應(yīng)用FRAP技術(shù)研究高蛋白中間水分食品體系中的分子遷移*

賈曉戈，李娟，陸乃彥，張軒，周鵬

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;江南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無(wú)錫，214122)

高蛋白中間水分食品通常是指一類(lèi)蛋白質(zhì)含量在20% ～50%之間、水分含量在10% ～25%之間、水分活度在0.5～0.8之間的食品［1］。高蛋白中間水分食品以及豐富的營(yíng)養(yǎng)和良好的功能性，被廣泛應(yīng)用于軍事、航空、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)等食品領(lǐng)域。但是，這類(lèi)食品在貯藏過(guò)程中極易出現(xiàn)質(zhì)地硬化的現(xiàn)象，嚴(yán)重降低了產(chǎn)品的食用品質(zhì)且縮短了產(chǎn)品的貨架期。由于高蛋白中間水分食品富含蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪等物質(zhì)，因此其在貯藏過(guò)程中發(fā)生質(zhì)地硬化是一個(gè)涉及多種物理、化學(xué)變化的復(fù)雜過(guò)程，且在短期和長(zhǎng)期貯藏過(guò)程中由不同因素所主導(dǎo)。近年來(lái)，一些研究者已經(jīng)對(duì)引起高蛋白中間水分食品體系硬化的原因提出了多種假說(shuō)，主要包括糖結(jié)晶［2-3］假說(shuō)、蛋白質(zhì)聚集［4-6］假說(shuō)以及水分遷移［7-10］假說(shuō)等。但是，這些假說(shuō)存在一定的局限性和不確定性。

熒光漂白恢復(fù)技術(shù)(FRAP)是通過(guò)采用激光共聚焦掃描顯微鏡的高強(qiáng)度脈沖式激光照射生物體(如細(xì)胞)的某一區(qū)域，使得該區(qū)域的熒光分子淬滅。再利用低強(qiáng)度的激光進(jìn)行掃描，來(lái)檢測(cè)該區(qū)域周?chē)谴銣鐭晒夥肿酉驘晒馄讌^(qū)域的擴(kuò)散過(guò)程。該技術(shù)利用親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián)，用于檢測(cè)所標(biāo)記分子在活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)動(dòng)及其遷移速率，已成為一種研究諸如活細(xì)胞、生物膜和其它生物環(huán)境體系中分子動(dòng)力學(xué)的重要技術(shù)。近幾年來(lái)，F(xiàn)RAP技術(shù)結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)逐漸被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)食品體系中溶質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)及其遷移情況［11-12］。

本研究通過(guò)采用FRAP技術(shù)，對(duì)高蛋白中間水分食品模擬體系在貯藏初期分子遷移運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，進(jìn)而從分子水平輔助揭示造成高蛋白中間水分食品質(zhì)地硬化的內(nèi)在機(jī)理原因。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

酪蛋白酸鈉(NaCN，87%干基)，新西蘭恒天然集團(tuán);牛奶分離蛋白(MPC85，85%干基)，新西蘭恒天然集團(tuán);FITC熒光染料，美國(guó)Sigma公司;甘油、山梨醇、丙酮，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;玻底培養(yǎng)皿，杭州生友生物技術(shù)有限公司;封口膜，美國(guó)Plechiney Plastic Packaging公司;其他試劑:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

LSM-780激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司;Hitachi SEM-3030電子掃描顯微鏡，日本Hitachi公司;水分活度儀，德國(guó)Novasina AG公司;SHP-250生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高蛋白中間水分食品模型體系的制備

選取高蛋白營(yíng)養(yǎng)棒(high-protein nutritional bar，一種典型的高蛋白食品體系)中常用的2種乳蛋白:酪蛋白酸鈉和濃縮乳蛋白，并根據(jù)表1中的配方制備高蛋白中間水分食品模型體系。具體的實(shí)驗(yàn)步驟為:將2.5 g山梨醇溶解于1.25 g超純水中，再加入1.75 g甘油進(jìn)行攪拌。攪拌均勻后，使其混合物與4.6 g乳蛋白粉混合2 min，揉制成均勻的面團(tuán)，并用封口膜密封，以防止水分蒸發(fā)，然后裝進(jìn)盛有Mg(NO3)2過(guò)飽和溶液的(aw=0.53)的密閉容器以待測(cè)定。將該密閉容器在室溫下平衡0.5 h后，進(jìn)行第0天的取樣。取樣結(jié)束后，重新封口并放入密閉容器中置于25℃下儲(chǔ)藏。此后分別于第0、1、3、7天進(jìn)行取樣。

表1 含不同乳蛋白的高蛋白中間水分食品模型體系配方Table 1 The model of high protein-intermediate moisture food blended with different milk proteins

1.3.2 熒光漂白恢復(fù)測(cè)定

1.3.2.1 樣品染色

具體實(shí)驗(yàn)操作步驟為:首先配制0.2 mg/mL的異硫氰酸熒光素(FITC)/丙酮染色液。染色時(shí)，滴加6 μL該染色液于0.5 g的樣品中，混合均勻后，將0.3 g樣品轉(zhuǎn)移至玻底培養(yǎng)皿中，蓋上蓋玻片，并用AB膠封邊，并置于25℃下避光儲(chǔ)存0、1、3、7 d。

1.3.2.2 測(cè)定

觀測(cè)樣品的熒光漂白恢復(fù)時(shí)，將染色好的樣品置于激光共聚焦掃描顯微鏡的載物臺(tái)上，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm，并在20倍目鏡下觀察樣品。在觀測(cè)視野區(qū)域內(nèi)選擇邊長(zhǎng)為18 μm的正方形區(qū)域作為漂白范圍，激光強(qiáng)度為100%。選取與漂白區(qū)域相鄰的與初始熒光值相等的區(qū)域用于背景校正。當(dāng)視野FITC-蛋白體系被漂白瞬間，記錄時(shí)間為t=0。再次監(jiān)測(cè)漂白區(qū)域FITC-蛋白體系的熒光恢復(fù)情況，每隔一段時(shí)間記錄熒光恢復(fù)情況圖像并進(jìn)行圖像采集。

1.3.2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

根據(jù)FRAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按公式1計(jì)算樣品的熒光恢復(fù)率(Kt):

式中:Iu，相鄰未漂白區(qū)域在t時(shí)間的熒光強(qiáng)度;Ib，漂白區(qū)域在t時(shí)間的熒光強(qiáng)度;Ib0，t=0時(shí)的熒光強(qiáng)度;Kt，在t時(shí)間樣品的恢復(fù)率。

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)法，當(dāng)P＜0.05為差異顯著。

1.3.3 電子掃描顯微鏡(SEM)觀察微觀結(jié)構(gòu)

量取20 mL 25%戊二醛溶液，并用pH=7.4的磷酸緩沖液(PBS)定容至200 mL，制成濃度為2.5%的戊二醛固定液。將模擬體系樣品制成0.03～0.1 g的片狀或條狀，并立即投入到50 mL的戊二醛固定液中(保證固定液完全浸沒(méi)樣品)4℃下固定24 h。適當(dāng)搖晃固定液瓶，防止樣品粘著瓶底。固定完成后，從固定液中取出樣品，用超純水反復(fù)沖洗3次。隨后將沖洗后的樣品投入至體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液(50 mL)中進(jìn)行脫水。之后逐漸增加乙醇濃度，脫水梯度為50%-70%-80%-90%-100%-100%，每階段脫水30 min。再將樣品從無(wú)水乙醇中取出，自然晾干(3～6 h)。最后，將樣品進(jìn)行表面噴金后，在電壓5 kV下進(jìn)行100倍的電鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪蛋白酸鈉模型體系熒光漂白恢復(fù)結(jié)果

圖1為新鮮的酪蛋白酸鈉模型體系(貯藏第0天)的FRAP結(jié)果圖。

由圖1可見(jiàn)，酪蛋白酸鈉模型體系中大部分的酪蛋白酸鈉已較好的水合，但仍有部分未水合充分的蛋白顆粒存在。這是由于高蛋白中間水分食品模型體系的制備是一個(gè)蛋白質(zhì)分子與水及其他小分子不斷相互作用的過(guò)程。圖2～圖4分別為酪蛋白酸鈉模型體系在25℃下貯藏1、3、7 d的FRAP結(jié)果圖。從圖2～圖4可以看出，新鮮制備的酪蛋白酸鈉模型體系是一個(gè)非熱力學(xué)穩(wěn)定體系［13］，隨著貯藏時(shí)間的增長(zhǎng)，水和其他小分子物質(zhì)(甘油、山梨醇)從體相中向未充分水合的蛋白顆粒表面遷移，這些顆粒從體相中進(jìn)一步吸水、溶脹，形成更大的、不規(guī)則的顆粒聚集體［14］，并與顆?？障堕g的蛋白膠質(zhì)進(jìn)一步共同形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。另外，圖5顯示了新鮮的酪蛋白酸鈉模型體系分別放大100倍和500倍的電子掃描顯微鏡圖。由圖5可以看出，新鮮的酪蛋白酸鈉模型體系呈現(xiàn)連續(xù)且伴有一些不溶性顆粒和氣泡的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。

圖1 酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏第0天熒光漂白恢復(fù)Fig.1 The fluorescence recovery after photobleaching of sodium caseinate model stored at 0 day

圖2 酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏第1天熒光漂白恢復(fù)Fig.2 The fluorescence recovery after photobleaching of sodium caseinate model stored at 1st day

酪蛋白酸鈉模型體系的熒光漂白區(qū)域的熒光強(qiáng)度隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸恢復(fù)。起初，當(dāng)酪蛋白酸鈉模型體系(第0天)被激光漂白后，漂白區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度恢復(fù)迅速，當(dāng)熒光恢復(fù)至5 min時(shí)，便可見(jiàn)明顯胡熒光強(qiáng)度恢復(fù);當(dāng)熒光恢復(fù)至30 min時(shí)，整個(gè)漂白區(qū)域完成了熒光強(qiáng)度的恢復(fù)。而隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)酪蛋白酸鈉模型體系分別貯藏至第1天和第3天時(shí)，漂白區(qū)域內(nèi)的熒光恢復(fù)程度明顯放緩。根據(jù)公式1對(duì)漂白區(qū)域的熒光強(qiáng)度恢復(fù)率進(jìn)行計(jì)算。圖6為酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏不同時(shí)間的熒光恢復(fù)率。其中，新鮮的酪蛋白酸鈉模型體系的熒光恢復(fù)率為69.54%;在酪蛋白酸鈉模型體系貯藏了1 d后，當(dāng)熒光漂白恢復(fù)至240 min時(shí)，漂白區(qū)域的熒光恢復(fù)率為42.65%;而貯藏3 d后的酪蛋白酸鈉模型體系，當(dāng)熒光漂白恢復(fù)至240 min時(shí)，漂白區(qū)域的熒光恢復(fù)率降為35.14%;而貯藏了第7天后的酪蛋白酸鈉模型體系，當(dāng)熒光漂白恢復(fù)至240 min時(shí)，漂白區(qū)域的熒光恢復(fù)率只有12.63%。

通過(guò)酪蛋白酸鈉模型體系的熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)和熒光強(qiáng)度恢復(fù)率的計(jì)算，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酪蛋白酸鈉模型體系中的酪蛋白、以及水和甘油等小分子之間存在分子遷移的現(xiàn)象，且熒光強(qiáng)度恢復(fù)率越高、恢復(fù)時(shí)間越短，表明體系中分子遷移越迅速。而隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白酸鈉模型體系的熒光強(qiáng)度恢復(fù)率逐漸降低。這是由于酪蛋白酸鈉模型體系在貯藏初期分子遷移迅速，隨著小分子不斷地向蛋白顆粒遷移并與蛋白質(zhì)分子相作用，使得模型體系內(nèi)的分子不斷固化，制約了模型體系的整體流動(dòng)性。

圖3 酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏第3天熒光漂白恢復(fù)Fig.3 The fluorescence recovery after photobleaching of sodium caseinate model stored at 3rd day

圖4 酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏第7天熒光漂白恢復(fù)結(jié)果圖Fig.4 The fluorescence recovery after photobleaching of sodium caseinate model stored at 7th day

圖5 酪蛋白酸鈉模型體系電子掃描顯微鏡圖Fig.5 The SEM of sodium caseinate model

圖6 酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏不同天數(shù)的熒光恢復(fù)率Fig.6 The fluorescence recovery rate of sodium caseinate model stored at different days

2.2 濃縮乳蛋白模型體系熒光漂白恢復(fù)結(jié)果

圖7為濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第0天的FRAP結(jié)果圖。新鮮的濃縮乳蛋白模型體系中存在有部分的未充分水合的蛋白顆粒，并有較多氣泡存在。圖8～圖10分別為濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第1、3、7天的FRAP的結(jié)果圖。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，體系中氣泡的尺寸逐漸變小直至消失，說(shuō)明體系內(nèi)伴隨著分子遷移。圖11為新鮮濃縮乳蛋白模型體系分別放大100倍和500倍的電子掃描顯微鏡圖，可見(jiàn)濃縮乳蛋白模型體系為較多不溶性顆粒聚集體和氣泡構(gòu)成的非連續(xù)狀結(jié)構(gòu)。

圖7 濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第0天熒光漂白恢復(fù)Fig.7 The fluorescence recovery after photobleaching of milk protein concentrate model stored at 0 day

圖8 濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第1天熒光漂白恢復(fù)Fig.8 The fluorescence recovery after photobleaching of milk protein concentrate model stored at 1st day

圖12為濃縮乳蛋白模擬體系貯藏不同天數(shù)的熒光恢復(fù)圖。新鮮制備的濃縮乳蛋白模型體系(第0 d)經(jīng)熒光漂白后，漂白區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度迅速恢復(fù)，以致漂白區(qū)域的輪廓呈模糊狀。當(dāng)漂白區(qū)域恢復(fù)至15 min時(shí)，熒光強(qiáng)度則已恢復(fù)一半以上，熒光恢復(fù)率達(dá)53.33%。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，濃縮乳蛋白模型體系在分別貯藏1 d和3 d后，熒光強(qiáng)度同樣恢復(fù)迅速。當(dāng)熒光強(qiáng)度恢復(fù)至15 min時(shí)，漂白區(qū)域熒光強(qiáng)度恢復(fù)率分別達(dá)到47.44%和44.7%(圖12)。而貯藏7 d后的濃縮乳蛋白模型體系熒光漂白恢復(fù)稍有減緩，在恢復(fù)60 min后，熒光強(qiáng)度恢復(fù)率為43.14%。

由此可見(jiàn)，濃縮乳蛋白模型體系的熒光漂白恢復(fù)無(wú)論從恢復(fù)時(shí)間上，還是熒光強(qiáng)度恢復(fù)率上相比，都較酪蛋白酸鈉模型體系的熒光漂白恢復(fù)迅速，這可能是由于濃縮乳蛋白同時(shí)含有可溶性的乳清蛋白組分所致。且濃縮乳蛋白中含有酪蛋白組分，因此濃縮乳蛋白模型體系隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)與酪蛋白酸鈉模型體系相似的微觀結(jié)構(gòu)。

圖9 濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第3天熒光漂白恢復(fù)Fig.9 The fluorescence recovery after photobleaching of milk protein concentrate model stored at 3rd day

3 結(jié)論

本研究通過(guò)分別構(gòu)建酪蛋白酸鈉和濃縮乳蛋白這兩種高蛋白中間水分食品模型體系，并采用熒光漂白恢復(fù)技術(shù)對(duì)模型體系在貯藏過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行觀察。通過(guò)計(jì)算模型體系的熒光恢復(fù)率值，表明高蛋白中間水分食品在貯藏初期存在著蛋白質(zhì)及小分子等的遷移運(yùn)動(dòng)。

圖10 濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第7天熒光漂白恢復(fù)Fig.10 The fluorescence recovery after photobleaching of milk protein concentrate model stored at 7th day

圖11 濃縮乳蛋白模型體系電子掃描顯微鏡圖Fig.11 The SEM of milk protein concentrate model

圖12 濃縮乳蛋白模擬體系貯藏不同天數(shù)的熒光恢復(fù)率結(jié)果圖Fig.12 The fluorescence recovery rate of milk protein concentrate model stored at different days

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