采用高效液相色譜-質(zhì)譜考察家福捕鳥蛛粗毒中多肽和蛋白質(zhì)的多樣性

胡朝暾， 肖 震， 周 熙， 陳 佳， 陳 波， 劉中華*

（1. 懷化學(xué)院生命科學(xué)系，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南 懷化418008；2. 湖南師范大學(xué)，蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙410081）

蜘蛛是地球上最古老的生物之一，它由大約4億年前泥盆紀(jì)的蛛形綱祖先進(jìn)化而來。除昆蟲外，蜘蛛是地球上最成功的最具多樣性的無脊椎動物［1］?，F(xiàn)在已經(jīng)鑒定的蜘蛛種類為44 906 種，分為114 個科［2］。家福捕鳥蛛是一種生活在中國廣西、云南等熱帶山區(qū)的毒性較強(qiáng)的蜘蛛新種。該種蜘蛛最先于2008 年在云南被發(fā)現(xiàn)［3］，筆者于2012 年4月在廣西寧明縣中越邊境的山區(qū)發(fā)現(xiàn)了該種蜘蛛。

目前，蜘蛛毒素的研究是一個熱門的研究領(lǐng)域，是繼蛇毒和蝎毒之后又一個天然毒素研究的熱點，這是因為蜘蛛毒素是有重要研究價值的具有特定藥理學(xué)活性新型化合物的潛在來源［1，4，5］，而且，不同種類的蜘蛛其毒腺分泌不同的毒素分子。作為最近才發(fā)現(xiàn)和鑒定的新種蜘蛛——家福捕鳥蛛必然包含很多具有特定藥理學(xué)活性的新型毒素分子。因此，我們采用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)分離和鑒定家福捕鳥蛛粗毒中多肽的組成，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)和液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間質(zhì)譜（LCESI-QTOF-MS）技術(shù)分離和鑒定粗毒中的蛋白質(zhì)組成。這些技術(shù)不僅在蜘蛛毒素研究中應(yīng)用廣泛［6-11］，而且在藥品分析、生化分析、中草藥有效成分分析及臨床檢測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［12-15］。通過鑒定家福捕鳥蛛粗毒中的多肽和蛋白質(zhì)，我們對家福捕鳥蛛粗毒中多肽和蛋白質(zhì)的多樣性進(jìn)行了初步分析，為家福捕鳥蛛毒素分子的分離和活性鑒定提供線索。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

α-氰基-4-羥基肉桂酸（CCA）、三氟乙酸（TFA）、Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent、Marker 等均購自Sigma 公司，十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）、甘氨酸、丙烯酰胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺為Amresco 公司產(chǎn)品，乙腈為國產(chǎn)色譜純試劑，其他為國產(chǎn)分析純試劑。

Waters Alliance 2695 高效液相色譜儀，配Waters 2489 紫外檢測器（美國Waters 公司）（用于多肽的分離純化）；Ultraflex 型基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀（德國Bruker 公司）（用于粗毒的鑒定）；microTOFQ-II 電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Bruker 公司）（用于蛋白質(zhì)的鑒定）；Ultimate 3000 液相色譜儀（戴安公司），Bio-Rad Protein II 垂直平板電泳系統(tǒng)，Biophotometer plus 核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf 公司）。

1.2 家福捕鳥蛛毒液的采集及蛋白質(zhì)含量的測定

家福捕鳥蛛采集于廣西寧明縣的山區(qū)，并帶回湖南在室內(nèi)人工飼養(yǎng)。成年的家福捕鳥蛛飼養(yǎng)于用網(wǎng)狀材料覆蓋的塑料桶中，每日給水，每個星期喂以豬肝（切成約1 ～2 cm3的塊狀）、蟑螂或面包蟲。采用電刺激的方法每2 個星期采集毒液一次［6］。采集的毒液為無色透明的液體。毒液蛋白質(zhì)含量的測定采用改良后的考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行。實驗除了將G-250 染液換成Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent 外，其他操作過程與考馬斯亮藍(lán)染色法完全相同。

1.3 粗毒的RP-HPLC 分離

粗毒用去離子水溶解至質(zhì)量濃度為10 g／L，于4℃以14 000 r／min 離心30 min，然后用0.22 μm 微孔過濾器過濾；毒液在反相HPLC 系統(tǒng)上進(jìn)行分離純化；上樣體積為100 μL；分離柱是C18 柱（Phenomenex 100 ?，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A 為0.1%TFA 水溶液，B 為含0.1% TFA 的乙腈；線性梯度洗脫［11］：0 ～50 min，0 ～50% B；流速為1.0 mL／min，在215 nm 波長下檢測并收集洗脫峰，每分鐘收集1 管。洗脫峰經(jīng)冷凍干燥后用30 μL 含0.1% TFA 的50% 乙腈水溶液溶解，用于質(zhì)譜鑒定。

1.4 粗毒的MALDI-TOF-MS 鑒定

質(zhì)譜分析在MALDI-TOF 質(zhì)譜儀上進(jìn)行。用含0.1% TFA 的50% 乙腈水溶液溶解CCA 基質(zhì)至質(zhì)量濃度為10 g／L，取0.5 μL 樣品與1.0 μL 10 g／L的CCA 基質(zhì)液混合，然后取0.5 μL 混合液在質(zhì)譜儀的點樣盤上點樣，室溫下自然風(fēng)干后測定樣品的相對分子質(zhì)量。采用線性模式，離子源加速電壓為20 kV，N2激光波長337 nm，脈沖寬度3 ns，離子延遲提取150 ns，真空度5.33×10-5Pa （4 ×10-7Torr），陽離子模式。

1.5 粗毒的SDS-PAGE 分析

粗毒用去離子水溶解至質(zhì)量濃度為10 g／L 的溶液，于4 ℃以14 000 r／min 離心30 min，然后用0.22 μm 微孔過濾器過濾。溶液采用SDS-PAGE的方法（15% 的分離膠和5% 的濃縮膠）進(jìn)行粗毒蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定。電泳完成后用考馬斯亮藍(lán)G-250 進(jìn)行染色。

1.6 粗毒的三維直觀圖分析

按照1.3 節(jié)和1.4 節(jié)方法進(jìn)行色譜分離和質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜采集和數(shù)據(jù)分析分別用Bruker Daltonics Flexcontrol 軟件和Flexanalysis 軟件，將所得到的數(shù)據(jù)以洗脫時間為X 軸，以質(zhì)荷比為Y 軸，以質(zhì)譜峰強(qiáng)度為Z 軸制作Landscape，直觀展示家福捕鳥蛛粗毒中多肽的疏水性（與洗脫時間有關(guān)）、相對分子質(zhì)量以及豐度的分布。

1.7 粗毒膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶解

粗毒膠內(nèi)蛋白質(zhì)原位酶解參考文獻(xiàn)［16］的方法進(jìn)行。

1.8 粗毒LC-ESI-QTOF-MS 分析及蛋白質(zhì)的搜尋鑒定

粗毒的質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)的搜尋鑒定參考文獻(xiàn)［16］的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 家福捕鳥蛛毒液

本實驗采用電刺激方法采集家福捕鳥蛛毒液，毒液為無色透明的液體，易溶于水。每只家福捕鳥蛛每次約能射毒液5 ～20 μL。家福捕鳥蛛新鮮毒液重量為1.07 mg／μL，毒液凍干后的重量為51.3 μg／μL，新鮮毒液蛋白質(zhì)含量為9.15 μg／μL，粗毒對美洲蜚蠊的半致死劑量（LD50）為85.62 μg／g。

2.2 粗毒的RP-HPLC 分離、MALDI-TOF-MS 鑒定和SDS-PAGE 分析

典型的家福捕鳥蛛粗毒的反相高效液相色譜圖見圖1A。從圖1A 中可以看出，家福捕鳥蛛粗毒的成分復(fù)雜，在215 nm 下可以檢測到40 多個色譜峰，大部分色譜峰的保留時間處于5 ～15 min 和25 ～40 min 兩個時間區(qū)域，對應(yīng)的乙腈體積分?jǐn)?shù)分別為5% ～15% 和25% ～40%。保留時間為5 ～15 min區(qū)域的色譜峰在相對分子質(zhì)量設(shè)定為1 000 ～10 000 的MALDI-TOF-MS 鑒定中沒有顯示任何質(zhì)譜峰，表明這一區(qū)域的洗脫峰主要是一些低相對分子質(zhì)量的有機(jī)化合物和鹽類。保留時間為25 ～40 min 區(qū)域的色譜峰經(jīng)MALDI-TOF-MS 鑒定為多肽分子，此區(qū)域多肽分子是家福捕鳥蛛粗毒含量最豐富的成分，也是后續(xù)開展家福捕鳥蛛毒素結(jié)構(gòu)與功能研究的主要部分。

為了對家福捕鳥蛛粗毒中的蛋白質(zhì)組分有個初步了解，采用SDS-PGAE 對粗毒中蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，除了相對分子質(zhì)量在10 000 以下的多肽外，電泳圖譜顯示粗毒在50、72 和90 kD 附近有3 條明顯的條帶（圖1B）。

眾所周知，蜘蛛粗毒主要由蛋白質(zhì)類、多肽類以及低相對分子質(zhì)量的有機(jī)化合物和鹽類組成，其中含量最多的是多肽類化合物［6］。質(zhì)譜技術(shù)特別是MALDI-TOF-MS 技術(shù)的發(fā)展為蜘蛛毒素的鑒定提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持［17］。因此，我們通過MALDI-TOF-MS 技術(shù)對家福捕鳥蛛粗毒進(jìn)行鑒定。實驗結(jié)果表明：在線性模式下，相對分子質(zhì)量設(shè)定為1 000 ～10 000 范圍內(nèi)，粗毒通過MALDI-TOF-MS鑒定到大約20 多個質(zhì)譜峰。質(zhì)譜峰的相對分子質(zhì)量分布于2 000 ～8 000 之間，大部分處于3 000 ～4 500 之間（圖1C）。

2.3 粗毒的三維直觀圖分析

圖1 家福捕鳥蛛粗毒的分離和質(zhì)譜鑒定Fig.1 Separation and mass spectrometric identification of the S. jiafu venom

由于蜘蛛粗毒的復(fù)雜性及技術(shù)的局限性，蜘蛛毒素的系統(tǒng)性研究一直是瓶頸。MALDI-TOF-MS技術(shù)及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)的發(fā)展為蜘蛛毒素的系統(tǒng)分析提供了可能［18］，Escoubas等［19］采用這種技術(shù)從澳大利亞漏斗網(wǎng)蛛兩種蜘蛛粗毒中分別鑒定到了633 個和1 018 個多肽分子。這是第一次在蜘蛛粗毒中鑒定到如此多的多肽分子，遠(yuǎn)高于以前普遍認(rèn)為的每種蜘蛛毒腺含有50 ～100 個多肽分子［20，21］。而且研究還發(fā)現(xiàn)漏斗網(wǎng)蛛粗毒中的多肽的相對分子質(zhì)量呈雙峰分布，主要分布于3 000 ～5 000之間，其次分布于6 500 ～8 500 范圍內(nèi)。這與虎紋捕鳥蛛［22］、海南捕鳥蛛［23］、敬釗纓毛蛛［24］的研究結(jié)果類似。

采用MALDI-TOF-MS 結(jié)合HPLC 分離技術(shù)，我們對家福捕鳥蛛粗毒多肽與蛋白質(zhì)的多樣性進(jìn)行了研究。大部分的色譜峰都含有一定相對分子質(zhì)量的多肽類物質(zhì)，個別峰甚至含有多達(dá)十幾個不同相對分子質(zhì)量的多肽，說明在蜘蛛毒素中存在相對分子質(zhì)量不同但疏水性特別接近的組分。本實驗一共鑒定到238 個多肽分子，顯示了粗毒多肽分子的多樣性（見圖2A）。研究還發(fā)現(xiàn)家福捕鳥蛛粗毒中多肽的相對分子質(zhì)量也呈現(xiàn)雙峰分布，但其相對分子質(zhì)量的分布特征與已報道的其他蜘蛛不同。其多肽的相對分子質(zhì)量分布為：62.5% 的多肽毒素分布在3 000 ～4 500 之間，33.2% 的多肽毒素分布在1 000～3 000 之間，在6 500 ～8 500 范圍內(nèi)很少（見圖2B）。這說明家福捕鳥蛛毒素和其他蜘蛛毒素在進(jìn)化上采用了不同的方式。因此，進(jìn)一步研究家福捕鳥蛛與其他蜘蛛毒素中多肽的分布差異，將有助于了解蜘蛛毒素的進(jìn)化機(jī)制。

通過整合實驗數(shù)據(jù)，以流分（fraction number）為X 軸，以質(zhì)荷比為Y 軸，以質(zhì)譜峰強(qiáng)度為Z 軸繪制家福捕鳥蛛粗毒多肽分子的三維直觀圖（圖2C）。該直觀圖對家福捕鳥蛛粗毒提供了詳細(xì)的注釋。通過直觀圖可以直觀地看到每一個多肽分子的保留時間、相對分子質(zhì)量以及質(zhì)譜峰強(qiáng)度，而且在反相高效液相色譜分離中沒有完全分開的多肽分子通過三維直觀圖中相對分子質(zhì)量的差異能夠區(qū)分開。從圖2C 中可以發(fā)現(xiàn)多肽分子主要處于相對分子質(zhì)量在3 000 ～4 500、保留時間在15 ～45 min 范圍內(nèi)。

圖2 家福捕鳥蛛粗毒的分子多樣性Fig.2 Molecular diversity of the S. jiafu venom

雖然在整體水平上我們對蜘蛛粗毒的相關(guān)知識有了初步的了解，但在很大程度上我們對其多肽分子多樣性和豐度的了解相當(dāng)有限，因此低估了其分子多樣性，主要原因如下［19］：1）蜘蛛粗毒是一個由很多結(jié)構(gòu)和活性不同的成分組成的復(fù)雜混合物，除了占大部分的多肽和蛋白質(zhì)外，蜘蛛毒素中含有很多鹽類和小分子化合物，這些鹽類和小分子化合物大多數(shù)很容易離子化，這些離子化的物質(zhì)干擾多肽的離子化過程，使得實驗結(jié)果不準(zhǔn)確；2）蜘蛛粗毒中經(jīng)常會存在一些相對分子質(zhì)量和疏水性特別接近的多肽分子，這些多肽分子在RP-HPLC 分離和MALDI-TOF-MS 鑒定時很難區(qū)分；3）蜘蛛粗毒中雖然多肽分子數(shù)量成百上千，但是除了數(shù)量有限的多肽分子含量較高，是高豐度多肽分子外，大部分多肽分子在粗毒中含量很低，現(xiàn)有的質(zhì)譜技術(shù)很難將其區(qū)分和鑒定。

2.4 粗毒LC-ESI-QTOF-MS 分析及蛋白質(zhì)的搜尋鑒定

為了使家福捕鳥蛛粗毒中分離的蛋白質(zhì)能夠被有效地鑒定，粗毒經(jīng)SDS-PAGE 分離后切割為6 個條帶（圖1B）。條帶被取下，經(jīng)脫色、還原烷基化后采用胰蛋白酶酶解。酶解結(jié)束后，用含有不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈水溶液對條帶進(jìn)行萃取，合并萃取液，凍干，保存于冰箱。質(zhì)譜分析時，每一條帶酶解后的多肽混合物先通過Dionex 的反相LC 分離后在線進(jìn)入Bruker 公司的microTOFQ II 質(zhì)譜分析系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜分析。獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)Bruker 公司的Data Analysis 4.0 軟件分析后以mgf 文件輸出。將得到的mgf 文件采用Mascot 軟件中的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索功能（MS／MS Ions Search）搜索，由于沒有專門的蜘蛛毒素蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，因此本文采集到的MS／MS 數(shù)據(jù)在進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜尋時所選數(shù)據(jù)庫范圍為SwissProt（蛋白序列數(shù)據(jù)庫）。

實驗發(fā)現(xiàn)酶切得到的6 個條帶中都鑒定得到了蛋白質(zhì)（條帶6 還鑒定得到了3 種多肽毒素）。條帶3 鑒定得到的蛋白質(zhì)種類最多，達(dá)到13 種蛋白質(zhì)。其中有6 種蛋白質(zhì)屬于血藍(lán)蛋白多鏈，包括Hemocyanin A chain、Hemocyanin C chain、Hemocyanin D chain、Hemocyanin E chain、Hemocyanin F chain 和Hemocyanin G chain。另外，還鑒定得到2 種鉀離子通道蛋白、2 種角蛋白、1 種鈣蛋白酶、1 種AF-17 蛋白和1 種胰蛋白酶。胰蛋白酶和角蛋白在其他條帶的鑒定中多次出現(xiàn)，考慮到這兩種蛋白質(zhì)可能是實驗污染所致，故將這兩種蛋白質(zhì)在結(jié)果中剔除。從家福捕鳥蛛粗毒中我們共鑒定得到了14 種蛋白質(zhì)：血藍(lán)蛋白、線粒體ATP 合成酶、鈣蛋白酶、神經(jīng)軟骨蛋白、鉀離子通道蛋白、線粒體載體蛋白、鋅指蛋白、多梳蛋白等（見表1）。在家福捕鳥蛛粗毒中鑒定發(fā)現(xiàn)了血藍(lán)蛋白，這與實驗室前期研究結(jié)果類似。本室研究生在對敬釗纓毛蛛［24］、大腹園蛛［25］和虎紋捕鳥蛛［26］3 種蜘蛛粗毒進(jìn)行質(zhì)譜鑒定時均鑒定得到血藍(lán)蛋白。

表1 家福捕鳥蛛粗毒中蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 1 MS identification results of proteins from S. jiafu venom

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜分離和質(zhì)譜鑒定技術(shù)對家福捕鳥蛛粗毒中多肽與蛋白質(zhì)的多樣性進(jìn)行了初步分析。通過色譜分離和質(zhì)譜鑒定從粗毒中鑒定得到238 個多肽分子。這些結(jié)果表明家福捕鳥蛛粗毒中多肽種類豐富。該研究結(jié)果為后續(xù)開展家福捕鳥蛛毒素分子的分離純化與功能研究打下基礎(chǔ)。同時也表明高效液相色譜分離技術(shù)和質(zhì)譜鑒定技術(shù)是開展蜘蛛毒素研究的一種行之有效的技術(shù)。

本文在進(jìn)行家福捕鳥蛛粗毒蛋白質(zhì)鑒定時發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)種類偏少，造成鑒定蛋白質(zhì)種類偏少的最主要原因是蜘蛛基因組或蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的缺乏；另外，儀器靈敏度不高也是一個主要原因。隨著更高靈敏度儀器的出現(xiàn)，以及將來蜘蛛基因組或蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的建立，必將有更多的家福捕鳥蛛毒素蛋白質(zhì)得到鑒定。

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