馬鈴薯葉片基因組DNA提取方法比較研究

李建武，鞏迎春

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730070；2.農(nóng)業(yè)部西北旱作馬鈴薯科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅 渭源 748201；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum）馬鈴薯組（Tuberarium）雙子葉草本植物，可一年一季或一年兩季栽培，普通馬鈴薯是馬鈴薯亞組中能形成地下塊莖的一年生草本四倍體作物。由于受到同源四倍體遺傳復(fù)雜性的限制，馬鈴薯遺傳規(guī)律極為復(fù)雜，常規(guī)雜交育種效率較低，近年來(lái)在分子水平方面開展了大量的研究。DNA的分離提取是進(jìn)行植物分子生物學(xué)研究工作的基礎(chǔ)，DNA的提取效率和純度嚴(yán)重影響分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，因此快速提取得到高純度的DNA，是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素之一［1］。目前，普通植物DNA提取方法已經(jīng)非常成熟，常用的有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）［2］，十二烷基苯磺酸鈉（SDS）法［3］，尿素法［4］、試劑盒法提取基因組DNA［5］。其中，CTAB法是植物提取的經(jīng)典方法，提取效果好，但步驟繁瑣、試劑組成復(fù)雜、易污染［5-6］；SDS法較為簡(jiǎn)易、產(chǎn)量高，但有蛋白污染可能［3］；尿素法具有產(chǎn)量高、快速省時(shí)、可常溫操作、成本耗用低等優(yōu)點(diǎn)［4］；試劑盒法操作簡(jiǎn)便、快速省時(shí)、污染少、提取的DNA純度高，但其成本比較高［4］。我們采用CTAB和試劑盒2種不同的DNA提取方法，以常規(guī)種植馬鈴薯植株葉片為實(shí)驗(yàn)材料，探索了適合批量高效的馬鈴薯葉片基因組DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為8份馬鈴薯品系，均為普通栽培種。植物基因組DNA提取試劑盒（DP305-2）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)材料于4月28日種植于農(nóng)業(yè)部西北旱作區(qū)馬鈴薯野外觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站（甘肅省渭源縣），出苗后15 d，剪取馬鈴薯植株上部倒數(shù)未完全展開的第2片復(fù)葉，放入冰盒帶到實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)液氮速凍后置于-80℃下保存?zhèn)溆?。馬鈴薯基因型編號(hào)分別為 001、010、039、043、052、060、109、111。

1.3 DNA提取

采用改良CTAB法和試劑盒法兩種方法分別提取馬鈴薯葉片基因組DNA。

1.3.1 改良CTAB法提取DNA［7］取備用馬鈴薯葉片約500 mg，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入2 mL離心管。加入700μL的CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65℃水浴預(yù)熱），待所有樣品研磨完后，逐個(gè)加入2μLβ-巰基乙醇（通風(fēng)櫥下），放回水浴鍋中，每5 min輕輕震蕩幾次，30 min后加入700 uL氯仿∶異戊醇（24∶1），顛倒搖勻數(shù)次，在12 000 r/min條件下離心10 min。小心吸取上清液600μL轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，加入等體積的飽和酚和氯仿∶異戊醇（各300μL）溶液，混勻，在12 000 r/min條件下離心10 min。小心吸取上清液400μL轉(zhuǎn)入新離心管，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，在12 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次。室溫下干燥5～15 min后，溶于100μL TE溶液中，置于-20℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)基因型材料DNA提取重復(fù)2次。

1.3.2 試劑盒法提取DNA 按試劑盒（DP305-2）說(shuō)明書操作。提取馬鈴薯葉片基因組DNA后，置于-20℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)基因型材料DNA提取重復(fù)2次，驗(yàn)證其DNA提取的效果。

1.4 DNA檢測(cè)

1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳法 取DNA樣品5μL，與1μL 6×Loading Buffer混勻后上樣，以2 000 bp DNA Ladder Marker為參照，在含熒光染料EB的1%瓊脂糖凝膠上120 V電泳20 min。電泳結(jié)束后，通過凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，GelDocXR+）觀察拍照，進(jìn)行純度、濃度檢測(cè)。

1.4.2 紫外分光光度法 取2μL DNA樣品，與498μL加ddH2O稀釋250倍至500μL，在紫菀分光光度計(jì)（島津，UV-240）上測(cè)定DNA OD260和OD280值，并計(jì)算OD260/OD280，以檢測(cè)純度和濃度。

1.5 SSR-PCR檢測(cè)

利用文獻(xiàn)公開發(fā)表的SSR引物STM0024［8］，對(duì)8份材料中的1個(gè)基因型的4份DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海生工生物有限公司合成。STM0024引物序列：上游引物序列CATTACCTTGTGAGATTAGATTG（5′-3′），下游引物序列CATATAAGTAGGAATAGGAGGTTT（5′-3′），擴(kuò)增目標(biāo)片段135 bp。

PCR反應(yīng)體系：在20μL反應(yīng)體系中加入上下游引物各 1.20 uL（20 pmol/μL），10×Buffer（含Mg2+）為 2.0μL，dNTPs為 1.0μL，Taq酶為 0.1 μL（5U/μL），DNA模板為 0.8 uL（50 ng/μL）。擴(kuò)增程序：95預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，53.4℃退火30 s，72℃延伸1 min，共34循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存PCR產(chǎn)物。

吸取 PCR產(chǎn)物 10μL，加 2μL 6×Loading Buffer配制樣品，以2000 bp DNA Ladder Marker為參照，在含熒光染料EB的2%瓊脂糖凝膠上，120 V電泳30 min，電泳結(jié)束后，通過凝膠成像系統(tǒng)（GelDocXR+）觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA樣品凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

圖1的Marker含6條帶，分子量由大到小依次為 2 000、1 000、750、500、250、100 bp，其中750 bp條帶的DNA濃度約為100 ng，其余條帶約50 ng。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，2種方法提取的DNA條帶均清晰整齊、DNA完整無(wú)雜帶。改良CTAB法提取的DNA點(diǎn)樣孔內(nèi)有雜質(zhì)且存在拖尾現(xiàn)象，試劑盒提取的DNA只有少量點(diǎn)樣孔內(nèi)有雜質(zhì)，表明試劑盒提取的DNA純度較高于改良CTAB法。改良CTAB法提取的1份樣品（109I）DNA濃度低于50 ng，8份材料2次重復(fù)共16份次的DNA得率為93.8%；試劑盒提取提取的5份樣品（010I，010II，039I，039II，043II）濃度低于50 ng，8份材料2次重復(fù)共16份次的DNA得率68.8%，說(shuō)明改良CTAB法提取DNA得率高于試劑盒。2種方法提取的DNA樣品濃度、純度在各重復(fù)之間差異不明顯。

圖1 改良CTAB法與試劑盒法提取的基因型DNA樣品

表1 改良CTAB法與試劑盒法提取的DNA樣品純度

2.2 紫外分光光度法測(cè)定結(jié)果

DNA樣品的純度用OD260/OD280的比值來(lái)表示，當(dāng)OD260/OD280比值接近1.8時(shí)，DNA純度符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)OD260/OD280比值大于1.9時(shí)，表明有RNA污染，小于1.6時(shí)，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染［9-10］。根據(jù)紫外分光光度分析（表1），改良CTAB法提取的010I，039I，039II，043I，060I，060II，109I，111I、111II等9份DNA樣品吸光值比值大于1.9，說(shuō)明有RNA污染，和圖1結(jié)果相同。試劑盒提取的043I，060I，109I，111I等4份DNA樣品吸光值比值小于1.6，說(shuō)明有蛋白質(zhì)、多糖或酚等雜質(zhì)。改良CTAB法提取的DNA樣品OD260/OD280比值平均值1.89，試劑盒提取的DNA樣品OD260/OD280比值平均值1.66，2種方法提取的DNA樣品均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 SSR-PCR檢測(cè)

由圖2可以看出，2種方法提取的DNA樣品為模板進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物條帶清晰，大小一致，說(shuō)明兩種方法提取的DNA完全滿足馬鈴薯SSR-PCR擴(kuò)增需要。

圖2 不同方法提取的DNA樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 小結(jié)與討論

1）CTAB法作為DNA提取的經(jīng)典方法，廣泛應(yīng)用于植物基因組DNA提取，具有穩(wěn)定性好、得率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)［4］，根據(jù)研究對(duì)象特點(diǎn)而進(jìn)行改良后可以提取到高質(zhì)量的 DNA［3，9，11］。但該方法在配制試劑過程中繁瑣耗時(shí)，步驟多，試劑組成復(fù)雜，易污染，在使用上收到了一定程度的限制［1］。從成本來(lái)看，試劑盒法所用藥品及耗材都需整套購(gòu)買，費(fèi)用較高，而CTAB法只需配好所需藥品，耗材不多。但試劑盒可用于多樣品同時(shí)操作，快速，準(zhǔn)確，方便，無(wú)需酚、氯仿抽提，避免了有機(jī)質(zhì)溶劑的污染，逐漸受到重視。從本研究結(jié)果來(lái)看，試劑盒法提取的DNA質(zhì)量高、雜質(zhì)少，DNA得率略低，CTAB法提取的DNA濃度大、量大，但雜質(zhì)多。

2）本試驗(yàn)選用的材料采自田間馬鈴薯植株，較組培苗葉片含有較多的酚類物質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果表明，改良CTAB法和試劑盒兩種方法都可得到滿足SSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增要求的DNA，能夠進(jìn)行基于SSR標(biāo)記的馬鈴薯遺傳多樣性分析試驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際條件、經(jīng)費(fèi)支出、人員配給等具體情況，選擇適合的方法進(jìn)行馬鈴薯基因組DNA的提取。如果需要樣品DNA數(shù)量不多、質(zhì)量高，樣本較多時(shí)建議選用試劑盒法提取，因?yàn)槠洳僮鬟^程簡(jiǎn)便。相反，若是小規(guī)模提取、質(zhì)量要求不是很高、樣本較少時(shí)建議選用CTAB法，因?yàn)槠涑杀镜汀⒌寐瘦^高。

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