活性氧影響單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)7721肝癌上皮細(xì)胞的侵襲

陳國(guó)薇，吳 嫚，張 超，劉武康，丁承超，吳淑燕，李 森，劉 箐

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

活性氧影響單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)7721肝癌上皮細(xì)胞的侵襲

陳國(guó)薇，吳 嫚，張 超，劉武康，丁承超，吳淑燕，李 森*，劉 箐*

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

用還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶抑制劑二苯基氯化碘鹽（diphenyleneiodonium chloride，DPI）處理單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）后，用2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯熒光法測(cè)定L. monocytogenes中的活性氧（reactive oxygen species，ROS），結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)源性ROS明顯降低且有DPI濃度依賴性。進(jìn)而用ROS產(chǎn)生能力降低的L. monocytogenes侵襲7721肝癌上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示：在1～10 μmol/L的DPI濃度范圍內(nèi)，隨著L. monocytogenes內(nèi)ROS水平的降低，L. monocytogenes侵襲7721上皮細(xì)胞的能力卻隨之增長(zhǎng)。本研究提示：L. monocytogenes可能和高等動(dòng)植物一樣存在類似于負(fù)責(zé)產(chǎn)生ROS的NADPH氧化酶，由其介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可能調(diào)控L. monocytogenes侵襲細(xì)胞的能力。

單核細(xì)胞增生李斯特菌；活性氧；侵襲；上皮細(xì)胞

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種人畜共患的病原菌[1]，被世界衛(wèi)生組織列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌之后的第四大重要的食源性致病菌[2]，廣泛寄生于土壤、污水、人和動(dòng)物的糞便、飼料及肉類、蛋類、禽類等食品中。食源性L. monocytogenes可以經(jīng)受高溫烹飪、胃部強(qiáng)酸環(huán)境等考驗(yàn)后隨食物一同到達(dá)腸道，首先跨越人體的腸道屏障，通過(guò)內(nèi)化作用進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞或吞噬細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間進(jìn)行復(fù)制，進(jìn)而隨淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)胎盤和大腦，越過(guò)胎盤屏障、血腦屏障，造成一系列疾病[3]。在食用被單增李斯特菌污染的食物后，將會(huì)導(dǎo)致腦膜炎、骨髓炎、心肌炎、孕婦流產(chǎn)以及產(chǎn)褥感染等疾病[4]。在美國(guó)，每年至少有500 例因食用L. monocytogenes污染的食品而中毒死亡的事件發(fā)生[5]。2004年北京市食品中L. monocytogenes污染狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，L. monocytogenes在熟肉制品中檢出率高達(dá)48%；2007年珠海市冷凍食品中L. monocytogenes污染狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，L. monocytogenes在冷凍水產(chǎn)品中的檢出率達(dá)36%[6]。

還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是動(dòng)植物細(xì)胞中專門產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基最重要的酶之一，該酶由gp91phox、p22phox、p40phox、p47phox和p67phox 5 個(gè)亞基組成[7]，由NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性ROS主要包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過(guò)氧化物、烷氧基、以及O2衍生的非自由基物種如過(guò)氧化氫[8]。研究表明[9-11]，由NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS是高等動(dòng)植物基因表達(dá)調(diào)控的重要信號(hào)分子。原核生物的呼吸作用一般發(fā)生在細(xì)胞膜上，由細(xì)胞膜上相關(guān)的酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，因此細(xì)菌中ROS主要產(chǎn)生部位是細(xì)胞膜。細(xì)菌中ROS大部分是在呼吸鏈上的酶催化的氧分子連續(xù)單價(jià)電子的傳遞反應(yīng)產(chǎn)生的，例如大腸桿菌細(xì)胞膜呼吸鏈中所產(chǎn)生的過(guò)氧化氫能夠占到總量的87%左右[12]。此外，生長(zhǎng)環(huán)境也對(duì)ROS的產(chǎn)生有影響，例如電離、紫外輻射以及環(huán)境中某些小分子物質(zhì)等作用于細(xì)菌時(shí)，也會(huì)對(duì)ROS的產(chǎn)量造成影響[13-14]。Lam等[15]發(fā)現(xiàn)由NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生ROS在L. monocytogenes侵染吞噬細(xì)胞過(guò)程中首先激發(fā)了吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶活力，進(jìn)而產(chǎn)生應(yīng)答。Adolph等[16]研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS是宿主細(xì)胞受到外源信號(hào)刺激時(shí)激活細(xì)胞自身凋亡程序的一個(gè)關(guān)鍵因素。但是，由NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS對(duì)于L. monocytogenes侵襲上皮細(xì)胞過(guò)程中所起到的作用，在此方面研究還較少。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)改變L. monocytogenes的ROS水平，在此基礎(chǔ)上去侵襲7721肝癌上皮細(xì)胞，然后統(tǒng)計(jì)侵襲水平，進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)而確定ROS在L. monocytogenes侵襲上皮細(xì)胞中是否具有一定作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：L. monocytogenes（ATCC 43251） 上?；墼派锟萍加邢薰?；Li英諾克李斯特菌株（CICC 10297） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

細(xì)胞：人肝癌上皮細(xì)胞7721。

腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco，DMEM）細(xì)胞培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；二苯基氯化碘鹽（diphenyleneiodonium chloride，DPI）、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichloro fluorescein diacetate easter，DCFH-DA）、聚乙二醇辛基苯基醚（octyl phenoxy poly ethoxy，Triton X-100） 美國(guó)Sigma公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）熒光染料 美國(guó)Vector公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；硫酸慶大霉素 上海世澤生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)分子儀器公司；Nikon A1激光掃描共聚焦顯微鏡 日本尼康公司；Eppendorf 5424離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司。

1.3.1 L. monocytogenes的DPI處理及ROS含量的測(cè)定

挑取L. monocytogenes單菌落接種于滅菌BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)完成后再吸取少量新鮮菌液于新鮮滅菌BHI液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至光密度（OD600nm）為0.3。取1 mL菌液分別加入終濃度為0、1、5、10、100 μmol/L的DPI，37 ℃條件下靜置1 h后離心并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）清洗3 次后重懸（下同）。吸取重懸菌液100 μL添加到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600nm值，以檢測(cè)細(xì)菌的初始濃度。將培養(yǎng)板于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)板中菌液的增殖狀況（OD600nm）和熒光值（激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)530 nm，下同），再向每個(gè)孔中添加20 μmol/L的DCFH-DA，密封避光置于37 ℃溫度下，30 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔菌液的熒光值[17]，結(jié)果以相對(duì)未處理組的百分比表示。

1.3.2 DPI對(duì)細(xì)菌活性及生長(zhǎng)狀況影響的測(cè)定

細(xì)菌DPI處理及PBS清洗同上1.3.1節(jié)，24 h后測(cè)量細(xì)菌濃度（OD600nm）以確定細(xì)菌的增殖狀況，之后向每孔添加20 μL、5 mg/mL的MTT，密封后置于37 ℃條件下反應(yīng)4 h后離心，棄去上層液體后添加二甲基亞砜（dimethylslphoxide，DMSO），振蕩溶解藍(lán)色結(jié)晶后在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔光密度值。該MTT方法可確定細(xì)菌自身的活性，這是因?yàn)榛罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用多功能酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值，可間接反映細(xì)胞活性。生長(zhǎng)狀況則是在DPI處理細(xì)菌并清洗后，使用生理鹽水進(jìn)行稀釋，均勻涂布于BHI固體培養(yǎng)基上于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)過(guò)夜，統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)。細(xì)菌活性（OD570nm）和生長(zhǎng)狀況（OD600nm）結(jié)果均以相對(duì)未處理組的百分比表示。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響的測(cè)定

細(xì)菌DPI處理及PBS清洗同1.3.1節(jié)，清洗后重懸，取適量菌液接種于不含胎牛血清的DMEM不完全細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每30 min為一組，測(cè)定OD600nm及MTT活性測(cè)試（同1.3.2節(jié)）。根據(jù)結(jié)果選取不同DPI處理組分之間細(xì)菌活性及數(shù)量差異很小的最大時(shí)間點(diǎn)，以確定細(xì)菌侵襲細(xì)胞時(shí)間。

畜牧獸醫(yī)動(dòng)物防疫問(wèn)題一直是畜牧業(yè)發(fā)展的重難點(diǎn)問(wèn)題，畜牧獸醫(yī)防疫工作能否順利開(kāi)展是衡量一個(gè)國(guó)家農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化程度的重要指標(biāo)，因此受到了各國(guó)政府的重視。但是，現(xiàn)階段我國(guó)基層畜牧獸醫(yī)動(dòng)物防疫工作存在一系列問(wèn)題，嚴(yán)重制約了我國(guó)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展。因此，對(duì)畜牧獸醫(yī)動(dòng)物防疫工作存在的問(wèn)題進(jìn)行深入的研究，并在此基礎(chǔ)上提出改進(jìn)畜牧獸醫(yī)動(dòng)物防疫工作的建議顯得尤為重要。

1.3.4 抗生素及Triton X-100對(duì)細(xì)菌的作用檢測(cè)

使用慶大霉素處理細(xì)菌，設(shè)置不同質(zhì)量濃度慶大霉素加于BHI固體培養(yǎng)基中，然后取培養(yǎng)的新鮮L. monocytogenes稀釋并涂布于固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下靜置過(guò)夜培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。選取合適的慶大霉素質(zhì)量濃度并加入到新鮮菌液中，37 ℃條件下靜置1 h后稀釋涂布，進(jìn)行驗(yàn)證。取新鮮培養(yǎng)的L. monocytogenes及L. monocytogenes菌液于離心管內(nèi)，加入1%的Triton X-100于25 ℃條件下處理0、45、60 min后，稀釋并涂于BHI固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)過(guò)夜，統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)，結(jié)果以相對(duì)未處理組的百分比表示。

1.3.5 細(xì)菌侵襲細(xì)胞及免疫組化

細(xì)菌DPI處理及清洗同1.3.1節(jié)細(xì)菌清洗后使用不含胎牛血清的不完全DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞已在此之前已計(jì)數(shù)并接入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板并貼壁。取適量重懸菌液于孔板中，控制感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為100∶1（細(xì)菌數(shù)量∶細(xì)胞數(shù)量）[18]。于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)1.5 h后，加入終質(zhì)量濃度為700 μg/mL的慶大霉素，37 ℃條件下作用1 h后用PBS清洗3 次。加入1% Triton X-100 25 ℃條件下處理30 min，然后進(jìn)行稀釋并涂布于BHI固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)過(guò)夜后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)[19]。免疫組化則為提前在細(xì)胞培養(yǎng)板中接入細(xì)胞爬片，將7721貼壁細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，完成后清洗，進(jìn)行免疫組化。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPI處理后對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)狀況及ROS的影響

圖1 DPI處理后對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)狀況及ROS的影響Fig.1 Effect of DPI on bacterial growth and ROS production

將L. monocytogenes在其最適生長(zhǎng)條件下使用DPI處理1 h后，檢測(cè)其生長(zhǎng)增殖、活性及ROS的變化。如圖1A所示，用DPI處理1 h后，細(xì)菌生長(zhǎng)沒(méi)有受到較大影響，OD600nm及MTT活性（OD570nm）相對(duì)比較穩(wěn)定。當(dāng)DPI濃度增至100 μmol/L時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)狀況大幅降低。圖1B是ROS相對(duì)值隨著DPI抑制濃度的增大而逐漸降低，當(dāng)DPI濃度為10、100 μmol/L時(shí)，ROS相對(duì)值分別下降38%、59%。由此可見(jiàn)，當(dāng)DPI達(dá)到100 μmol/L時(shí)，L. monocytogenes生長(zhǎng)受到了較大的抑制，活菌數(shù)量降低明顯，但是在低于DPI濃度10 μmol/L情況下，活菌數(shù)量并未有較大差異，結(jié)合圖1B，ROS相對(duì)值卻有了明顯的降低，所以選取細(xì)菌侵襲細(xì)胞DPI抑制濃度最大到10 μmol/L。圖1C為L(zhǎng). monocytogenes在被不同濃度DPI處理后稀釋涂BHI平板后生長(zhǎng)狀況的直觀結(jié)果。

2.2 不完全細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌增殖及活性的影響

由于在細(xì)菌侵襲實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要細(xì)菌與細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中共培養(yǎng)一定時(shí)間，而胎牛血清營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜并難以分析，所以使用不含胎牛血清的不完全DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基作為營(yíng)養(yǎng)源。不同的細(xì)菌在不完全細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率及活性變化是不一樣的，并且隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)菌數(shù)量將發(fā)生較大的改變，將會(huì)改變?cè)O(shè)定好的MOI＝100∶1，所以把DPI抑制處理過(guò)的細(xì)菌洗掉DPI后接種于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)，選取不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行OD600nm及MTT活性測(cè)試。

由圖2A可知，3 種細(xì)菌在不完全細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.5 h后檢測(cè)其OD600nm和MTT活性，在這5 個(gè)濃度階梯內(nèi)，OD600nm及MTT并未發(fā)生明顯變化，但是在100 μmol/L時(shí)有較為明顯的降低。圖2B為培養(yǎng)4 h后OD600nm和MTT活性值，發(fā)現(xiàn)在DPI濃度為100 μmol/L時(shí)，OD600nm和MTT活性發(fā)生了明顯的降低，但其他組分之間差異并不明顯。因此，當(dāng)細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)到4 h時(shí)，細(xì)菌數(shù)量及活性已經(jīng)發(fā)生了非常大的變化，干擾細(xì)菌侵襲細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，但是1.5 h時(shí)細(xì)菌能夠進(jìn)入細(xì)胞并且數(shù)量及活性并未發(fā)生較大變化，所以侵襲時(shí)間確定為1.5 h，DPI濃度則選取0～10 μmol/L。

圖2 不完全細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌增殖及活性的影響Fig.2 Effect of incomplete cell culture medium on bacterial growth and activity

2.3 抗生素質(zhì)量濃度及Triton X-100作用時(shí)間的確定

在細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)1.5 h后，已經(jīng)有部分活性較好的細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞，但是在外部還是存有大量的細(xì)菌，需將細(xì)胞外部細(xì)菌最大程度的滅活并且不影響細(xì)胞活性。設(shè)置不同質(zhì)量濃度的慶大霉素固體培養(yǎng)基，將已經(jīng)生長(zhǎng)到飽和狀態(tài)的新鮮菌液涂布于含不同質(zhì)量濃度的慶大霉素固體培養(yǎng)基上，基于不完全細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)慶大霉素作用有所抵消，故要適當(dāng)加大慶大霉素的質(zhì)量濃度。最終確定慶大霉素質(zhì)量濃度為700 μg/mL，將新鮮飽和菌液接種于含有慶大霉素700 μg/mL的培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下作用1 h后稀釋涂板，對(duì)照組為接種于不含慶大霉素的培養(yǎng)基，于37 ℃條件下靜置過(guò)夜培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)（圖3A）。使用慶大霉素處理1 h后的L. monocytogenes涂布于BHI平板培養(yǎng)基，已經(jīng)基本不會(huì)生長(zhǎng)細(xì)菌，證明在700 μg/mL的慶大霉素處理下，細(xì)菌已經(jīng)基本全部被殺死，和對(duì)照組形成鮮明對(duì)比。因此，在細(xì)菌侵襲細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中選擇慶大霉素700 μg/mL殺死胞外細(xì)菌。

選取1%的Triton X-100，經(jīng)過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色證明在0.5 h內(nèi)細(xì)胞已被破碎掉，胞內(nèi)菌得到釋放。由于Triton X-100處理細(xì)胞的過(guò)程時(shí)組分較多，會(huì)造成一定的時(shí)間誤差，為確保在誤差范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)造成影響，故設(shè)置不同時(shí)間梯度的組分，將新鮮菌液直接暴露于1%的Triton X-100中，然后分別稀釋涂板。如圖3B所示，L. monocytogenes 43251處理60 min后，數(shù)量都沒(méi)有發(fā)生較大變化，說(shuō)明L. monocytogenes在被1%的Triton X-100作用長(zhǎng)達(dá)1 h后生長(zhǎng)狀況沒(méi)有受到影響，保證可以破壞細(xì)胞使細(xì)菌完整釋放。圖3C為使用Triton X-100處理不同時(shí)間后稀釋涂平板結(jié)果。

圖3 抗生素質(zhì)量濃度及Triton X-100作用時(shí)間的確定Fig.3 Screening of optimal concentration of antibiotics and optimal treatment duration with Triton X-100

2.4 細(xì)菌侵襲細(xì)胞

由圖4A可知，在ROS被抑制到不同程度后，L. monocytogenes侵襲細(xì)胞的能力也有所改變，隨著ROS的降低，細(xì)菌侵襲細(xì)胞的數(shù)量卻隨之增加。在DPI濃度為10 μmol/L時(shí)，侵襲比率增至4 倍。圖4B為L(zhǎng). monocytogenes侵襲細(xì)胞后，免疫組化處理后采用共聚焦顯微鏡拍攝圖片，并使用Li英諾克李斯特菌株作為對(duì)照。

圖4 細(xì)菌侵襲細(xì)胞實(shí)驗(yàn)Fig.4 Observation of bacterial invasion of epithelial cells

3 討 論

本研究證實(shí)，在L. monocytogenes中存在有類似高等動(dòng)植物的NADPH氧化酶，由其介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS在其侵襲上皮細(xì)胞時(shí)具有一定的作用。在一定濃度范圍內(nèi)，L. monocytogenes侵襲7721上皮細(xì)胞的能力呈現(xiàn)的趨勢(shì)為隨著細(xì)菌攜帶ROS水平的降低而升高。ROS對(duì)致病菌致病力一般有上調(diào)或是下調(diào)兩種影響，根據(jù)細(xì)菌的種類不同影響程度也有所不同。Corcionivoschi等[20]在研究ROS與空腸彎曲菌（致病力時(shí)發(fā)現(xiàn)，黏膜免疫過(guò)程中釋放的ROS會(huì)擾亂磷酸酪氨酸信號(hào)，從而下調(diào)了該細(xì)菌的致病力）。Bao Gaihong等[21]在研究硫色鐮刀菌對(duì)馬鈴薯塊莖造成干腐病的致病性時(shí)發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌的ROS過(guò)量生成以及消除ROS的相關(guān)還原性酶活力降低，使馬鈴薯塊莖的細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化且細(xì)胞膜失去完整性，是其侵襲和致病的機(jī)理之一。在益生菌方面，Lin等[22]的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)出生后腸道發(fā)育未成熟的小鼠使用鼠李糖乳桿菌灌胃可以明顯降低感染性腸炎的發(fā)病率，其機(jī)理是該種益生菌可以使腸道上皮細(xì)胞局部的ROS產(chǎn)量增加，使與炎癥信號(hào)產(chǎn)生相關(guān)的酶類被氧化后失活，大大降低炎癥發(fā)生的概率。并且較高的ROS水平會(huì)對(duì)細(xì)菌本身的生長(zhǎng)造成影響，但是環(huán)境中少量的ROS會(huì)激發(fā)細(xì)菌的防御體系，增殖減緩并非細(xì)菌本身受到殺傷，而可能是細(xì)菌的主動(dòng)行為，目的是為了減少突變的發(fā)生和原發(fā)性損傷[23]，較小范圍抑制ROS并不會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)造成較大影響。

但是，由NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS并不是調(diào)控L. monocytogenes侵襲上皮細(xì)胞的唯一因素，已有研究[24-25]表明在L. monocytogenes侵染進(jìn)入各種上皮細(xì)胞的過(guò)程中，L. monocytogenes分泌的內(nèi)化素A和B是起關(guān)鍵作用的毒力因子，通過(guò)與宿主細(xì)胞上的受體E-cadherin和Met分別配位，實(shí)現(xiàn)L. monocytogenes與宿主細(xì)胞間的相互識(shí)別。并且也有研究[18]證實(shí)L. monocytogenes分泌的毒力因子RecA可以幫助L. monocytogenes抵御胃酸和膽汁的侵害，并能加速侵染腸道上皮細(xì)胞。L. monocytogenes作為致死率極高的胞內(nèi)寄生菌，其跨越人體內(nèi)腸道屏障的機(jī)制是其侵害人體的關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)表明，ROS對(duì)于L. monocytogenes進(jìn)入上皮細(xì)胞是有影響的，從細(xì)菌內(nèi)部的ROS入手，通過(guò)摸索菌的ROS水平及生長(zhǎng)特性，調(diào)控ROS水平后進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。在改變ROS水平后，L. monocytogenes的侵襲能力發(fā)生了一定的變化，但是在細(xì)菌中ROS水平可能并不是完全由NADPH氧化酶所決定的，所以可能是ROS在L. monocytogenes侵襲上皮細(xì)胞的過(guò)程中起到了“信號(hào)分子”的作用。本研究是從細(xì)菌的ROS水平入手進(jìn)行研究，在研究過(guò)程中，7721肝癌上皮腫瘤細(xì)胞本身的ROS水平具體的變化并未具體探明，是否在細(xì)胞ROS及細(xì)菌ROS之間存在一定的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究說(shuō)明。但是，總體來(lái)說(shuō)，本研究在2.1～2.3節(jié)結(jié)果穩(wěn)定的條件下，精選細(xì)菌后調(diào)控了其ROS水平，在組分之間細(xì)胞水平一致的情況下，確實(shí)證明L. monocytogenes的ROS水平與L. monocytogenes對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲有關(guān)聯(lián)，隨著ROS水平的降低，侵襲能力隨之增加。

綜上所述，L. monocytogenes中主要由NADPH氧化酶調(diào)控的ROS在被改變的情況下，L. monocytogenes侵襲上皮細(xì)胞的能力也有所改變，可能是作為一種信號(hào)分子而發(fā)揮作用。這一觀點(diǎn)對(duì)研究L. monocytogenes如何在人體內(nèi)對(duì)身體造成嚴(yán)重的危害提供了新思路，對(duì)于食源性致病菌L. monocytogenes的致病機(jī)理也有一定的探索，并且啟發(fā)了對(duì)于其他食源性致病菌侵害人體的機(jī)理的研究，以便更好地控制食源性致病菌L. monocytogenes對(duì)人類健康造成的影響。

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Effect of Reactive Oxygen Species (ROS) on the Invasion of Listeria monocytogenes to 7721 Epithelial Cells

CHEN Guowei, WU Man, ZHANG Chao, LIU Wukang, DING Chengchao, WU Shuyan, LI Sen*, LIU Qing*
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

Diphenyleneiodonium chloride (DPI), which can inhibit the activity of NADPH oxidase and reduce endogenous reactive oxygen species (ROS), was used to reduce the generation of ROS in Listeria monocytogenes, which was then allowed to invade 7721 epithelial cells of human hepatocellular carcinoma. The results showed that the endogenous ROS in L. monocytogenes was markedly decreased in the presence of DPI in a concentration-dependent way. Within the DPI concentration range of 1-10 μmol/L, as the level of ROS in reduced, its ability to invade 7721 epithelial cells increased. This illustrates that L. monocytogenes may have a NADPH oxidase similar to that of higher plants and animals, which is responsible for the production of ROS and regulates the invasion ability possibly by mediating ROS production, suggesting that NADPH oxidase may be an important signal molecule for L. monocytogenes to invade 7721 epithelial cells.

Listeria monocytogenes; reactive oxygen species (ROS); invasion; epithelial cells

Q932

A

1002-6630（2015）21-0117-06

10.7506/spkx1002-6630-201521023

2014-12-31

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371776）

陳國(guó)薇（1989—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【虏C(jī)理。E-mail：vickey5895@126.com

*通信作者：李森（1982—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【尾C(jī)理。E-mail：lisen_1027@126.com

劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【虏C(jī)理及安全控制。E-mail：liuq@usst.edu.cn