姜黃素以端粒酶為靶點(diǎn)治療Aβ?lián)p傷的體外研究

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(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

姜黃素以端粒酶為靶點(diǎn)治療Aβ?lián)p傷的體外研究

肖子建，謝明*，周桂娟，蘭芳，鄧琦

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

目的探討端粒酶在姜黃素治療β淀粉樣蛋白(Aβ)損傷的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)中的作用。方法用Aβ1-42(10 μg/mL)預(yù)處理SK-N-SH細(xì)胞建立損傷的細(xì)胞模型后，用姜黃素(10 μg/mL)干預(yù)治療組，處理前后檢測細(xì)胞存活率、細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平及hTERT的表達(dá)水平，并通過RNA干擾技術(shù)降低hTERT的表達(dá)，以此驗證端粒酶在姜黃素的干預(yù)作用中所起的作用。結(jié)果Aβ1-42預(yù)處理組的氧化應(yīng)激水平及細(xì)胞毒性均有顯著增高(P<0.001)，hTERT的表達(dá)水平明顯下降(P<0.001)。姜黃素干預(yù)使SK-N-SH細(xì)胞免受Aβ1-42損傷(P<0.001)并上調(diào)hTERT的表達(dá)水平(P<0.001)。而當(dāng)端粒酶活性被TERT的小分子干擾RNA抑制后，姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用也隨之消失(P>0.05)。結(jié)論姜黃素對抗Aβ毒性的神經(jīng)保護(hù)作用有賴于端粒酶活性，端粒酶則可能是姜黃素治療效應(yīng)的靶點(diǎn)。

β淀粉樣蛋白； 姜黃素； 端粒酶； 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

β淀粉樣蛋白(amyloid-beta peptide，Aβ)普遍被認(rèn)為是導(dǎo)致阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)一切神經(jīng)損傷的根源[1]，Aβ的聚積在AD發(fā)生及發(fā)展過程中起著重要作用[2]。在一些以Aβ為靶點(diǎn)進(jìn)行抑制Aβ聚積并抑制其神經(jīng)毒性的研究中，已發(fā)現(xiàn)一些天然中藥成分可抑制Aβ聚積并且對抗Aβ神經(jīng)毒性，姜黃素就是這些天然中藥成分中首當(dāng)其沖的典型代表。姜黃素能以脂類介導(dǎo)的自由擴(kuò)散的方式穿過血腦屏障進(jìn)入腦組織，與Aβ沉淀形成特異性結(jié)合。本研究團(tuán)隊先期體外實驗研究發(fā)現(xiàn)其中姜黃素能有效對抗Aβ的神經(jīng)毒性，促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)，維持細(xì)胞的正常形態(tài)[3]。本研究通過觀察姜黃素對細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平、hTERT表達(dá)水平的影響，通過觀察RNA干擾導(dǎo)致hTERT表達(dá)降低后，姜黃素對細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響，探討端粒酶在姜黃素對抗Aβ毒性的神經(jīng)保護(hù)作用中的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N SH)細(xì)胞株購自中山大學(xué)實驗動物中心。

姜黃素、Aβ1-42均購自Sigma公司，兔抗人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)單克隆抗體購自Millipore公司，活性氧檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，谷胱甘肽測定試劑盒購自凱基生物科技發(fā)展有限公司，小分子RNA購自蘇州吉瑪公司。

1.2模型建立及分組對照組：正常培養(yǎng)5天的SK-N SH細(xì)胞，無特殊處理。Aβ1-42損傷組：將10 μg/mL經(jīng)老化處理的Aβ1-42加入傳代后培養(yǎng)第3天的SK-N SH細(xì)胞中，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。姜黃素干預(yù)組：將10 μg/mL經(jīng)老化處理的Aβ1-42以及姜黃素(終濃度為10 μg/mL)加入傳代后培養(yǎng)第3天的SK-N SH細(xì)胞中，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD 值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。

1.4 Western Blot、實時定量PCR Western Blot檢測hTERT蛋白的表達(dá)，實時定量PCR測定hTERT mRNA的表達(dá)。小分子RNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，驗證轉(zhuǎn)染率及轉(zhuǎn)染效率，然后再次利用上述方法進(jìn)行細(xì)胞檢測。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用MTT檢測細(xì)胞生存率的結(jié)果顯示，SK-N-SH 細(xì)胞在Aβ1-42處理了24 h之后，生存率約降低至正常水平的61.67% (P<0.001)，而姜黃素對細(xì)胞有保護(hù)作用(圖1)，姜黃素組與Aβ1-42 組比較具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)，這說明姜黃素能對抗Aβ1-42的毒性作用，從而改善細(xì)胞存活率。

圖1 姜黃素處理細(xì)胞后細(xì)胞存活率MTT檢測結(jié)果 Aβ1-42組與對照組比較，*：P<0.001；姜黃素組與Aβ1-42組比較，**：P<0.001

2.2姜黃素上調(diào)hTERT的表達(dá)經(jīng)過Aβ1-42處理以后，hTERT的蛋白及mRNA水平明顯下降(P<0.001)，說明Aβ1-42可明顯抑制hTERT表達(dá)；在姜黃素預(yù)處理后，hTERT的蛋白及mRNA水平下降的趨勢得以逆轉(zhuǎn)(P<0.001，圖2)，姜黃素可明顯上調(diào)SK-N-SH細(xì)胞中hTERT的表達(dá)，說明姜黃素可明顯上調(diào)hTERT表達(dá)。

2.3篩選最高效的siRNA下調(diào)hTERT表達(dá)經(jīng)過實時定量PCR及western blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有siRNA轉(zhuǎn)染后都可下調(diào)hTERT的表達(dá)，在這3條siRNA中，TERT-homo-2919是最高效的(圖3)。本研究選用TERT-homo-2919(GAG CCA GUC UCA CCU UCA ATT UUG AAG GUG AGA CUG GCU CTT)組作為隨后實驗的干擾組。

2.4細(xì)胞經(jīng)RNA干擾后姜黃素?zé)o神經(jīng)保護(hù)作用

經(jīng)MTT檢測細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)在Aβ1-42處理24 h以后，SK-N-SH細(xì)胞的存活率大約下降至正常水平的61.67%(P<0.001)；在siRNA干擾后，細(xì)胞存活率大約下降至正常水平的55.81%(P<0.001)。此外，經(jīng)siRNA干擾隨后用Aβ1-42處理24 h的胞存活率大約下降至正常水平的36.63%(P<0.001，圖4)。此時，姜黃素(36.26%)不再顯示出對細(xì)胞的保護(hù)作用。2919+Aβ42組與2919+Aβ42+curcumin組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異 (P>0.05)。結(jié)果提示在細(xì)胞經(jīng)過siRNA干擾后，姜黃素對細(xì)胞喪失了改善細(xì)胞存活率的功能。

圖2 hTERT mRNA水平(A)及蛋白水平(B、C)的定量 Aβ1-42組與對照組比較，*：P<0.001；姜黃素組與Aβ1-42組比較，**：P<0.001

3 討 論

Aβ促氧化應(yīng)激假說[4]指出Aβ的生成及其產(chǎn)生的細(xì)胞損傷都會導(dǎo)致AD患者腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。氧化應(yīng)激增加時，出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊功能受損，同時還出現(xiàn)自吞噬介導(dǎo)和蛋白酶體介導(dǎo)的受損蛋白質(zhì)的清除缺陷，這些加速AD中淀粉樣肽和tau蛋白的聚集[5]?；钚苑磻?yīng)組分會造成細(xì)胞膜脂質(zhì)被破壞、DNA裂解、蛋白氧化，最后引起細(xì)胞凋亡[6]。在本研究中，10 μg/mL Aβ1-42處理24 h后產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致SK-N-SH細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激，這進(jìn)一步證實了Aβ可引發(fā)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量自由基，最后誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老及凋亡。本研究采用的Aβ濃度要遠(yuǎn)高于生理濃度，此時可溶的Aβ會發(fā)生構(gòu)象改變，形成β片層樣結(jié)構(gòu)[7]，這個狀態(tài)下的Aβ易發(fā)生纖維聚積，并誘導(dǎo)更多的Aβ片段發(fā)生錯誤折疊[8]。Aβ濃度過高、發(fā)生β折疊及纖維形成正是Aβ具有神經(jīng)毒性作用的基礎(chǔ)。

圖3 檢驗siRNA的干擾效果 A1:western blot檢測hTERT蛋白表達(dá)；A2:對western blot(A1)的定量分析；B:實時定量PCR檢測hTERT mRNA表達(dá). 1：Control；2：trasfection reagent control;3:negative control;4:1797組;5:2919組;6:3042組. 與對照組比較，*：P<0.01；與對照組比較，**：P<0.001

圖4 細(xì)胞經(jīng)過siRNA干擾后，MTT檢測姜黃素對SK-N-SH細(xì)胞存活率的影響 1：Control；2：2919組；3:Aβ42組；4:2019+Aβ42組;5:2019+Aβ42+curcumin組.與對照組比較，*：P<0.001；與2919組比較，#：P<0.001；與Aβ42組比較，Δ：P<0.001

人端粒酶包含3個亞單位，分別是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)、端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR)以及角化不良蛋白(dyskerin，DKC1)[9]。hTERT可用單鏈RNA為模板復(fù)制出單鏈DNA。某些早老綜合征的研究中可發(fā)現(xiàn)較短的端粒[10]，一些研究表明基于端粒酶的治療策略在對于抗衰老的治療中起重要作用。早前的體外研究發(fā)現(xiàn)低濃度的Aβ可明顯地抑制端粒酶的活性[11]，用Aβ及反義核苷酸技術(shù)抑制PC12細(xì)胞中TERT的表達(dá)后，未分化的PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡率明顯超過對照組，端粒酶受體受到Aβ抑制的細(xì)胞的凋亡也明顯加速[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)Aβ1-42處理SK-N-SH細(xì)胞后，實時定量PCR及蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果進(jìn)一步證實hTERT的表達(dá)明顯減少。結(jié)果進(jìn)一步表明SK-N-SH細(xì)胞的活性發(fā)生改變很有可能是由于Aβ1-42抑制hTERT的表達(dá)所致，此時細(xì)胞的端粒酶活性下降，Aβ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙及細(xì)胞凋亡的毒性作用明顯增強(qiáng)。

姜黃素被證實具有廣泛的藥理學(xué)活性， 在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中已經(jīng)有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，已逐漸成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)[13]。姜黃素具有獨(dú)特的抗氧化活性，并通過降低氧化應(yīng)激水平改善淀粉樣病變，這主要是通過刺激轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達(dá)[14]，抑制MAP激酶信號以及影響細(xì)胞分裂周期來對抗氧化的谷氨酸毒性[15]，從而抑制氧化應(yīng)激對AD腦中Aβ所誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL姜黃素能明顯改善細(xì)胞存活率，保護(hù)SK-N-SH細(xì)胞免受Aβ1-42的損傷。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，姜黃素預(yù)處理細(xì)胞還可對抗Aβ1-42損傷而上調(diào)hTERT的表達(dá)，免疫熒光結(jié)果顯示SK-N-SH細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞形態(tài)也得以明顯改善。這有悖于之前一些關(guān)于癌癥的研究[16-17]得出的結(jié)論，這些研究發(fā)現(xiàn)姜黃素會抑制腫瘤細(xì)胞中端粒酶的活性而促使腫瘤細(xì)胞凋亡，然而本研究卻發(fā)現(xiàn)姜黃素非但沒有抑制端粒酶的活性，而且還能上調(diào)hTERT的表達(dá)，使端粒酶活性增加。因此，在仔細(xì)研讀了這些關(guān)于姜黃素治療癌癥的相關(guān)文獻(xiàn)后，發(fā)現(xiàn)這些研究中所采用的姜黃素濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究采用的濃度，猜測姜黃素的劑量可能是造成本研究結(jié)果與那些研究存在差異的根本原因，另外還有一個可以用來解釋矛盾的原因就是用于實驗的細(xì)胞類型有所不同。

然而，端粒酶的活性被TERT小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾以后，端粒酶活性喪失，姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用也隨之消失，不再具有改善細(xì)胞存活率以及抗氧化應(yīng)激的作用。由此推測姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用很有可能是建立在端粒酶具有活性的前提之下的，換而言之，端粒酶很可能是姜黃素治療Aβ?lián)p傷的靶點(diǎn)之一。端粒酶及TERT在AD模型中可以增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞對包括Aβ在內(nèi)的細(xì)胞毒性物質(zhì)損傷的抵抗，姜黃素有可能是通過增加hTERT表達(dá)，增加端粒酶的活性，使端粒延長，促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂且抑制細(xì)胞產(chǎn)生衰老或凋亡，從而保護(hù)細(xì)胞免受Aβ?lián)p傷。

總之，本研究結(jié)果表明Aβ可促使SK-N-SH細(xì)胞凋亡、抑制hTERT表達(dá)，姜黃素具備對抗Aβ1-42神經(jīng)毒性的作用，能抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老及細(xì)胞凋亡，對神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及功能均有保護(hù)作用。鑒于姜黃素具有特異性結(jié)合Aβ、易穿過血腦屏障[18]以及中藥低毒性等一些天然優(yōu)勢，因而有理由相信姜黃素在治療AD方面有十分廣闊的應(yīng)用前景。RNA干擾后SK-N-SH細(xì)胞上的端粒酶失去活性，姜黃素對抗Aβ毒性的細(xì)胞保護(hù)作用隨之消失，提示姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用可能是建立在端粒酶活性的基礎(chǔ)上的，端粒酶可能是姜黃素治療Aβ?lián)p傷的靶點(diǎn)。若能明確端粒酶的特性及其活化條件，重建hTERT及端粒酶活性，延緩細(xì)胞衰老，抵抗細(xì)胞凋亡，或許能為AD的防治提供更好更有效的方法。

[1] Clark JK,Furgerson M,Crystal JD,et al.Alterations in synaptic plasticity coincide with deficits in spatial working memory in presymptomatic 3xTg-AD mice[J].Neurobiol Learn Mem,2015,125:152-162.

[2] Williams TL,Urbanc B,Marshall KE,et al.Europium as an inhibitor of Amyloid-beta(1-42) induced membrane permeation[J].FEBS Lett,2015,589(21):3228-3236.

[3] Xiao Z,Lin L,Liu Z,et al.Potential therapeutic effects of curcumin:relationship to microtubule-associated proteins 2 in Abeta1-42 insult[J].Brain Res,2010,1361:115-123.

[4] Parsi S,Smith PY,Goupil C,et al.Preclinical Evaluation of miR-15/107 family members as multifactorial drug targets for alzheimer’s disease[J].Mol Ther Nucleic Acids,2015,4:e256.

[5] Hoozemans JJ,van Haastert ES,Nijholt DA,et al.The unfolded protein response is activated in pretangle neurons in Alzheimer’s disease hippocampus[J].Am J Pathol,2009,174(4):1241-1251.

[6] Axelsen PH,Komatsu H,Murray IV.Oxidative stress and cell membranes in the pathogenesis of Alzheimer’s disease[J].Physiology (Bethesda),2011,26(1):54-69.

[7] 閆秀明，單可人，官志忠.Aβ在AD發(fā)病中的作用及中藥有效成分對其神經(jīng)保護(hù)作用的研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2010,27(3):286-288.

[8] Mclean CA,Cherny RA,Fraser FW,et al.Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer’s disease[J].Ann Neurol,1999,46(6):860-866.

[9] Chiba K,Johnson JZ,Vogan JM,et al.Cancer-associated TERT promoter mutations abrogate telomerase silencing[J].Elife,2015,4.

[10] Blasco MA.Telomeres and human disease:ageing,cancer and beyond[J].Nat Rev Genet,2005,6(8):611-622.

[11] Chiu WT,Shen SC,Yang LY,et al.Inhibition of HSP90-dependent telomerase activity in amyloid beta-induced apoptosis of cerebral endothelial cells[J].J Cell Physiol,2011,226(8):2041-2051.

[12] Fu W,Begley JG,Killen MW,et al.Anti-apoptotic role of telomerase in pheochromocytoma cells[J].J Biol Chem,1999,274(11):7264-7271.

[13] 李熠，匡雙玉，王北冰，等.姜黃素對巨噬細(xì)胞源性荷脂細(xì)胞膽固醇水平及caveolin-1表達(dá)的影響[J].南華大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2009，37(1)：18-20.

[14] Salvioli S,Sikora E,Cooper EL,et al.Curcumin in cell death processes:a challenge for CAM of age-related pathologies[J].Evid Based Complement Alternat Med,2007,4(2):181-190.

[15] Suh HW,Kang S,Kwon KS.Curcumin attenuates glutamate-induced HT22 cell death by suppressing MAP kinase signaling[J].Mol Cell Biochem,2007,298(1-2):187-194.

[16] Khaw AK,Hande MP,Kalthur G,et al.Curcumin inhibits telomerase and induces telomere shortening and apoptosis in brain tumour cells[J].J Cell Biochem,2013,114(6):1257-1270.

[17] Ramachandran C,Fonseca HB,Jhabvala P,et al.Curcumin inhibits telomerase activity through human telomerase reverse transcritpase in MCF-7 breast cancer cell line[J].Cancer Lett,2002,184(1):1-6.

[18] Lim GP,Chu T,Yang F,et al.The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse[J].J Neurosci,2001,21(21):8370-8377.

Telomerase:aTargetforTherapeuticEffectsofCurcuminandaCurcuminDerivativeinAβInsultinvitro

XIAO Zijian,XIE Ming,ZHOU Guijuan,et al

(DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate whether telomerase was involved in the neuroprotective effect of curcumin against Aβ.MethodsAβ1-42 (10 μg/mL) was used to establish a damaged cell model and curcumin (10 μg/mL) was used in treatment groups.Cell survival and cell growth,intracellular oxidative stress and hTERT expression was measured.After RNA interference,the effects of curcumin on cells were verified.ResultsExposure to Aβ1-42 resulted in significant oxidative stress and cell toxicity,and the expression of hTERT was significantly decreased (P<0.001).Curcumin protected SK-N-SH cells from Aβ1-42 and up-regulated the expression of hTERT (P<0.001).However,when telomerase activity was inhibited by TERT siRNA,the neuroprotection by curcumin was whittled (P>0.05).ConclusionThe neuroprotective effect of curcumin against Aβ depends on telomerase activity,and thus telomerase may be a target for therapeutic effect of curcumin.

amyloid-beta; curcumin; telomerase; human telomerase reverse transcriptase

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.005

2015-07-26；

2015-10-13

*通訊作者，E-mail：634029592@qq.com.

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(此文編輯：朱雯霞)