低溫冷凍及分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物油中104 種農(nóng)藥殘留

徐 娟， 王 嵐， 黃華軍 ， 陳 捷， 陳文銳， 相大鵬

（廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州510623）

隨著農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)和經(jīng)濟水平的提高，農(nóng)產(chǎn)品已基本滿足數(shù)量安全的要求，人們越來越關(guān)注農(nóng)產(chǎn)品與食品的質(zhì)量安全情況。我國是世界第一植物油消費大國，但我國對于植物油中農(nóng)藥殘留的研究與國際水平仍存在一定差距［1］。

如何有效去除油脂，減少對儀器的損傷是建立植物油中多農(nóng)藥殘留檢測方法的關(guān)鍵［2］。傳統(tǒng)的油脂檢測方法中，多采用液液萃?。↙LE）以及近年來興起的加速溶劑萃?。ˋSE）和凝膠色譜技術(shù)（GPC），但這些前處理方法的過程較為繁瑣，且對于多種目標化合物難以兼顧，與目前實驗室檢測工作所追求的高通量快速檢測有一定距離［3，4］。

另外，傳統(tǒng)檢測方法中多使用氣相色譜（GC）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）。某些極性較強的除草劑和有機磷類的農(nóng)藥在GC-MS 上的靈敏度比較差，導(dǎo)致方法檢測限偏高［5-9］。近年來液相色譜與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用的迅猛發(fā)展，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）憑借其分離能力高、適用范圍極廣及靈敏度高、選擇性好的特點，已成為農(nóng)藥多殘留分析中應(yīng)用最廣泛的聯(lián)用技術(shù)［10-16］。

本研究以104 種常用農(nóng)藥為分析對象，采用分散固相萃?。―-SPE）技術(shù)作為前處理手段，與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）聯(lián)用，建立了橄欖油、棕櫚油和花生油這3 種常用植物油中多種農(nóng)藥殘留的高通量檢測方法，并用于植物油脂的品質(zhì)監(jiān)控。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API 4000 串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），配Shimadzu LC 20 液相色譜儀（四元低壓梯度輸液泵、自動進樣器、柱溫箱）、電噴霧離子（ESI）源和Analyst 1.5.1 儀器控制及數(shù)據(jù)處理軟件（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

乙腈、甲醇為色譜純（TEDIA，USA），無水硫酸鎂、氯 化 鈉、C18 粉 末、PSA （primary secondary amine）粉、二水合檸檬酸鈉、倍半水合檸檬酸二鈉均為分析純（Sigma-Aldrich，USA），乙酸銨為質(zhì)譜級（Fluka Chemie AG，Germany）。實驗用水均為超純水（Millipore，USA）。標準物質(zhì)均購自Dr. Ehrenstorfer 公司（10.0 mg／L，純度≥96.0%）。

1.2 樣品處理

準確稱取5.00 g 植物油樣品，加入5 mL 正己烷、5 mL 超純水、5 mL 乙腈和2 g 氯化鈉，振蕩10 min，以4 000 r／min 離心5 min，移去上層清液，下層重復(fù)提取一次。合并提取液，冷凍2 h，取1.0 mL上清液與150 mg 無水硫酸鎂、50 mg PSA 和50 mg C18 粉末混合，以12 000 r／min 離心5 min，取0.5 mL 上清液與0.5 mL 超純水混合，過0.2 μm 濾膜，裝瓶待測。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Restek C18（100 mm×2.1 mm，3 μm，USA）；柱溫：35 ℃；平衡時間：5 min；進樣量：10 μL；流速：0.5 mL／min；流動相：采用10 mmol／L乙酸銨水溶液（A）和10 mmol／L 乙酸銨甲醇溶液（B）組成的流動相進行梯度洗脫。洗脫條件：0 ～8 min，20.0% B ～90.0% B；8 ～12 min，90.0% B ～100.0%B；12 ～14.8 min，100.0% B；14.8 ～14.9 min，100.0%B ～20.0%B；15 min，停止。

電噴霧離子源正離子掃描（ESI＋）；檢測方式：編程的多反應(yīng)監(jiān)測（scheduled-MRM）模式；氣簾氣：15 L／min；霧化氣（GS1）：60 L／min；輔助加熱氣（GS2）：70 L／min；碰撞活化解離（collision-activated dissociation，CAD）碰撞氣：中等（medium）；輔助加熱氣溫度：500 ℃；噴霧電壓：5 000 V。目標物的相關(guān)信息見表1。

表1 各目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the target analytes

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

1.4 標準溶液的配制

實驗所用標準溶液為10.0 mg／L 商品化混合標準溶液（104 種農(nóng)藥共分為4 組），使用前保存于-18 ℃下，工作曲線溶液（0、1、2、5、10、20 和30 μg／L）使用前用相應(yīng)空白基質(zhì)提取液配制。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

本實驗檢測的104 種目標化合物的性質(zhì)差異較大，對比研究了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙酸銨溶液、乙酸銨甲醇溶液-乙酸銨水溶液作為流動相的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)在甲醇-水體系下的響應(yīng)優(yōu)于乙腈-水體系。而流動相中加入適量的乙酸銨可以使待測物在測試時成為離子狀態(tài)，然后在電噴霧過程中將離子從溶液中轉(zhuǎn)移至氣相中，使氣相離子的生成過程更容易完成，從而提高待測物的離子化效率；同時還可以抑制待測物與色譜柱固定相中殘留硅羥基之間的“二次作用”，達到改善峰形、提高分離效果的作用；而且有機相與水相中鹽濃度相等，也保證了梯度變化過程中鹽的濃度和離子化氛圍酸性穩(wěn)定。因此，最終本實驗采用10 mmol／L 乙酸銨甲醇溶液-10 mmol／L 乙酸銨水溶液作為流動相體系。

本實驗采用Restek C18 色譜柱，填料粒徑為3 μm，與常規(guī)液相色譜柱相比具有更高的靈敏度和分離能力，且分離時間較常規(guī)液相色譜柱大大縮短。通過優(yōu)化色譜分離條件，使目標化合物與抑制電離的基質(zhì)實現(xiàn)最大程度的有效分離，可以降低基質(zhì)對質(zhì)譜檢測的影響?？瞻谆|(zhì)中104 種化合物的MRM 色譜圖如圖1 所示。

圖1 空白基質(zhì)中104 種化合物的MRM 色譜圖（0.01 mg／kg）Fig.1 MRM chromatograms of the matrix-matched standards of the 104 analytes （0.01 mg／kg）

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究嘗試使用大氣壓化學(xué)電離（APCI）源和ESI＋源。發(fā)現(xiàn)使用APCI 源時噪聲基線低，但目標物的響應(yīng)值也偏低；ESI＋條件下響應(yīng)較好，滿足靈敏度要求。用蠕動泵以10 μL／min 的流速連續(xù)注射，分別將0.5 mg／L 的每組農(nóng)藥標準溶液注入ESI 源中，在正離子檢測方式下進行一級質(zhì)譜分析（Q1 掃描），得到準分子離子峰［M＋H］＋，優(yōu)化去簇電壓。對準分子離子峰進行二級質(zhì)譜分析（子離子掃描），得到二級質(zhì)譜碎片的全譜信息，優(yōu)化碰撞能，同時建立標準物質(zhì)二級碎片譜庫，以便譜庫檢索能夠?qū)崿F(xiàn)對化合物同時定性定量的目的。此外，還對離子源溫度、霧化氣、氣簾氣、輔助氣等參數(shù)進行了優(yōu)化，優(yōu)化的條件見1.3 節(jié)。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取試劑的優(yōu)化

在進行提取試劑的優(yōu)化實驗時選擇了6 種提取方案，分別是（A）5 g 油與5 mL 正己烷混合，以5 mL 乙腈提取，共提取兩次，合并提取液；（B）5 g 油與5 mL 正己烷及5 mL 水混合，以5 mL 乙腈提取，共提取兩次，合并提取液；（C）5 g 油與5 mL 乙腈飽和的正己烷以及5 mL 水混合，以5 mL 乙腈提取，共提取兩次，合并提取液；（D）5 g 油與5 mL 水混合，加入1 g 氯化鈉，以5 mL 乙腈提取，共提取兩次，合并提取液；（E）5 g 油，以5 mL 乙腈提取，共提取兩次，合并提取液；（F）5 g 油，以10 mL 乙腈提取一次。以0.05 mg／kg 的104 種目標化合物為樣品，采用了兩種方式比較提取試劑的優(yōu)劣：其一為比較回收率（見圖2），其二為稱量共提取物（見圖3）。兩種方式的結(jié)果都充分說明提取方式B 為最優(yōu)化方案。

對上述優(yōu)化結(jié)果進行了分析。首先，乙腈的通用性強，對農(nóng)藥的溶解度較大，可溶入的雜質(zhì)量適中，是目前針對多殘留提取較為普遍的選擇。其次，由于植物油中含水量極低，并且具有一定的黏性，單純使用乙腈在提取時可能存在分散不夠完全的現(xiàn)象，加入少量的水，提高了乙腈對于樣品的滲透性，可以將基體分散得非常均勻。再次，除油脂外，正己烷中可溶入的雜質(zhì)量比較少，特別是正己烷與水進行兩相分配時，大部分雜質(zhì)在水相中；對于植物油樣品來說，由于其與乙腈互溶性不佳，直接提取效率不高，所以先使用正己烷溶解，再用乙腈萃取，這樣既可以提高對目標物的提取效率，又可以減少植物油中最主要的干擾雜質(zhì)油脂的溶入量，對后續(xù)進行的凈化步驟有利。故本方法最終先采用正己烷-水溶解分散基質(zhì)，再加入乙腈溶液提取，最后加鹽至鹽析分層。操作簡單，凈化效果顯著，提取效率高。

2.2.2 冷凍時間的優(yōu)化

在進行了提取步驟以后，雖然大部分的油脂保留在殘渣內(nèi)，但仍有少部分進入了乙腈層。為了進一步凈化，采用了冷凍的方式去除油脂。將不同提取方式得到的乙腈提取層同時放入-18 ℃冰箱內(nèi)冷凍，間隔一段時間后取出2 mL 提取液，吹干后稱重，利用差減法繪制出冷凍效果曲線（見圖3）。隨著冷凍時間的延長，提取液中的油脂含量顯著下降，但當冷凍時間達到2 h 以后，該趨勢趨于平穩(wěn)。因此認為冷凍2 h 較合適。

2.2.3 D-SPE 條件的優(yōu)化

在進行D-SPE 條件優(yōu)化時，選擇了3 種凈化方案：50 mg MgSO4和50 mg PSA；150 mg MgSO4、50 mg PSA 和50 mg C18；150 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18 和10 mg GCB。以0.05 mg／kg 的104種目標化合物為樣品，先在上文優(yōu)化的條件下進行LLE，提取液用于分散固相萃取凈化條件的優(yōu)化（見圖4）。

圖2 提取方法的優(yōu)化Fig.2 Optimization of extraction methods

提取液經(jīng)液液分配除去部分雜質(zhì)后，再使用C18 和PSA 粉末分別吸附非極性和極性雜質(zhì)，凈化效果良好。C18 材料的硅膠上接有十八烷基，為其有效成分，有較高的相覆蓋率和碳含量，對非極性物質(zhì)有較高的容量，特別對油脂的去除有十分顯著的效果，同時還可以去除其他一些非極性的雜質(zhì)。PSA材料的硅膠表面鍵合有極性官能團（氨基），為其有效成分，能從樣品中吸附極性化合物，再應(yīng)用比樣品本身極性更強的溶劑來洗脫分析物。PSA 對樣品中的一些強極性雜質(zhì)、有機酸、色素和金屬離子（通過配合作用）等具有良好的凈化效果。無水MgSO4用于除去鹽析分配后乙腈層中含有的少量水分，以免PSA 粉末吸水導(dǎo)致性能下降。雖然加入少量GCB 粉末可以去除部分色素，但對于一些平面結(jié)構(gòu)的化合物可能產(chǎn)生吸附作用而導(dǎo)致回收率下降。綜合考慮，選擇MgSO4、PSA 和C18 進行DSPE。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

近幾年，與液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜法有關(guān)的基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）問題逐漸引起分析工作者的關(guān)注［17］。在常規(guī)液相色譜-質(zhì)譜法的方法確證過程中，一般采用同一來源的空白樣品配制系列標準樣品和質(zhì)控（QC）樣品，以抵消基質(zhì)效應(yīng)對方法的精密度和結(jié)果的準確度產(chǎn)生的影響。但在方法的實際應(yīng)用中，因所測定的樣品具有不同的來源或大批量測定時所涉及的樣品基質(zhì)復(fù)雜多樣，無法嚴格地保證配制定量工作曲線溶液所使用的空白基質(zhì)與檢測樣品一一對應(yīng)。因此，通常選擇對樣品進行稀釋、延長目標化合物的保留時間（盡量大于3 min）以及選擇性質(zhì)相近的基質(zhì)制備的曲線進行定量的方法來減小基質(zhì)效應(yīng)帶來的誤差。

在本研究中，涉及的植物油種類有棕櫚油、花生油和橄欖油。但是大批量的實際檢測時涉及的品種繁多，因而只能選擇近似的基質(zhì)配制標準曲線來進行定量。但為了保證結(jié)果的準確性，選擇了簡略的標準曲線法對基質(zhì)效應(yīng)進行了考察。分別采用流動相、空白棕櫚油提取液、空白花生油提取液和空白橄欖油提取液配制3 組工作曲線溶液，每組標準曲線中含有相同的15種以上的化合物，以不同基質(zhì)中的同種化合物的響應(yīng)值對相應(yīng)含量繪制標準曲線（以圖5 為例）。通過對標準曲線斜率的比較發(fā)現(xiàn)，不同基質(zhì)對于不同化合物的確存在基質(zhì)效應(yīng)，且絕大多數(shù)表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。但是，不同基質(zhì)間的基質(zhì)效應(yīng)并無顯著性差異。因此通過標準曲線實驗結(jié)果證明，在無法找到完全一致的空白樣品基質(zhì)配制標準曲線時，采用相近空白基質(zhì)配制標準曲線所測定的結(jié)果準確可靠。

圖3 冷凍時間的優(yōu)化Fig.3 Optimization of frozen time

2.4 線性范圍和定量限

在方法所確定的實驗條件下，用乙腈／水溶液（6 ∶4，v／v）稀釋各化合物的標準溶液，配成一系列質(zhì)量濃度（0、1、2、5、10、20 和30 μg／L）的溶液，以儀器響應(yīng)峰面積對各目標化合物的質(zhì)量濃度進行線性回歸。結(jié)果表明，80% 的化合物線性方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.996，定量限（LOQ，S／N≥10）可達1 μg／kg。實際樣品測定時，如某化合物有檢出，應(yīng)當采用相應(yīng)的空白基質(zhì)匹配外標法對其進行定量。如含量超過線性范圍，可適當加大樣品的稀釋倍數(shù)，并依據(jù)歐盟SANCO／12571／2013 進行定性和定量。

2.5 方法的回收率和精密度

圖4 D-SPE 條件的優(yōu)化（0.05 mg／kg）Fig.4 Optimization of D-SPE （0.05 mg／kg）

圖5 不同植物油的基質(zhì)效應(yīng)Fig.5 Matrix effects of different vegetable oils

本實驗依據(jù)歐盟SANCO／12571／2013 進行方法驗證。選擇3 種基質(zhì)（花生油、橄欖油和棕櫚油）分別添加10.0、20.0、50.0 μg／kg 進行回收率和精密度試驗，每個水平重復(fù)6 次。平均回收率為55%～121%，RSD 為0.47% ～19.2%，能夠滿足多種農(nóng)藥殘留同時分析的要求。

應(yīng)用本方法在100 份進口植物油脂中檢出3 份樣品中含有倍硫磷，日常工作表明該方法穩(wěn)定有效。

3 結(jié)論

本方法可應(yīng)用于日常檢測工作，對保護消費者的食品安全起到一定作用，并可通過監(jiān)控數(shù)據(jù)，對生產(chǎn)基地進行用藥指導(dǎo)，有效避免了可能發(fā)生的貿(mào)易摩擦和損失。

［1］ Song D Y，Gong Z J，Li P W，et al. Chinese Journal of Oil Crop Sciences （宋丹陽，宮兆晶，李培武，等. 中國油料作物學(xué)報），2006，28（3）：375

［2］ Gilbert-López B，García-Reyes J F，Molina-Díaz A. Talanta，2009，79（2）：109

［3］ Sun X J，Guo M M，Wang S Y，et al. Chinese Journal of Chromatography （孫曉杰，郭萌萌，王蘇玥，等. 色譜），2014，32（10）：1124

［4］ Ruan H，Rong W G，Song N H，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （阮華，榮維廣，宋寧慧，等. 分析化學(xué)），2014，42（8）：1110

［5］ Nevado J J B，Martin-Doimeadios R C R，Bernardo F J G，et al.Talanta，2010，81（3）：887

［6］ Zhang F，Li Z H，Zhang Y，et al. Chinese Journal of Chromatography （張帆，李忠海，張瑩，等. 色譜），2014，32（7）：735

［7］ Hu Y Q，Xi C X，Cao S R，et al. Chinese Journal of Chromatography （胡業(yè)琴，郗存顯，曹淑瑞，等. 色譜），2014，32（7）：784

［8］ Amvrazi E G，Albanis T A. J Agric Food Chem，2006，54（26）：9642

［9］ Nguyen T D，Lee M H，Lee G H. Microchem J，2010，95（1）：113

［10］ Benincasa C，Perri E，Iannotta N，et al. Food Chem，2011，125（3）：1116

［11］ Sobhanzadeh E，Bakar N K A，Abas M R B，et al. J Hazard Mater，2011，186（2／3）：1308

［12］ Wilkowska A，Biziuk M. Food Chem，2011，125（3）：803

［13］ Pareja L，Cesio V，Heinzen H，et al. Talanta，2011，83（5）：1613

［14］ Gilbert-López B，García-Reyes J F，Molina-Díaz A，et al.Chromatogr A，2010，1217（24）：3736

［15］ Luo H T，Huang X L，Wu H Q，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，等. 分析化學(xué)），2012，40（2）：273

［16］ Kong Z Q，Dong F S，Liu X G，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （孔志強，董豐收，劉新剛，等. 分析化學(xué)），2012，40（3）：474

［17］ Qi M L. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis （齊美玲.藥物分析雜志），2005，25（4）：476