一種簡(jiǎn)單的毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置的制作方法及其在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中的應(yīng)用

金祖耀， 呂雅瑤， 周珊珊， 郝斐然， 付 斌，應(yīng)萬(wàn)濤， 錢小紅， 張養(yǎng)軍*

（1. 安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥230032；2. 蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京蛋白質(zhì)組研究中心，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京102206）

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，毛細(xì)管高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)組定性鑒定和定量分析的常用分析方法［1］。由于生物樣品中蛋白質(zhì)種類繁多、動(dòng)態(tài)范圍寬，難于實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組的深度覆蓋，特別是難于實(shí)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)的定性鑒定和定量分析，而與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物通常豐度較低，因此發(fā)展高靈敏度和高通量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法顯得非常迫切。降低生物樣品復(fù)雜程度最有效的方法之一是采用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行分離，但如果不能有效分離，排除基質(zhì)的干擾，定量結(jié)果將會(huì)受到很大的影響，產(chǎn)生“壓縮效應(yīng)”。因此建立高效的液相色譜分離技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)組的定性和定量尤為重要［2，3］。

目前，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生物樣品的高效分離，采用更長(zhǎng)的毛細(xì)管色譜柱［4，5］或更小粒徑的顆粒填料［6-8］，如亞2 μm 反相色譜填料，已經(jīng)成為解決這些問(wèn)題的重要手段之一。但是，使用更長(zhǎng)的毛細(xì)管色譜柱或裝填更小粒徑的顆粒填料，會(huì)造成色譜柱的柱壓顯著升高，這是制約其應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。雖然現(xiàn)在已有的商品化超高效微升和納升級(jí)毛細(xì)管色譜儀可以提供很高的流動(dòng)相輸出壓力，有效地解決毛細(xì)管色譜柱柱壓高的問(wèn)題，但在超高壓色譜柱條件下運(yùn)行時(shí)，毛細(xì)管色譜儀的不同連接部位常常出現(xiàn)漏液現(xiàn)象，因而造成分析進(jìn)程中斷，樣品浪費(fèi)。因此，如何降低毛細(xì)管色譜柱的反向柱壓，就成為目前毛細(xì)管高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)組定性鑒定和定量分析的主要問(wèn)題之一。

為了有效解決采用長(zhǎng)毛細(xì)管色譜柱或裝填更小顆粒填料時(shí)反向柱壓太高的問(wèn)題，提高色譜柱的使用溫度是一種可行的手段。溫度升高，流動(dòng)相的黏度降低，不僅降低了溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間的傳質(zhì)阻力，提高色譜柱分離的柱效，而且系統(tǒng)的壓力會(huì)隨著溫度的升高而降低［9，10］。早在20 世紀(jì)80 年代后期，高溫液相色譜技術(shù)就得到研究人員的高度重視［11］。1987 年，Warren［12］驗(yàn)證了溫度對(duì)反相液相色譜柱柱效的影響。1988 年，Horvath 等［13］通過(guò)對(duì)高效液相色譜分離過(guò)程中溶質(zhì)輸運(yùn)特征的理論分析，認(rèn)為提高色譜柱的柱溫是提高其分離能力的有效途徑之一。Yan 等［14］在研究高溫快速分離時(shí)，考察了系統(tǒng)壓力隨著溫度的變化情況，證實(shí)隨著溫度的升高，系統(tǒng)壓力逐漸降低。Yang 等［15］探討了溫度對(duì)塔板高度的影響，并且建立了溫度與塔板高度的數(shù)學(xué)關(guān)系。成洪達(dá)等［16］就溫度對(duì)高效液相色譜分離性能的影響進(jìn)行了全面的總結(jié)。2011 年，Rogeberg等［17］將C18-硅膠雜化整體柱用于蛋白質(zhì)酶解液的液相色譜分離時(shí)，考察了溫度對(duì)分離效率的影響。實(shí)驗(yàn)將溫度從20 ℃升到120 ℃，發(fā)現(xiàn)硅膠整體柱可以通過(guò)升高溫度來(lái)提高分離效率。以上研究工作都表明一定范圍內(nèi)提高色譜柱溫度有利于提高色譜柱的分離性能。

對(duì)于電噴霧離子源質(zhì)譜，電噴霧離子源外的毛細(xì)管色譜柱可采用毛細(xì)管色譜儀自帶的柱溫箱實(shí)現(xiàn)加熱。為了減小毛細(xì)管色譜柱的柱后效應(yīng)，提高色譜分離度和電噴霧離子源的霧化效率，在大多數(shù)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的電噴霧離子源內(nèi)，選用并安裝帶直噴頭的毛細(xì)管色譜柱（直噴毛細(xì)管色譜柱），并通過(guò)聯(lián)通件（如四通、三通或二通等）將其余色譜系統(tǒng)和高壓電極連接。但由此帶來(lái)的問(wèn)題是不易實(shí)現(xiàn)對(duì)直噴毛細(xì)管色譜柱的加熱。雖然也有帶加熱套并已經(jīng)商品化的直噴毛細(xì)管色譜柱，但都是一次性的，不能重復(fù)使用，使其使用成本顯著升高?；诖?，我們發(fā)展了一種簡(jiǎn)單的毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置的制作方法，可方便在電噴霧源內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)毛細(xì)管色譜柱的加熱。所研發(fā)的電加熱裝置制作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，操作方便，適用于毛細(xì)管高效液相色譜（cHPLC）與不同類型電噴霧源質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)毛細(xì)管色譜柱的加熱，在基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組研究和應(yīng)用中有廣闊的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

毛細(xì)管高效液相色譜-電噴霧-線性離子阱質(zhì)譜儀（HPLC-ESI-LTQ MS，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；RIGOL L-3000 高效液相色譜儀（北京普源精電科技有限公司）；Eksigent nanoLC-2D 高效液相色譜儀（美國(guó)AB SCIEX 公司）；真空冰凍干燥機(jī)（SC100A Speedvac Plus，美國(guó)Thermo Savant公司）；Sartorius BP211d 分析天平（瑞士Sartorius公司）；高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；JY-II 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；C18 zip tip 脫鹽柱、超濾管（10 kDa）和Milli2QA10 型純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；可調(diào)直流電源（EPS 301，Amersham Pharmacia Biotech 公司）；直徑為0.1 mm，電阻為200 Ω的鎳（20%）鉻（80%）合金電阻絲（上海靚凡電器有限公司）；內(nèi)徑為530 μm、外徑為690 μm 和內(nèi)徑為1.1 mm、外徑為2.6 mm 的毛細(xì)管（鄭州英諾高科有限公司）；15 cm×75 μm 的直噴頭空管柱（美國(guó)New Objective 公司）；直徑為3 μm，孔徑為10 nm的C18 填料（北京金歐亞公司）。

酵母細(xì)胞由清華大學(xué)戴俊彪實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；尿素（urea）購(gòu)于Affymetnx 公司；Tris-HCl（1 mol／L，pH 8.0）、去垢劑NP-40 購(gòu)于United States Biochemical 公司；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA 鈉鹽）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)于羅氏公司；二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、碳酸氫銨、乙腈（ACN）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Promega 公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)于北京迪拜爾生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，經(jīng)Millipore 純水系統(tǒng)純化，電阻率達(dá)到18.2 MΩ·cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置的制作方法

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)中使用的15 cm×75 μm 直噴毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行加熱，我們選取內(nèi)徑為530 μm、外徑為690 μm 的毛細(xì)管（內(nèi)徑大于毛細(xì)管色譜柱），在其外表面纏繞直徑為0.1 mm 的鎳鉻電阻絲，然后在纏繞電阻絲毛細(xì)管的外表面套上內(nèi)徑1.1 mm、外徑為2.6 mm 的毛細(xì)管，用絕緣膠布固定毛細(xì)管兩端并留出一定長(zhǎng)度的電阻絲。通過(guò)兩根連接線分別將電阻絲的兩端與可調(diào)直流電源的正、負(fù)極連接，在24 V 安全電壓條件下采用調(diào)節(jié)電流方式調(diào)節(jié)電加熱管的溫度，進(jìn)而提高毛細(xì)管色譜柱的溫度。

1.2.2 樣品前處理

酵母蛋白質(zhì)的提取及酶切方法如下。將酵母細(xì)胞在14 000 g 下離心5 min 后棄上清液，加入裂解液NETN（0.5% （v／v）NP-40，100 mmol／L NaCl，20 mmol／L Tris-HCl，1 mmol／L EDTA 鈉鹽）及蛋白酶抑制劑進(jìn)行超聲破碎，破碎后于14 000 g 下離心20 min 后取上清液，分裝到孔徑為10 kDa 的超濾管中，在14 000 g 下離心15 min。加入8 mol／L尿素，在14 000 g 下離心15 min（重復(fù)一次）。再加入50 mmol／L NH4HCO3，在14 000 g 下離心15 min（重 復(fù) 二 次）。離 心 后 加 入 50 mmol／L NH4HCO3，再加入DTT（終濃度10 mmol／L），37℃水浴中孵育4 h。再加入IAA （終濃度50 mmol／L），避光反應(yīng)1 h 后按照酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1 ∶50 加入胰蛋白酶，在37 ℃下酶切18 h。酶切后在14 000 g 下離心15 min，將所得溶液干燥后用流動(dòng)相A（含2% 乙腈和0.1% 甲酸（FA）的水溶液）重溶，終濃度為1 μg／μL。

BSA 的酶切方法如下。BSA 用50 mmol／L NH4HCO3溶解，終濃度1 μg／μL。加入DTT（終濃度10 mmol／L），37 ℃水浴中孵育4 h。再加入IAA（終濃度50 mmol／L），避光反應(yīng)1 h。然后按照酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1 ∶50 加入胰蛋白酶，在37 ℃下酶切18 h，脫鹽，干燥后用流動(dòng)相A 重溶，終濃度為1 μg／μL。

1.2.3 RIGOL 液相色譜分析條件

將Agela Venusil XBP C18 （L）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，15 nm）安裝在RIGOL L-3000 液相色譜儀上。檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，流速為0.7 mL／min；流動(dòng)相A 是含2% ACN 和0.1% FA 的水溶液，流動(dòng)相B是含98% ACN 和0.1% FA 的水溶液。洗脫梯度為：0～5 min，5%B ～8%B；5 ～26 min，8% B ～18% B；26～40 min，18%B ～32%B；40 ～42 min，32% B ～95%B；42 ～47 min，95% B；47 ～49 min，95% B ～5%B；49 ～55 min，5% B。

1.2.4 cHPLC-MS／MS 分析條件

毛細(xì)管液相色譜儀為Eksigent nanoLC-2D，毛細(xì)管反相色譜柱為實(shí)驗(yàn)室自行制備，配直噴頭空管柱（15 cm×75 μm），C18 填料粒徑為3 μm，孔徑為10 nm，分離流速為300 nL／min，樣品上樣體積為5 μL。流動(dòng)相A 和流動(dòng)相B 與1.2.3 節(jié)相同。短洗脫梯度為：0 ～5 min，5% B ～8% B；5 ～30 min，8%B ～40% B；30 ～35 min，40% B ～95% B；35 ～40 min，95% B；40 ～42 min，95% B ～5% B；42 ～52 min，5% B。長(zhǎng)洗脫梯度為：0 ～5 min，5% B ～8%B；5 ～91 min，8% B ～40% B；91 ～110 min，40%B ～95% B；110 ～120 min，95% B；120 ～125 min，95% B ～5% B；125 ～135 min，5% B。質(zhì)譜條件：選用正離子模式采集數(shù)據(jù)，質(zhì)譜掃描范圍為m／z 400.0 ～1 600.0，采集時(shí)間分別設(shè)為52 min 和135 min。在采用數(shù)據(jù)依賴（DDA）模式進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析時(shí)，選取一級(jí)質(zhì)譜中10 個(gè)信號(hào)最強(qiáng)的離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，其碰撞能量設(shè)為35 eV，采用動(dòng)態(tài)排除（dynamic exclusion）功能，排除時(shí)間為30 s。

1.2.5 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索

將質(zhì)譜采集后產(chǎn)生的raw 文件通過(guò)Thermo Proteome Discoverer（1.3.0.339 版本）內(nèi)置的Mascot 數(shù)據(jù)檢索軟件進(jìn)行檢索。參數(shù)設(shè)置：母離子質(zhì)量偏差（precursor tolerance）為0.5 Da；碎片離子質(zhì)量偏差（fragment tolerance）為0.8 Da；肽段的假陽(yáng)性率（FDR）為1%；蛋白質(zhì)酶解選用胰蛋白酶，選擇2 個(gè)漏切位點(diǎn)；固定修飾設(shè)置為半胱氨酸的烷基化修飾；可變修飾設(shè)置為甲硫氨酸氧化修飾；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)分別為牛血清白蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（2014 年12 月30 日從http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／protein／？term ＝bsa下載）和酵母蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（1 741 650 個(gè)蛋白質(zhì)，2014 年12 月26 日從http：／／www. ncbi. nlm. nih.gov／protein／？term＝y(tǒng)east 下載）。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱溫度對(duì)柱壓和柱效的影響

當(dāng)溫度升高時(shí)，流動(dòng)相黏度降低，從而降低色譜柱的柱壓。另外，由van Deemter 方程H＝A＋B／u＋Cu（H 為理論塔板高度，u 為流動(dòng)相線速度，A 為徑向擴(kuò)散系數(shù)，B 為縱向擴(kuò)散系數(shù)，C 為傳質(zhì)阻力系數(shù)）可知，流動(dòng)相的黏度降低會(huì)使流動(dòng)相和溶質(zhì)分子擴(kuò)散增強(qiáng)，既加快了流動(dòng)相和分析物分子的混合，也增加溶質(zhì)的傳質(zhì)速度，進(jìn)而增加溶質(zhì)與固定相作用的概率，從而提高了色譜柱的柱效。盡管從van Deemter 方程可以得到這些結(jié)論，但溫度對(duì)色譜柱柱壓和柱效的影響程度目前沒(méi)有確切的數(shù)據(jù)。為了考察色譜柱的溫度升高時(shí)柱壓降低和柱效增加的程度，我們首先在帶有易于控制溫度的柱溫箱的RIGOL L-3000 液相色譜儀上，考察了BSA 酶切肽段混合物在分析型色譜柱上分離時(shí)，溫度對(duì)其柱壓和柱效的影響。分別選定不同溫度下不進(jìn)樣以及上樣量為10 μg BSA 酶切肽段進(jìn)行色譜實(shí)驗(yàn)。如圖1所示，當(dāng)柱溫從25 ℃升高到70 ℃時(shí)，色譜柱反向壓力從8.27×106Pa 降低到4.48×106Pa，降低了46%。我們統(tǒng)計(jì)不同柱溫下分離10 μg BSA 酶切肽段混合物時(shí)的峰容量，由表1 可以看出，當(dāng)柱溫從25 ℃升高到70 ℃時(shí)，其峰容量從63 個(gè)色譜峰上升到71 個(gè)色譜峰，增加了8 個(gè)色譜峰。在一定范圍內(nèi)，柱效隨著柱溫升高而增加。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明升高色譜柱的溫度可顯著降低柱壓，柱效也略有提高。

圖1 不同溫度下空白的柱壓隨時(shí)間的變化Fig.1 Change of the column pressure of a blank sample over time at different temperatures

表1 不同柱溫下分離10 μg BSA 酶切肽段混合物時(shí)的峰容量Table 1 Peak capacity of 10 μg BSA digestion separated at different column temperatures

2.2 毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置的制作及應(yīng)用

基于上述色譜柱溫度對(duì)柱壓及柱效影響程度的考察結(jié)果，我們發(fā)展了一種簡(jiǎn)單的毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置制作方法，并將該裝置與質(zhì)譜儀、毛細(xì)管色譜儀進(jìn)行連接，構(gòu)成液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)。如圖2 所示，毛細(xì)管內(nèi)部溫度不易測(cè)定，但根據(jù)焦耳定律，在電阻恒定的條件下，電流越大產(chǎn)生的熱量越大；時(shí)間越長(zhǎng)產(chǎn)生的熱量越多。在對(duì)毛細(xì)管色譜柱加熱過(guò)程中，流動(dòng)相會(huì)帶走產(chǎn)生的部分熱量，達(dá)到一定的平衡。因此，在可調(diào)直流電源的輸出小于或等于24 V 的情況下，通過(guò)改變輸出電流來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)部毛細(xì)管的溫度，以達(dá)到降低毛細(xì)管色譜柱柱壓和增加柱效的目的。

2.3 毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置的性能評(píng)價(jià)

為了測(cè)定毛細(xì)管色譜柱溫度升高時(shí)對(duì)柱壓及柱效的影響程度，我們采用實(shí)驗(yàn)室裝填的帶噴頭的毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在電加熱裝置上分別施加0、60、80、100、120、140 和160 mA 電流，對(duì)牛血清白蛋白酶切肽段混合物進(jìn)行HPLC-ESI-LTQ MS 分析，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次。

圖2 毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置及與質(zhì)譜聯(lián)用示意圖Fig.2 Schematic diagram of an electric heating apparatus for heating capillary chromatographic columns coupled to mass spectrometry

當(dāng)電加熱裝置上施加不同電流分離BSA 酶切肽段混合物時(shí)，色譜柱柱壓隨電流的變化如圖3 所示。可以看出，電流從0 mA 升高至160 mA 時(shí)，柱壓從1.24×107Pa 下降到4.83×106Pa，降低幅度接近61%。

對(duì)電加熱裝置施加100 mA 電流，重復(fù)分離BSA 酶切肽段混合物，考察該電加熱裝置的重復(fù)性，基峰色譜圖如圖4 所示。由分離結(jié)果看出色譜保留時(shí)間基本一致，表明我們制作的電加熱裝置性能穩(wěn)定。我們將施加不同電流條件下的兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，基峰色譜圖中的色譜峰寬取平均值（Wh），根據(jù)公式Pc＝1＋［（2.35／4）（t／Wh）］算出峰容量。其中Pc為峰容量，t 為有效梯度的時(shí)間，Wh為峰寬的平均值。由表2 可以看出，當(dāng)電流從0 mA升高到100 mA 時(shí)，BSA 酶切肽段混合物的峰容量從51 個(gè)色譜峰上升到68 個(gè)色譜峰，增加了17 個(gè)色譜峰；而當(dāng)電流增加到160 mA 時(shí)峰容量下降到25個(gè)色譜峰，表明在一定電流范圍內(nèi)柱效隨著柱溫升高而提高。

圖3 在電加熱裝置上施加不同電流時(shí)毛細(xì)管色譜柱分離BSA 酶切肽段混合物時(shí)柱壓的變化曲線Fig.3 Chromatographic column back pressure curves when separating BSA digestions on a capillary chromatographic column heated by the electric heating apparatus at different electric currents

圖4 電加熱裝置上施加100 mA 電流時(shí)重復(fù)分離BSA酶切肽段混合物的基峰色譜圖Fig.4 Base peak chromatograms of BSA digestion repeatedly separated with the electric heating apparatus at electric current of 100 mA

表2 不同電流下分離BSA 酶切肽段混合物的色譜峰容量Table 2 Peak capacity of BSA digestion separated at different electric currents

將所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Mascot 搜庫(kù)后，對(duì)不同電流下分離鑒定BSA 酶切肽段混合物時(shí)的肽段數(shù)及覆蓋率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值后做折線圖，結(jié)果如圖5 所示。電流從0 mA 升到100 mA 電流的過(guò)程中，肽段數(shù)基本維持在44 個(gè)左右，覆蓋率從72% 增加到90%；當(dāng)電流增加到140 mA時(shí)，肽段數(shù)略有下降；而當(dāng)電流增加到160 mA 時(shí)肽段數(shù)下降到20 個(gè)，覆蓋率降低到34%。另外，我們提取了部分電流（0 mA、100 mA、160 mA）時(shí)的基峰色譜圖，如圖6 所示。當(dāng)加上電流，即加熱后色譜峰的出峰時(shí)間有所提前；但當(dāng)電流增加到160 mA 時(shí)，色譜峰過(guò)度分散且信號(hào)強(qiáng)度降低。這可能是流動(dòng)相因溫度過(guò)高氣化所致，因此，分離時(shí)應(yīng)選擇最佳柱溫，即最佳電流。

綜上可以看出，在BSA 酶切肽段混合物進(jìn)行LC-ESI-MS／MS 分析時(shí)，利用毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置可以有效地降低柱壓，選擇最佳電流可在一定程度上提高柱效。

圖5 電加熱裝置施加不同電流時(shí)鑒定的BSA 酶切肽段混合物中的肽段數(shù)及覆蓋率Fig.5 Peptide number and coverage of BSA digestion with the electric heating apparatus at different electric currents

圖6 電加熱裝置分別施加電流（a）0 mA、（b）100 mA 和（c）160 mA 時(shí)分離BSA 酶切肽段混合物的基峰色譜圖Fig.6 Base peak chromatograms of BSA digestion separated with the electric heating apparatus at electric currents （a）0 mA，（b）100 mA and （c）160 mA

2.4 復(fù)雜樣本分析中的應(yīng)用

為了對(duì)毛細(xì)管電加熱裝置的性能進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)，我們將其應(yīng)用到酵母蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的分析中。將酵母細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)酶切后，直接在裝有毛細(xì)管電加熱管的cHPLC-MS／MS 儀器上進(jìn)行分析，電流分別設(shè)置為0 mA 和100 mA，實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次。圖7 是對(duì)電加熱裝置施加100 mA 電流分離酵母蛋白質(zhì)酶切肽段混合物時(shí)兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的基峰色譜圖，由分離結(jié)果看出色譜保留時(shí)間基本一致，表明我們制作的電加熱裝置具有穩(wěn)定的性能。

電流為0 mA 和100 mA 條件下分離酵母蛋白酶切肽段混合物時(shí)，柱壓隨時(shí)間變化曲線如圖8 所示?？梢钥闯?，在0 mA 電流條件下，柱壓約為1.38×107Pa；在100 mA 電流條件下，柱壓約為6.90×106Pa，降低了50%。

圖7 電加熱裝置上施加100 mA 電流時(shí)重復(fù)分離酵母酶切肽段混合物的基峰色譜圖Fig.7 Base peak chromatograms of yeast digestion repeatedly separated with the electric heating apparatus at electric current of 100 mA

圖8 電加熱裝置分別施加0 mA 和100 mA 電流時(shí)酵母酶切肽段混合物分離的柱壓隨時(shí)間變化的曲線Fig.8 Chromatographic column back pressure curves to time for separating yeast digestion with the electric heating apparatus at the electric currents 0 mA and 100 mA

我們提取了0 mA 及100 mA 電流下酵母蛋白質(zhì)酶切混合物分離的基峰色譜圖（見(jiàn)圖9），將兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得基峰色譜圖中的色譜峰峰寬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)上述相同方法計(jì)算峰容量，當(dāng)電流從0 mA升高到100 mA 時(shí)，峰容量從63 個(gè)色譜峰上升到81個(gè)色譜峰，增加了18 個(gè)色譜峰，表明增加加熱電流（即柱溫）可使柱效略有增加。

圖9 電加熱裝置分別施加（a）0 mA 和（b）100 mA 電流時(shí)分離酵母酶切肽段混合物的基峰色譜圖Fig.9 Base peak chromatograms of yeast digestion separated with the electric heating apparatus at the electric currents （a）0 mA and（b）100 mA

由圖9 還可看出，電流為100 mA 時(shí)，色譜峰保留時(shí)間提前，與分離BSA 肽段混合物時(shí)的結(jié)果一致。將所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行Mascot 搜庫(kù)，兩次實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果取均值，結(jié)果如圖10 所示。由圖10 可以看出，施加電流后從酵母蛋白酶切肽段混合物中鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量從145 個(gè)增加到154 個(gè)，肽段數(shù)量從292 個(gè)增加到310 個(gè)。無(wú)論是蛋白數(shù)還是肽段數(shù)皆有所增加，這與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分離時(shí)的趨勢(shì)相同，進(jìn)一步證實(shí)了毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置對(duì)柱壓的降低和柱效的提高有一定作用。這些結(jié)果表明，我們發(fā)展的毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置制作方法，可為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的電噴霧離子源內(nèi)直噴毛細(xì)管色譜柱加熱提供一種簡(jiǎn)單、可靠的裝置，為選擇使用更小粒徑的色譜顆粒填料提供了一種降低柱壓的有效手段。

圖10 電加熱裝置施加不同電流時(shí)酵母酶切肽段混合物的鑒定結(jié)果Fig.10 Identification of the yeast digestion with the electric heating apparatus at different electric currents

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種簡(jiǎn)單的毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置的制作方法，并將基于該方法制作的毛細(xì)管色譜柱電加熱裝置與cHPLC-MS／MS 聯(lián)用，分別用于牛血清白蛋白酶切肽段混合物和酵母蛋白酶切肽段混合物的分離，從柱壓和柱效兩方面來(lái)對(duì)該裝置進(jìn)行了性能評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論對(duì)簡(jiǎn)單的還是復(fù)雜的生物樣本，毛細(xì)管柱電加熱管與小粒徑填料的毛細(xì)管柱聯(lián)用在100 mA 電流下分離酶切肽段，其柱壓比不加電流分離時(shí)降低50% 左右，而且柱效也相應(yīng)地有所增加。這為我們發(fā)展和選擇在低柱壓條件下的更小顆粒填料毛細(xì)管色譜柱奠定了基礎(chǔ)。

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