高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶

許秀琴， 楊 挺， 趙 健， 章 豪， 吳銀良， 王立君， 朱 勇

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040)

摘要研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的方法。樣品中的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶用0.1 mol/L HCl酸化的甲醇提取，過(guò)WCX柱，LC-MS/MS進(jìn)行分析。分析時(shí)采用Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以0.10%甲酸水-甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧正電子(ESI+)模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，外標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果表明，鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)，峰面積與含量呈線性相關(guān)。鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的檢出限均為0.20 μg/kg，樣品中添標(biāo)回收率在85%～100%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于10%。

關(guān)鍵詞高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；鹽酸可樂(lè)定；鹽酸賽賡啶；豬肉

中圖分類(lèi)號(hào)S851.34+7;TS251.7

基金項(xiàng)目寧波市農(nóng)科教項(xiàng)目(2014NK36)。

作者簡(jiǎn)介許秀琴(1980- )，女，江蘇東海人，工程師，博士，從事食品檢測(cè)研究。

收稿日期2015-06-22

Determination of Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride in Swine Tissue by Ultra Performance Liquid Chromatography -Tandem Mass Spectrometry

XU Xiu-qin,YANG Ting,ZHAO Jian et al (Ningbo Academy of Agricultural Sciences,Ningbo,Zhejiang 315040)

AbstractA simple and sensitive LC-MS/MS method for the determination of Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride in swine tissue was developed.Samples were extracted with acidification of methanol by 0.1 mol/L HCl,through WCX column and analyzed by LC/MS-MS on a Waters Acquity BEH C18 column(100 mm×2.1 mm,1.7 μm) with 0.10% formic acid in water/methanol as the mobile phase by means of gradient elution.Detection was carried out with an electrospray ionisation (ESI) probe and operated in the positive ion mode.Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride was quantified by the external standard method.There was a good linearity in the range of concentrations between 1.0 and 50.0 μg/L.The limits of detection for Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride were both 0.20 μg/kg.The recoveries from spiked samples were in the range of 85% to 100% and the relative standard deviations were lower than 10%.

Key words Ultra Performance Liquid Chromatography -Tandem Mass Spectrometry; Clonidine hydrochloride; Cyproheptadine hydrochloride; Swine tissue

鹽酸可樂(lè)定(Clonidine Hydrochloride,分子式為C9H9Cl2N3·HCl)和鹽酸賽庚啶(Cyproheptadine hydrochloride,分子式為C21H21N·HCl)分別作為人類(lèi)使用的抗高血壓藥物和抗組胺藥[1]，分子結(jié)構(gòu)式如圖1、圖2所示。鹽酸可樂(lè)定主要用于治療高血壓、高血壓急癥、偏頭痛、絕經(jīng)期潮熱、痛經(jīng)以及戒絕阿片癮毒癥狀，常見(jiàn)的不良反應(yīng)有口干、昏睡、頭暈、精神抑郁、便秘和鎮(zhèn)靜、性功能降低和夜尿多、瘙癢、惡心、嘔吐、失眠、蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫和風(fēng)疹、疲勞、直立性癥狀、緊張和焦躁、脫發(fā)、皮疹、厭食和全身不適、體重增加、頭痛、乏力、戒斷綜合征、短暫肝功能異常等。鹽酸賽庚啶主要用于治療蕁麻疹、濕疹、過(guò)敏性和接觸性皮炎、皮膚瘙癢、鼻炎、偏頭痛、支氣管哮喘等，主要不良反應(yīng)有嗜睡、頭昏、乏力等。將可樂(lè)定添加于飼料中，可以促進(jìn)豬的生長(zhǎng)，并提高瘦肉率[2-3]，賽庚啶也有一定的刺激食欲的功能[4]。因此，國(guó)內(nèi)有發(fā)現(xiàn)畜產(chǎn)品養(yǎng)殖者將這2種藥物添加于飼料中，這無(wú)疑會(huì)給人類(lèi)的健康帶來(lái)危害。北京懷柔就發(fā)生過(guò)可樂(lè)定的中毒事件[5]，造成34人出現(xiàn)頭暈，昏迷并入院治療。農(nóng)業(yè)部于2010年12月27日發(fā)布1519號(hào)公告，禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶。目前，對(duì)于鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的測(cè)定主要集中于醫(yī)藥領(lǐng)域[6-17]，陳其煌測(cè)定了豬尿和豬肝中的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶[1,18]；柯光明等測(cè)定了家兔血液中的可樂(lè)定含量[19]，曹瑩等[20-21]、李丹妮等[4]測(cè)定了飼料中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶。對(duì)于豬肉中的可樂(lè)定及賽庚啶至今尚無(wú)人測(cè)定，筆者采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了豬肉中的可樂(lè)定和賽庚啶含量，檢測(cè)限低準(zhǔn)確度高，可以很好地用于豬肉樣品中可樂(lè)定和賽庚啶的測(cè)定。

1材料與方法

1.1材料UPLC-XEVO超高效液相色譜質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters 公司；SIGMA3K15離心機(jī)，北京博勵(lì)行有限公司；RT SPE全自動(dòng)固相萃取儀，美國(guó)Caliper;Mili Q 超純水儀，美國(guó)Millipore 公司。

鹽酸可樂(lè)定標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所。固相萃取柱：Oasis?WCX 500 mg,3 ml；CleanertSCX 500 mg,3 ml；CNWBOND HC-C18200 mg,3 ml；Oasis?MCX 500 mg,3 ml；甲醇和乙腈(色譜純)，美國(guó)默克公司；試驗(yàn)用水為Mili Q超純水儀所制超純水；其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱(chēng)取鹽酸可樂(lè)定、鹽酸賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg定容至100 ml甲醇中，質(zhì)量濃度為100 mg/L，于-18 ℃保存，保質(zhì)期為6個(gè)月。用甲醇稀釋為20.0 mg/L的中間液。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)工作液。用流動(dòng)相(甲醇∶0.1%甲酸水=20∶80)稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液20.0 mg/L 的鹽酸可樂(lè)定、鹽酸賽庚啶分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3儀器條件

1.3.1液相色譜條件。色譜柱Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)(梯度洗脫)；梯度洗脫程序：0～0.5 min，20% B；0.5～2.5 min，20%B～50%B，保持1 min；3.6 min，20%B保持1.4 min。流速:0.2 ml/min,柱溫箱溫度：25 ℃；進(jìn)樣量10 μl。

1.3.2質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源(ESI)；正離子方式檢測(cè)，采用多反應(yīng)離子(MRM)監(jiān)測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。噴霧毛細(xì)管電壓1.5 kV，離子源溫度150 ℃，去溶劑氣溫度500 ℃，去溶劑氣流速為1 000 L/h,碰撞氣流速0.20 ml/min，放大倍數(shù)為600。數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件MassLynx version 4.1進(jìn)行分析。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的測(cè)定。在上述方法下，標(biāo)準(zhǔn)溶液及加標(biāo)樣品中鹽酸可樂(lè)定、鹽酸賽庚啶的峰形良好。標(biāo)準(zhǔn)溶液中鹽酸可樂(lè)定、鹽酸賽庚啶的色譜圖見(jiàn)圖3，豬肉中的加標(biāo)樣品色譜圖見(jiàn)圖4，豬肉空白樣品于保留時(shí)間處無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖5。

1.4樣品前處理稱(chēng)取豬肉樣品2 g,加入鹽酸可樂(lè)定、鹽酸賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)溶液20 mg/L 25.0 μl。用10 ml 0.1 mol/L HCl酸化的甲醇(VCH3OH /VHCl=80∶20)提取，勻漿1 min,振蕩30 min,120 000 r/min離心5 min，倒出清液，再加入10 ml 0.01 mol/L HCl再按上述方法提取一次，合并2次提取液，混勻。取5 ml提取液準(zhǔn)備過(guò)柱。取WCX柱，依次用6 ml甲醇，6 ml 0.01 mol/L HCl潤(rùn)洗，5 ml提取液上樣。依次用純水，20%甲醇水清洗，抽干，用5 ml 1 mol/L乙酸甲醇洗脫,40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，? ml 0.1%甲酸水+甲醇(80+20)定容，過(guò)0.25 μm濾膜。

2結(jié)果與分析

2.1樣品前處理過(guò)程的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇。根據(jù)鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的化學(xué)性質(zhì)，選擇應(yīng)用甲醇∶0.1 mol/L HCl=80∶20,甲醇∶水=1∶1，乙酸乙酯-異丙醇(6∶4，V/V)來(lái)提取豬肉中的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶。

結(jié)果表明，用0.1 mol/L HCl酸化甲醇提取，可獲得最高的回收率，最終采用0.1 mol/L HCl酸化的甲醇(VCH3OH /VHCl=80∶20)提取豬肉中的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶。

2.1.2SPE柱的選擇。稱(chēng)取豬肉樣品2 g,加入鹽酸可樂(lè)定、鹽酸賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)溶液20 mg/L 25.0 μl。按照“1.4”方法進(jìn)行提取,考察提取液在WCX、SCX、C18,MCX柱上的保留情況。過(guò)柱方法按照“1.4”方法進(jìn)行。經(jīng)UPLC-MS-MS測(cè)定后，結(jié)果顯示，豬肉樣品提取液中的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶在WCX柱上保留效果最好，加標(biāo)回收率最高。故選擇WCX柱。

2.1.3洗脫液的選擇。根據(jù)鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的化學(xué)性質(zhì)及相關(guān)文獻(xiàn)，選擇氨化甲醇、乙酸甲醇、含2%氨水的甲醇水(1∶1,V/V)溶液，作為洗脫液，考察其洗脫效果。加標(biāo)樣品按照“1.4”方法操作，上機(jī)測(cè)試。結(jié)果顯示，應(yīng)用乙酸甲醇洗脫，回收率最高。而后又選擇了1、2、5 mol/L的乙酸甲醇進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果顯示，各種濃度的乙酸甲醇溶液均可獲得較好的回收率，2 mol/L的乙酸甲醇所獲得的回收率最高，故選擇2 mol/L的乙酸甲醇作為洗脫液。

2.2儀器條件的選擇用1 000 μg/L的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶溶液來(lái)確定合適的離子。離子源為電噴霧離子源(ESI)；經(jīng)過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相和質(zhì)譜參數(shù)，發(fā)現(xiàn)鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶在正離子模式下的反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)靈敏度顯著優(yōu)于負(fù)離子模式，該試驗(yàn)采用正離子掃描監(jiān)測(cè)模式。在優(yōu)化了碰撞條件后，獲得了最佳質(zhì)譜條件：噴霧毛細(xì)管電壓1.5 kV，離子源溫度150 ℃，去溶劑氣溫度500 ℃，去溶劑氣流速為1 000 L/h,碰撞氣流速0.20 ml/min，放大倍數(shù)為600。優(yōu)化好質(zhì)譜條件后，開(kāi)始優(yōu)化流動(dòng)相與液相色譜柱。選擇Acquity HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm)柱和Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)柱比較鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶在這2種柱子上的保留效果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在相同的流動(dòng)相和色譜條件下，鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶在Acquity HSS T3柱上的信號(hào)強(qiáng)度明顯低于在Acquity BEH C18柱，因此選擇Acquity BEH C18柱作為分析柱。在流動(dòng)相優(yōu)化方面，發(fā)現(xiàn)鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶在甲酸水-乙腈體系中的靈敏度低于在甲酸水-甲醇體系中的靈敏度，因此選擇0.1%甲酸水-甲醇體系作為流動(dòng)相。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍用流動(dòng)相(甲醇∶0.1%甲酸水=20∶80)配制標(biāo)準(zhǔn)工作液1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L。經(jīng)LC-MS-MS測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，如圖6，圖7。結(jié)果顯示，在該濃度內(nèi)，鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的線性范圍良好，回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為y=4 270.2x+18 352,R2=0.998 6;y=4 118.8 x+6 156.2,R2=0.997 8。

2.4靈敏度根據(jù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的結(jié)果，配制相近濃度的陽(yáng)性添加樣品，按照“1.4”進(jìn)行操作，測(cè)定其實(shí)際信噪比。以信噪比S/N≥3為檢測(cè)限，以信噪比S/N≥10為定量限。試驗(yàn)結(jié)果表明，豬肉樣品中鹽酸可樂(lè)定的檢出限為0.2 μg/L,定量限為0.6 μg/L；鹽酸賽庚啶的檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.6 μg/kg。

2.5精密度和回收率稱(chēng)取豬肉樣品2 g，制成1.0、2.0、4.0 μg/kg的添標(biāo)樣品，按照“1.4”進(jìn)行操作，每個(gè)添加水平重復(fù)3次，每次每個(gè)濃度5個(gè)添加樣品進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，在豬肉樣品中，鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的批內(nèi)和批間的精密度均小于10%，回收率均在85%～100%，如表1、表2。

表1　豬肉樣品中鹽酸可樂(lè)定的回收率和精密度測(cè)定結(jié)果

表2　豬肉樣品中鹽酸賽庚啶的回收率和精密度測(cè)定結(jié)果

3結(jié)論

該試驗(yàn)制定了一種豬肉樣品中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的測(cè)定方法。利用0.1 mol/L HCl酸化的甲醇(VCH3OH /VHCl=80∶20)提取，WCX固相萃取小柱凈化，UPLC-MS-MS法測(cè)定。應(yīng)用這種方法測(cè)定豬肉中的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶，簡(jiǎn)便、快捷，檢出限低，回收率高，為豬肉中可樂(lè)定和賽庚啶的測(cè)定提供了可靠的技術(shù)手段。

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