男人的天堂| 日韩免费av在线播放| 无遮挡黄片免费观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日本黄色视频三级网站网址| 国产三级中文精品| 在线观看一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产美女午夜福利| 欧美极品一区二区三区四区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 特级一级黄色大片| 一个人看视频在线观看www免费 | 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品久久电影中文字幕| 99热6这里只有精品| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品久久电影中文字幕| 国产色爽女视频免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久久久人人人人人| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 97超视频在线观看视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品熟女少妇八av免费久了| 成人亚洲精品av一区二区| 特大巨黑吊av在线直播| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 99热精品在线国产| 又黄又粗又硬又大视频| 国产视频一区二区在线看| 大型黄色视频在线免费观看| 久久亚洲精品不卡| a级毛片a级免费在线| 国产三级黄色录像| 精品免费久久久久久久清纯| 一级作爱视频免费观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品久久久久久久久久久久久| 日日夜夜操网爽| 99久久九九国产精品国产免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美区成人在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美成人a在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 极品教师在线免费播放| 成人无遮挡网站| 亚洲国产色片| 色av中文字幕| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 哪里可以看免费的av片| 九色成人免费人妻av| 国产av不卡久久| 成人无遮挡网站| 女人被狂操c到高潮| 日日夜夜操网爽| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品色激情综合| 亚洲五月天丁香| 国产日本99.免费观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品久久久久久成人av| 午夜日韩欧美国产| av在线蜜桃| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品免费久久久久久久清纯| 国产成人av教育| 国产 一区 欧美 日韩| 中文资源天堂在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一进一出好大好爽视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黑人欧美特级aaaaaa片| 老司机福利观看| 在线国产一区二区在线| 在线观看66精品国产| 精品福利观看| 成人国产一区最新在线观看| 午夜福利18| 国产精品 国内视频| 国产探花在线观看一区二区| 一区二区三区高清视频在线| 久久久久久国产a免费观看| x7x7x7水蜜桃| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲欧美精品综合久久99| 99久久成人亚洲精品观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 午夜福利高清视频| 国产精品av视频在线免费观看| 一夜夜www| 国产淫片久久久久久久久 | 日本免费a在线| 国产中年淑女户外野战色| 国产成人a区在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 黄色成人免费大全| 一级a爱片免费观看的视频| 变态另类丝袜制服| 最近在线观看免费完整版| 一本精品99久久精品77| 白带黄色成豆腐渣| 国产成人系列免费观看| 69人妻影院| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| av在线蜜桃| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 午夜福利在线观看吧| 特大巨黑吊av在线直播| 日本熟妇午夜| 欧美又色又爽又黄视频| 久久久成人免费电影| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产美女午夜福利| 观看免费一级毛片| 免费av不卡在线播放| 99久久精品热视频| а√天堂www在线а√下载| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 99热这里只有是精品50| av福利片在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品熟女少妇八av免费久了| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲色图av天堂| 草草在线视频免费看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| av片东京热男人的天堂| 少妇的逼水好多| 精品电影一区二区在线| 变态另类丝袜制服| 禁无遮挡网站| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 乱人视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 999久久久精品免费观看国产| 免费在线观看日本一区| 国产三级中文精品| 日本免费a在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 99久久综合精品五月天人人| 无限看片的www在线观看| 国产三级在线视频| 99国产综合亚洲精品| 国产97色在线日韩免费| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 床上黄色一级片| 成人性生交大片免费视频hd| av黄色大香蕉| 99视频精品全部免费 在线| 午夜免费观看网址| 啪啪无遮挡十八禁网站| 99热这里只有精品一区| 99久久九九国产精品国产免费| eeuss影院久久| 欧美在线一区亚洲| 中出人妻视频一区二区| 免费看光身美女| 亚洲自拍偷在线| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲精品在线美女| 久久久成人免费电影| 两个人视频免费观看高清| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日韩精品中文字幕看吧| 又黄又爽又免费观看的视频| 色在线成人网| 一个人免费在线观看电影| 首页视频小说图片口味搜索| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲国产欧美人成| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品综合久久久久久久免费| 观看美女的网站| 看黄色毛片网站| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 久久久国产成人免费| 麻豆成人av在线观看| 夜夜爽天天搞| www日本在线高清视频| 偷拍熟女少妇极品色| 麻豆一二三区av精品| 亚洲熟妇熟女久久| 久久人妻av系列| 免费av毛片视频| 国产久久久一区二区三区| 亚洲国产精品999在线| 免费在线观看成人毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成年人黄色毛片网站| 午夜两性在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 中文资源天堂在线| 久久久国产精品麻豆| 国产高清三级在线| 亚洲美女视频黄频| 欧美极品一区二区三区四区| 在线视频色国产色| 免费看日本二区| 日本五十路高清| 99热6这里只有精品| 亚洲 国产 在线| 成人av在线播放网站| 一区二区三区高清视频在线| 久久性视频一级片| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 伊人久久精品亚洲午夜| 日韩欧美免费精品| 特级一级黄色大片| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产亚洲精品av在线| 听说在线观看完整版免费高清| 波多野结衣巨乳人妻| 中文字幕熟女人妻在线| 成人精品一区二区免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 美女被艹到高潮喷水动态| 一二三四社区在线视频社区8| 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费电影在线观看免费观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 丁香欧美五月| 国产精品久久电影中文字幕| 在线观看一区二区三区| 久久久久性生活片| 最好的美女福利视频网| 国产成人av教育| 亚洲一区二区三区不卡视频| 免费电影在线观看免费观看| 欧美一级毛片孕妇| 婷婷亚洲欧美| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲人与动物交配视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产成人a区在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 女人被狂操c到高潮| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久精品91无色码中文字幕| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲国产欧美人成| 国产精品野战在线观看| 一a级毛片在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲性夜色夜夜综合| svipshipincom国产片|