• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新型核殼型親水聚合物-硅膠雜化填料的合成及其在蛋白質N-糖鏈富集中的應用

    2015-12-26 01:58:26白海紅沈丙權鄧玉林潘一廷秦偉捷錢小紅
    色譜 2015年3期
    關鍵詞:糖鏈糖蛋白雜化

    白海紅, 范 超, 沈丙權, 田 芳, 鄧玉林,潘一廷 , 秦偉捷* , 錢小紅

    (1. 北京理工大學生命學院,北京100081;2. 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所,北京蛋白質組研究中心,蛋白質組學國家重點實驗室,北京102206;3. 北京石油化工學院化學工程學院,北京102617)

    N-糖基化修飾作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾,參與了幾乎所有重要的生理過程,例如受精、發(fā)育、免疫應答、細胞間識別及通訊等[1,2]。蛋白質N-糖鏈的組成和結構對糖基化蛋白質的構象、功能以及與其他生物分子的相互作用都具有巨大的影響。大量研究表明,多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都伴隨著蛋白質N-糖鏈組成和結構的改變,如腫瘤、自身免疫疾病、糖尿病等[3,4]。因此,發(fā)展高通量、高靈敏度的蛋白質N-糖鏈鑒定技術對于闡明糖鏈在各個生理過程和疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及篩選臨床診斷標志物尤為重要。但是N-糖鏈本身含量有限,并具有高度微不均一性,同時質譜分析信號易受高豐度蛋白質、肽段、核酸及鹽類等的干擾[5],因此,對N-糖鏈進行高效、高選擇性的富集是實現(xiàn)其高靈敏度鑒定的必要前提。

    目前常用的N-糖鏈富集方法主要有凝集素法[6,7]、硼酸富集法[8,9]及親水相互作用色譜法[10,11]等。其中,親水相互作用色譜法利用較強親水性的N-糖鏈可以與氨基、酰胺基、羥基等親水基團形成氫鍵、偶極作用和靜電相互作用的特性,使用鍵合了親水基團的色譜填料有效保留糖鏈,達到特異性富集并與蛋白質和多肽分離的目的。常用的親水填料一般是在硅膠填料表面鍵合單層兩性離子、乙二醇結構或酰胺等基團,但其親水性有限,對于復雜樣品中低豐度N-糖鏈的分離富集選擇性不高[12,13]。我們利用表面引發(fā)-原子轉移自由基聚合(SI-ATRP)方法,以帶有雙鍵的氨基葡萄糖為單體(GMAG),成功制備了新型核殼型親水聚合物-硅膠雜化填料(pGMAG-SiO2),并將其用于麥芽七糖(DP7)、雞卵清蛋白(OVA)的N-糖鏈及人血漿中糖蛋白N-糖鏈的富集。SI-ATRP 方法可以在硅膠填料表面原位接枝高密度的聚合物,形成致密的親水聚合物層。由于聚糖結構含有大量的羥基,在保持了硅膠填料較好的機械強度的同時,顯著提高了填料的親水性,有利于N-糖鏈的富集。本文以DP7 和OVA 的N-糖鏈為研究對象,考察了pGMAG-SiO2填料對N-糖鏈的富集效果,并將該填料用于人血漿中糖蛋白N-糖鏈的富集,共鑒定到47 種糖型。以上結果說明該填料可用于復雜生物樣本中蛋白質N-糖鏈的高選擇性富集,并有助于提高糖蛋白質組數(shù)據(jù)的全面性。

    1 實驗部分

    1.1 試劑和儀器

    OVA 和胰蛋白酶(Trypsin,15 276 u/mg)購自美國Promega 公司;N-糖苷酶F(PNGase F)購自英國New England Biolabs 公司;2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、三氟乙酸(TFA)、甲酸(FA)、DP7、三甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA),N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺、氨基葡萄糖鹽酸鹽、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-APTES)、氰基硼氫化鈉、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)和5-甲氧基水楊酸均購自美國Sigma 公司;硅球(粒徑10 μm,孔徑20 nm)購于天津艾杰爾公司;去離子水由Milli-Q A10 純水系統(tǒng)制備;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。人血漿由中國人民解放軍空軍總醫(yī)院提供。

    掃描電子顯微鏡(S4800 Field-Emission SEM):工作電壓為20 kV;熱重分析儀(SDT Q600,美國TA 公司):升溫速率5 ℃/min,氮氣保護。

    基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)儀(4800 Proteomic Analyzer,AB SCIEX)用于糖鏈檢測:數(shù)據(jù)采集模式為正離子反射模式(positive reflector mode),加速電壓20 kV,掃描范圍為m/z 900 ~3 000,激光能量為6 000,總激光發(fā)射脈沖次數(shù)為1 000,將質譜圖平均累計得到最終的質譜圖。在進行數(shù)據(jù)采集之前,用馬心肌紅蛋白(Myo)的胰蛋白酶酶解肽段作為標準物校準儀器,使其絕對準確度達到0.1 Da,相對標準偏差達到10×10-6(10 ppm)。用Date Explorer Software 4.5進行譜圖分析?;|為10 mg/mL 2,5-二羥基苯甲酸的50% (v/v)乙腈和50% (v/v)的0.1% 三氟乙酸溶液。取1 μL 待分析樣品置于不銹鋼板上使其自然風干,然后取1 μL 基質使樣品充分結晶以待分析。將MALDI-TOF MS 生成的原始文件上傳到由Haslam 等[14]編寫的軟件GlycoWorkbench,以確定糖鏈結構。將實驗所得的質譜峰和Carbbank 庫(美國復合糖研究中心(CCRC)創(chuàng)建)中收錄的糖鏈的m/z 值進行匹配,得到糖鏈的結構,最后將所有匹配的糖型結構采用報告的形式呈現(xiàn)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 pGMAG-SiO2的制備

    首先制備GMAG,具體步驟如下:將1 mL GMA 和0.2 mol/L 硫酸混合后置于50 ℃水浴中加熱4 h,加入終濃度為10 mmol/L 的高碘酸鈉,室溫下避光放置1 h。將處理好的GMA 逐滴加到溶解有0.4 g 氫氧化鈉和2 g 氨基葡萄糖鹽酸鹽的20 mL 甲醇中,同時加入10 mmol NaBH3CN,攪拌直至溶液變?yōu)辄S色透明液,減壓蒸干至膏狀,密閉充氮氣后放置于4 ℃下保存。

    然后制備pGMAG-SiO2雜化填料,具體步驟如下:引發(fā)劑制備參照文獻[15,16]中描述的步驟進行。在硅膠顆粒(粒徑10 μm,孔徑20 nm)中加入1 mol/L 的鹽酸(按1 g 硅膠顆粒中加入10 mL 1 mol/L 鹽酸的比例),超聲處理30 min,浸泡12 h 后用去離子水洗滌數(shù)次,直至pH 為中性。離心去除液體并將所得硅膠顆粒在80 ℃真空干燥箱中放置3 h。將處理后的硅膠與引發(fā)劑混合過夜,然后用甲醇清洗數(shù)次,加入ATRP 反應液(0.01 mol/L CuCl,0.015 mol/L N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺,0.001 mol/L CuCl2和2 mol/L GMAG),室溫下反應24 h。聚合反應結束后,用甲醇清洗以去除未反應的反應物和其他雜質。將制備得到的pGMAG-SiO2雜化填料在真空下干燥后備用。

    1.2.2 糖蛋白N-糖鏈的制備

    標準糖蛋白:將0.1 mg OVA 溶解于0.1 mL 50 mmol/L NH4HCO3溶液(pH 7.8)中,在95 ℃水浴中加熱10 min,冷卻后加入PNGase F 酶(按0.1 mg蛋白質對應10 U 酶的比例),于37 ℃下放置12 h,得到其N-糖鏈。

    人血漿樣品:將人血漿在4 ℃、16 000 g 離心力下離心30 min 除脂。然后使用50 mmol/L NH4HCO3溶液將其蛋白質的質量濃度稀釋至1 mg/mL。余下操作同標準糖蛋白N-糖鏈的制備。

    1.2.3 pGMAG-SiO2雜化填料富集純化N-糖鏈

    使用pGMAG-SiO2填料自制固相萃取柱用于DP7 寡糖和N-糖鏈的富集,主要操作步驟如下:稱取1 ~2 mg pGMAG-SiO2填料,用乙腈分散后裝填于200 μL 的tip 頭中;將填充的小柱活化平衡好之后,將糖鏈用乙腈/水(80 ∶20,v/v)溶液溶解,慢慢注入小柱中;隨后用100 μL 乙腈/水/甲酸(80 ∶20 ∶0.1,v/v/v)淋洗小柱3 次以去除蛋白質和其他非極性物質;最后用乙腈/水/甲酸(10 ∶90 ∶0.1,v/v/v)洗脫劑洗脫糖鏈,并將洗脫液置于MALDI-TOF MS 樣品靶上,加入基質進行質譜分析。

    2 結果與討論

    2.1 pGMAG-SiO2 的制備與表征

    2.1.1 pGMAG-SiO2的掃描電鏡譜圖

    首先,將單體GMA 上的環(huán)氧基氧化為醛基,利用醛基和氨基葡萄糖上氨基的共價反應制備帶有雙鍵可用于ATRP 反應的含糖單體GMAG。然后,合成SI-ATRP 引發(fā)劑,該引發(fā)劑一端為ATRP 引發(fā)劑,另一端為能與硅膠填料表面鍵合的硅烷偶聯(lián)劑,可以利用硅烷偶聯(lián)劑與硅膠填料表面的硅羥基共價連接,將SI-ATRP 引發(fā)劑固定在硅膠顆粒表面。最后,以GMAG 為單體,氯化亞銅為催化劑,N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺為配體,在硅膠顆粒表面引發(fā)ATRP 反應原位生成葡萄糖聚合物鏈,制備新型核殼型親水聚合物-硅膠雜化填料pGMAGSiO2。利用掃描電鏡對聚合物修飾的硅膠顆粒和沒有處理的硅膠顆粒進行表征。從圖1 中可以看出,未經(jīng)修飾的硅膠顆粒表面比較光滑,經(jīng)過聚合物修飾之后的顆粒表面粗糙度增加。證明通過SI-ATRP 方法在硅膠顆粒表面成功修飾了親水聚合物。

    圖1 (a)未經(jīng)修飾的硅膠顆粒和(b)pGMAG-SiO2顆粒的掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of (a)bare silica particles and (b)pGMAG-SiO2 particles

    2.1.2 熱重分析

    pGMAG-SiO2填料包含可熱分解的聚合物層和不可熱分解的硅膠顆粒兩部分。從圖2 可看出,未經(jīng)任何處理的硅膠填料在40 ~990 ℃溫度范圍內隨熱處理溫度的提高無明顯的質量損失;而經(jīng)親水聚合物修飾的硅膠雜化填料隨熱處理溫度的提高,質量損失高達20%,這是硅膠上的pGMAG 聚合物熱分解所導致的。這證明通過SI-ATRP 法可以在硅膠填料表面原位聚合生成大量的親水聚合物pGMAG。大量羥基的存在增強了pGMAG-SiO2雜化填料的親水性,從而提高了其對N-糖鏈的保留作用,有望對N-糖鏈有高效的富集。

    圖2 未經(jīng)修飾的硅膠填料和pGMAG-SiO2 雜化填料的熱重分析圖Fig.2 Thermogravimetric analysis of bare silica microparticles and pGMAG-SiO2 packing

    2.2 pGMAG-SiO2 對糖蛋白N-糖鏈的富集

    基于pGMAG-SiO2雜化填料的蛋白質N-糖鏈富集路線如圖3 所示。將蛋白質變性后,使用PNGase F 酶將糖鏈釋放,隨后用pGMAG-SiO2雜化填料對N-糖鏈進行富集,將蛋白質、多肽和其他雜質淋洗去除后,洗脫糖鏈并進行質譜鑒定。

    圖3 基于pGMAG-SiO2 雜化填料的糖蛋白N-糖鏈富集路線圖Fig.3 Schematic diagram of N-glycan enrichment by pGMAG-SiO2 packing

    2.2.1 pGMAG-SiO2對標準寡糖樣品的富集

    首先使用標準寡糖DP7 評價了該親水填料在微量糖鏈富集鑒定中應用的可能性。按照圖3 所示流程,將1 μg DP7 上樣、淋洗、洗脫后進行MALDITOF MS 鑒定。富集前DP7 的質譜絕對信號強度為2.4×104(m/z 1 175.0)(見圖4a);使用乙腈/水/甲酸(80 ∶20 ∶0.1,v/v/v)淋洗之后,淋洗液在m/z 1 175處只有極弱的質譜峰(見圖4b);使用乙腈/水/甲酸(10 ∶90 ∶0.1,v/v/v)洗脫后,在m/z 1 175 處觀測到較強的質譜峰信號(見圖4c),且信號強度和富集前相差不多。這說明糖鏈可以在高比例的有機相條件下通過親水相互作用保留在該親水性硅膠雜化填料上,在高比例水相的條件下被洗脫,因此可以濃縮糖鏈樣品提高質譜檢測的信號強度。同時我們也考察了糖鏈在pGMAG-SiO2填料上的回收率,通過測定不同濃度的DP7 在m/z 1 175 處對應的質譜峰面積,建立標準曲線,使用外標法計算得到pGMAGSiO2雜化填料對DP7 的回收率為91.2%,說明pGMAG-SiO2雜化填料對糖鏈具有較高的回收率。

    圖4 DP7 經(jīng)(a)pGMAG-SiO2 雜化填料富集前、(b)淋洗液和(c)富集后的MALDI-TOF MS 譜圖Fig.4 MALDI-TOF MS spectra of DP7 (a)before enrichment,(b)washing and (c)after enrichment by pGMAG-SiO2 packing

    2.2.2 pGMAG-SiO2對標準糖蛋白N-糖鏈的富集

    為了進一步評價pGMAG-SiO2雜化填料在糖蛋白N-糖鏈富集檢測中的應用,我們對標準糖蛋白上釋放的N-糖鏈進行了富集檢測。使用PNGase F釋放OVA 標準糖蛋白的N-糖鏈,經(jīng)pGMAG-SiO2雜化填料富集之后進行MALDI-TOF MS 分析。從圖5a 可以看出,未經(jīng)任何富集處理只能檢測到14個糖鏈對應的質譜峰,且信號強度較弱,信噪比(S/N)較低。經(jīng)過pGMAG-SiO2雜化填料富集后可以鑒定到21 個糖鏈(對應的糖型結構見表1),與文獻[17]報道數(shù)量一致,并且信號強度較強,S/N 較高(見圖5b)。對于富集前、后均檢測到的糖型信號,富集后的信號強度為富集之前的1 ~9.7 倍(見表1)。以上數(shù)據(jù)證明了pGMAG-SiO2雜化填料由于包裹了致密的葡萄糖聚合物層,具有較強的親水性,對不同糖型的N-糖鏈均有良好的保留能力,適用于N-糖鏈的無偏性富集鑒定。

    圖5 OVA 的N-糖鏈經(jīng)pGMAG-SiO2(a)富集前和(b)富集后的MALDI-TOF MS 譜圖Fig.5 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans from OVA (a)before and (b)after enrichment by pGMAG-SiO2 packing

    表1 pGMAG-SiO2 富集前、后質譜鑒定到的OVA 的N-糖鏈的糖型Table 1 Identified N-glycoforms of OVA before and after enrichment by pGMAG-SiO2

    2.2.3 pGMAG-SiO2用于人血漿中糖蛋白N-糖鏈的富集

    已經(jīng)有文獻報道,人血漿中糖蛋白的糖型結構改變和多種癌癥的發(fā)生有密切關系,例如乳腺癌、前列腺癌及肝癌等[18-20]。因此鑒定人血漿中糖蛋白的N-糖鏈結構有利于發(fā)現(xiàn)多種癌癥診斷生物標志物,為這些疾病的臨床研究及藥物研發(fā)提供有價值的數(shù)據(jù)。對血漿糖蛋白經(jīng)PNGase F 酶解釋放的N-糖鏈直接進行MALDI-TOF MS 檢測,只能鑒定到11 種糖型,并且信號強度較差,S/N 較低(見圖6a)。使用本文制備的新型核殼型pGMAG-SiO2雜化填料富集后,可以鑒定到47 種糖型(見圖6b),包含了N-糖鏈的3 種糖型構型(高甘露糖型、復合型和雜合型),比文獻報道的42 種糖型有所增加[21]。而且信號強度和S/N 也得到顯著改善,例如,MALDI-TOF MS 譜圖中的m/z 1 647.7 質譜峰對應的是IgG 釋放的N-糖鏈Hex4HexNAc4Fuc1,經(jīng)過該親水填料富集之后S/N 提高了16 倍。N-糖鏈質譜信號和信噪比的提高得益于該親水雜化填料能夠有效濃縮富集N-糖鏈,且在富集的同時又能夠有效去除血漿樣品中的非極性雜質(如蛋白質及多肽等),降低了其對N-糖鏈質譜信號的抑制。以上結果進一步說明了該親水雜化填料可以用于復雜生物樣本中N-糖鏈的高效且無偏性富集。

    圖6 人血漿糖蛋白N-糖鏈經(jīng)pGMAG-SiO2(a)富集前和(b)富集后的MALDI-TOF MS 譜圖Fig.6 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans from human plasma proteins

    3 結論

    采用SI-ATRP 反應在硅膠表面原位生成親水葡萄糖聚合物層,成功制備了新型核殼型葡萄糖聚合物-硅膠雜化填料。由于葡萄糖親水聚合物的修飾,該填料具有高度親水性,特別適合親水作用色譜(HILIC)模式下糖鏈的富集分離。該雜化填料已被成功應用于標準糖蛋白和復雜生物樣本中糖蛋白的N-糖鏈富集,從人血漿糖蛋白中成功富集鑒定到47種糖型,顯示了其在糖蛋白質組學研究中的應用潛力。

    [1] Zaia J. Nat Methods,2011,8(1):55

    [2] Lau K S,Partridge E A,Grigorian A,et al. Cell,2007,129(1):123

    [3] Balog C I A,Stavenhagen K,F(xiàn)ung W L J,et al. Mol Cell Proteomics,2012,11(9):571

    [4] Robajac D,Masnikosa R,F(xiàn)ilimonovic D,et al. J Med Biochem,2012,31(3):205

    [5] Anderson N L,Anderson N G. Mol Cell Proteomics,2002,1(11):845

    [6] Ruiz-May E,Hucko S,Howe K J,et al. Mol Cell Proteomics,2014,13(2):566

    [7] Ruiz-May E,Catalá C,Rose J K. Methods Mol Biol,2014,1072:633

    [8] Xu Y,Bailey U M,Punyadeera C,et al. Rapid Commun Mass Spectrom,2014,28(5):471

    [9] Zhang Y T,Ma W F,Li D,et al. Small,2014,10(7):1379

    [10] Wan H H,Yan J Y,Yu L,et al. Analyst,2011,136(21):4422

    [11] Ma C,Pan Y T,Zhang Q,et al. Chinese Journal of Chromatography (馬成,潘一廷,張琪,等. 色譜),2013,31(11):1057

    [12] Regnier F E,Noel R. J Chromatogr Sci,1976,14:316

    [13] Jackowska M,Bocian S,Buszewski B. Analyst,2012,137(19):4610

    [14] Tissot B,Ceroni A,Powell A K,et al. Anal Chem,2008,80(23):9204

    [15] Song Z F,Zhang Q L,Zhang Y J,et al. Chinese Journal of Chromatography (宋子鳳,張慶林,張養(yǎng)軍,等. 色譜),2012,30(6):549

    [16] Fan C,Song Z F,Qin W J,et al. Chinese Journal of Chromatography (范超,宋子鳳,秦偉捷,等. 色譜),2013,31(5):423

    [17] Lattova E,Perreault H N,Krokhin O,et al. J Am Soc Mass Spectrom,2004,15(5):725

    [18] Zhong Y,Shen S,Zhou Y D,et al. Med Oncol,2014,31(3):864

    [19] Vermassen T,Speeckaert M M,Lumen N,et al. Clin Chim Acta,2012,413(19/20):1500

    [20] Lai Q,Avolio A W,Graziadei I,et al. J Hepatol,2014,60(6):1332

    [21] Bereman M S,Young D D,Deiters A,et al. J Proteome Res,2009,8(7):3764

    猜你喜歡
    糖鏈糖蛋白雜化
    基于FFPE組織切片的膀胱癌N-連接糖鏈原位酶解及分析*
    精準捕獲“糖鏈”有助揭示病毒侵染機制
    植物N-糖鏈檢測技術研究進展
    α-細辛腦脂質聚合物雜化納米粒的制備及表征
    制川烏、白芍配伍對大鼠海馬區(qū)P-糖蛋白表達的影響
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:03:56
    天然海藻色素糖蛋白誘導Hela細胞凋亡作用
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:20
    尿al-酸性糖蛋白在早期糖尿病腎病診斷中的應用價值
    花生致敏糖蛋白Ara h1糖鏈決定簇的質譜分析
    元素雜化阻燃丙烯酸樹脂的研究進展
    中國塑料(2016年1期)2016-05-17 06:13:00
    化學教學中的分子雜化軌道學習
    精品国产一区二区久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲成人av在线免费| 亚洲熟女精品中文字幕| 在线观看国产h片| 国产片特级美女逼逼视频| 男人舔女人的私密视频| 国产在线免费精品| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久狼人影院| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲av男天堂| 久久午夜福利片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 捣出白浆h1v1| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久ye,这里只有精品| 国产精品久久久久成人av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 少妇的丰满在线观看| 美女福利国产在线| 高清毛片免费看| 在线精品无人区一区二区三| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 久久久久网色| 国产精品久久久久久久久免| av线在线观看网站| 国产又爽黄色视频| 另类亚洲欧美激情| 亚洲av电影在线进入| 最近中文字幕2019免费版| 免费观看在线日韩| 日本av免费视频播放| 国产国语露脸激情在线看| 天美传媒精品一区二区| 另类精品久久| 亚洲性久久影院| 国产永久视频网站| 日韩制服骚丝袜av| 极品人妻少妇av视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 街头女战士在线观看网站| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 精品久久久久久电影网| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产在视频线精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线免费观看不下载黄p国产| 婷婷色av中文字幕| 亚洲成人一二三区av| 丰满饥渴人妻一区二区三| 妹子高潮喷水视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 免费黄频网站在线观看国产| 青春草视频在线免费观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲国产看品久久| 国产探花极品一区二区| 九九在线视频观看精品| 天天操日日干夜夜撸| av播播在线观看一区| 久久免费观看电影| 最新的欧美精品一区二区| 黄片无遮挡物在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 视频在线观看一区二区三区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品 国内视频| 99香蕉大伊视频| 女人精品久久久久毛片| 各种免费的搞黄视频| www.熟女人妻精品国产 | 在线观看免费视频网站a站| 久久狼人影院| 一二三四在线观看免费中文在 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久精品国产a三级三级三级| 国产又爽黄色视频| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 国产精品人妻久久久久久| 久久久久精品人妻al黑| 国产成人精品无人区| 久久免费观看电影| 欧美bdsm另类| 欧美精品国产亚洲| 在线观看免费高清a一片| 亚洲伊人色综图| 免费观看av网站的网址| 伦理电影免费视频| 少妇熟女欧美另类| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 精品久久蜜臀av无| 国产成人aa在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产成人欧美| 亚洲第一av免费看| 91国产中文字幕| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲精品中文字幕在线视频| 91精品三级在线观看| 日本午夜av视频| 99久久综合免费| 老女人水多毛片| 成人毛片60女人毛片免费| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品第二区| 亚洲在久久综合| 人人妻人人澡人人看| 一级毛片我不卡| 国产xxxxx性猛交| 午夜日本视频在线| 色视频在线一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 久久毛片免费看一区二区三区| 日本-黄色视频高清免费观看| 日本vs欧美在线观看视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 黑人欧美特级aaaaaa片| 老女人水多毛片| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 午夜福利乱码中文字幕| 大香蕉久久成人网| 高清欧美精品videossex| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品国产一区二区久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久这里只有精品19| 国内精品宾馆在线| 免费在线观看完整版高清| 婷婷色综合大香蕉| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲性久久影院| 亚洲国产av新网站| 99热全是精品| 精品熟女少妇av免费看| 国产综合精华液| 欧美日韩精品成人综合77777| 好男人视频免费观看在线| 亚洲国产看品久久| 日本与韩国留学比较| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲综合精品二区| 午夜福利,免费看| 日韩制服骚丝袜av| 久久精品久久久久久久性| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产片内射在线| 久热久热在线精品观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产综合精华液| 男女午夜视频在线观看 | 中文字幕免费在线视频6| 天堂中文最新版在线下载| 青春草亚洲视频在线观看| 内地一区二区视频在线| 欧美精品一区二区大全| 午夜免费鲁丝| 在线观看免费视频网站a站| 2022亚洲国产成人精品| 美国免费a级毛片| 秋霞伦理黄片| 日本vs欧美在线观看视频| 熟女人妻精品中文字幕| 免费av不卡在线播放| 多毛熟女@视频| 香蕉精品网在线| 日本免费在线观看一区| av在线播放精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲精品日韩在线中文字幕| av电影中文网址| 亚洲精品一二三| 亚洲伊人久久精品综合| 蜜桃国产av成人99| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 日韩视频在线欧美| 亚洲美女视频黄频| 青春草国产在线视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品一品国产午夜福利视频| 69精品国产乱码久久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产有黄有色有爽视频| 午夜免费鲁丝| 免费看不卡的av| 久久这里只有精品19| 一二三四在线观看免费中文在 | 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 新久久久久国产一级毛片| 1024视频免费在线观看| 99九九在线精品视频| av视频免费观看在线观看| 国产麻豆69| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人精品在线电影| 亚洲情色 制服丝袜| 久久久久久久亚洲中文字幕| 又大又黄又爽视频免费| a级毛色黄片| 色网站视频免费| 久久影院123| tube8黄色片| 波多野结衣一区麻豆| 99久国产av精品国产电影| 亚洲国产日韩一区二区| 久久久国产一区二区| 久久久久久人人人人人| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产 精品1| 久久久久久久久久人人人人人人| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产淫语在线视频| av片东京热男人的天堂| 18禁动态无遮挡网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一本久久精品| 成人免费观看视频高清| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 午夜影院在线不卡| av片东京热男人的天堂| 婷婷色av中文字幕| 蜜臀久久99精品久久宅男| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 久久99热这里只频精品6学生| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99热国产这里只有精品6| 少妇 在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 观看美女的网站| 成年女人在线观看亚洲视频| 成人国语在线视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产成人aa在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 久久午夜福利片| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 高清不卡的av网站| 91精品三级在线观看| 有码 亚洲区| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人黄色视频免费在线看| a级毛片黄视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 免费大片18禁| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲精品色激情综合| 三上悠亚av全集在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久99一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 宅男免费午夜| 免费av中文字幕在线| 97在线人人人人妻| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品熟女少妇av免费看| 最近手机中文字幕大全| 欧美最新免费一区二区三区| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲,欧美,日韩| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲国产精品国产精品| 精品一区二区三区四区五区乱码 | freevideosex欧美| 97人妻天天添夜夜摸| 久久人妻熟女aⅴ| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久亚洲国产成人精品v| 在线观看三级黄色| av在线老鸭窝| 国产成人91sexporn| 亚洲国产成人一精品久久久| 婷婷色综合大香蕉| 国产成人欧美| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲精品456在线播放app| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日韩人妻精品一区2区三区| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲av电影在线进入| av在线播放精品| 国产成人一区二区在线| 黄片播放在线免费| 亚洲国产精品999| 午夜久久久在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产一区二区在线观看av| 久久久久久人人人人人| 日韩伦理黄色片| 欧美3d第一页| 日本与韩国留学比较| 少妇人妻精品综合一区二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲色图综合在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久影院123| 午夜视频国产福利| 国国产精品蜜臀av免费| 久久这里有精品视频免费| 各种免费的搞黄视频| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲av.av天堂| 久久久久久人妻| 国产一区二区三区av在线| 人妻系列 视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久精品夜色国产| 1024视频免费在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 2022亚洲国产成人精品| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品视频女| 下体分泌物呈黄色| 男女边摸边吃奶| 亚洲av免费高清在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 2021少妇久久久久久久久久久| 最近中文字幕2019免费版| 最近中文字幕高清免费大全6| 伦精品一区二区三区| 欧美性感艳星| 不卡视频在线观看欧美| 国产成人免费无遮挡视频| 在线天堂中文资源库| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久av网站| 成人影院久久| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久午夜综合久久蜜桃| 91精品三级在线观看| 综合色丁香网| 精品酒店卫生间| 久久国产亚洲av麻豆专区| 黄色一级大片看看| 大片免费播放器 马上看| 国产免费现黄频在线看| 精品久久久精品久久久| 国产免费福利视频在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久久精品区二区三区| 99香蕉大伊视频| 中文字幕亚洲精品专区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 97在线人人人人妻| 精品久久蜜臀av无| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 精品少妇内射三级| 全区人妻精品视频| a级毛片黄视频| 22中文网久久字幕| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美日韩成人在线一区二区| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产av新网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产精品人妻久久久影院| 一个人免费看片子| 色哟哟·www| 赤兔流量卡办理| av一本久久久久| 国产精品国产av在线观看| 久久ye,这里只有精品| 熟女av电影| 中国国产av一级| 久久久久久久久久成人| 国精品久久久久久国模美| 成人免费观看视频高清| 婷婷色综合www| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 人妻少妇偷人精品九色| 一区二区三区精品91| 久久99热6这里只有精品| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 婷婷成人精品国产| 哪个播放器可以免费观看大片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一区二区av电影网| 久久久国产欧美日韩av| 国产亚洲欧美精品永久| 宅男免费午夜| 日日爽夜夜爽网站| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 香蕉精品网在线| 亚洲美女视频黄频| 日本欧美视频一区| 欧美精品av麻豆av| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产av国产精品国产| 女性生殖器流出的白浆| 2021少妇久久久久久久久久久| 精品福利永久在线观看| 青春草国产在线视频| 日本午夜av视频| 99久久人妻综合| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产色婷婷99| 成人影院久久| 国产成人精品福利久久| 一本久久精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产日韩欧美在线精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日韩欧美精品免费久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品一二三区在线看| av福利片在线| 在线观看人妻少妇| 激情五月婷婷亚洲| www.av在线官网国产| 丰满少妇做爰视频| 久久人妻熟女aⅴ| 狂野欧美激情性bbbbbb| 午夜av观看不卡| 丝瓜视频免费看黄片| 精品午夜福利在线看| 在线观看一区二区三区激情| 久久久精品94久久精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 美女内射精品一级片tv| 精品福利永久在线观看| 婷婷成人精品国产| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久婷婷青草| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| a级毛片黄视频| 日本与韩国留学比较| 内地一区二区视频在线| 国产亚洲欧美精品永久| 91精品三级在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 欧美3d第一页| av片东京热男人的天堂| 少妇的逼水好多| av国产精品久久久久影院| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲国产精品成人久久小说| 一区在线观看完整版| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产探花极品一区二区| 男女下面插进去视频免费观看 | 国产男女内射视频| 人妻 亚洲 视频| 天堂8中文在线网| 老司机影院毛片| 女性被躁到高潮视频| freevideosex欧美| 久久精品国产a三级三级三级| 国产亚洲欧美精品永久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 咕卡用的链子| freevideosex欧美| 国产在线一区二区三区精| 一边亲一边摸免费视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 蜜桃在线观看..| 在线观看免费高清a一片| 国产福利在线免费观看视频| 蜜桃国产av成人99| 精品久久蜜臀av无| 欧美激情国产日韩精品一区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产极品天堂在线| 97在线人人人人妻| 中文字幕最新亚洲高清| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久99热这里只频精品6学生| 免费观看在线日韩| 免费看av在线观看网站| 青青草视频在线视频观看| 人体艺术视频欧美日本| 少妇 在线观看| 亚洲美女视频黄频| av视频免费观看在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久久人人人人人| 国产男女内射视频| 伦理电影大哥的女人| 丝袜脚勾引网站| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲三级黄色毛片| xxxhd国产人妻xxx| 制服丝袜香蕉在线| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲国产精品专区欧美| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲精品视频女| 亚洲精品一区蜜桃| 精品一区在线观看国产| 国产免费现黄频在线看| 在线免费观看不下载黄p国产| 日本wwww免费看| 人妻 亚洲 视频| 热re99久久国产66热| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 韩国精品一区二区三区 | 女人久久www免费人成看片| 女性被躁到高潮视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 男女免费视频国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 有码 亚洲区| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲国产色片| 99香蕉大伊视频| 精品一品国产午夜福利视频| 男男h啪啪无遮挡| 1024视频免费在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久影院123| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲内射少妇av| 国产精品.久久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲国产av新网站| 日韩成人伦理影院| 春色校园在线视频观看| 国产一区二区三区av在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国精品久久久久久国模美| 母亲3免费完整高清在线观看 | 午夜免费观看性视频| 91精品伊人久久大香线蕉| freevideosex欧美| 少妇精品久久久久久久| 看免费av毛片| 久久免费观看电影| 极品少妇高潮喷水抽搐| 综合色丁香网| av网站免费在线观看视频| 亚洲图色成人| 久久热在线av| av.在线天堂| 中文字幕制服av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品久久久久久久电影| 妹子高潮喷水视频| 日韩av免费高清视频| 90打野战视频偷拍视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产在线免费精品| 一级黄片播放器| 日韩中文字幕视频在线看片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产 精品1| 99热网站在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国产精品熟女久久久久浪| 久久久久精品久久久久真实原创| 蜜桃在线观看..| 热99国产精品久久久久久7| av福利片在线| 亚洲精品一二三| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 人妻一区二区av| 下体分泌物呈黄色| 亚洲av.av天堂| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 大码成人一级视频| 亚洲成色77777| 欧美3d第一页| 国国产精品蜜臀av免费| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 中文字幕免费在线视频6| 久久热在线av| 母亲3免费完整高清在线观看 | 宅男免费午夜|