匍枝根霉cbh2基因的克隆表達(dá)與結(jié)構(gòu)分析*

張慶慶，謝志皓，李松，孫全霞，湯斌

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖，241000)

纖維素酶，由3種主要組分組成，即內(nèi)切葡聚糖酶(EG，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(CBH，EC 3.2.1.91)和 β-葡萄糖苷酶(BG，EC 3.2.1.21)［1］。CBH包括CBHI和CBHII兩種異構(gòu)酶，CBHI作用于纖維素的還原端，CBHII作用于纖維素的非還原端［2］，生成纖維二糖。在真菌中 CBHII分泌量沒(méi)有CBHI高，但其降解微晶纖維素的效率是CBHI的2倍［3］，CBH 酶活影響結(jié)晶纖維素的降解效率［4］，是破壞結(jié)晶纖維素的關(guān)鍵酶［5］。近年來(lái)，已有許多關(guān)于GH6、GH7 家族 CBH 的報(bào)道，Wang 等［6］通過(guò)將黑曲霉cbh結(jié)合到里氏木霉強(qiáng)啟動(dòng)子Pcbh1質(zhì)粒上，使用PEG-CaCl2方法轉(zhuǎn)化到里氏木霉中，重組子的酶活提高106倍;Takashima等［7］將CBH的結(jié)合域關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變來(lái)提高酶活;Tavagnacco等［8］研究結(jié)合域上糖基化位點(diǎn)對(duì)其結(jié)合效率的影響;Gao等［9］發(fā)現(xiàn)CBH的結(jié)合域具有破壞纖維素氫鍵結(jié)構(gòu)。

目前對(duì)匍枝根霉的研究主要集中在γ-亞麻酸和脂肪脫氫酶等的研究［10］;在木質(zhì)素降解酶系中，對(duì)匍枝根霉的研究主要在木聚糖酶［11］和纖維素酶［12］的研究，Tang等［13-14］將匍枝根霉中克隆表達(dá) eg、bg基因，研究其結(jié)構(gòu)與功能，并對(duì)匍枝根霉纖維素酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，建立分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型。目前，已經(jīng)在黑曲霉、里氏木霉、康寧木霉、斜臥青霉等真菌中克隆出cbh2(外切葡聚糖酶II)基因，根霉屬的米根霉能分泌碳水化合物酶(CAZy)，但在基因組基因的研究中，其不含有GH6和GH7家族的基因［15］。本研究從匍枝根霉中克隆的cbh2基因，屬于GH6家族。cbh2基因已經(jīng)成功在釀酒酵母、畢赤酵母、大腸桿菌等宿主中進(jìn)行克隆表達(dá)，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，Wu等［16］將Thermobifida fusca菌中的cbh2在大腸桿菌中表達(dá)，并研究水解過(guò)程中的降解機(jī)制;Wang等［17］將Neocallimastix patriciarum J11菌中的cbh在大腸桿菌中表達(dá)，且具有耐熱和pH穩(wěn)定性。本研究通過(guò)反向PCR技術(shù)獲得cbh2基因，該基因表達(dá)的CBHII酶能水解纖維素鏈非還原端生成纖維二糖，通過(guò)在E.coli BL21(DE3)克隆表達(dá)、分離純化獲得46 kDa的蛋白并研究酶的基本特性發(fā)現(xiàn)，CBHII具有很好的pH穩(wěn)定性，能降解微晶纖維素，為進(jìn)一步優(yōu)化匍枝根霉的纖維素酶系，增強(qiáng)纖維素酶復(fù)合酶系的協(xié)同降解效率的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

匍枝根霉 TP-02(Rhizopus stolonifer TP-02)、E.coli DH5α 和E.coli BL21(DE3)、pET22-b(+)Vector為本實(shí)驗(yàn)室保藏;克隆質(zhì)粒pMD18-T購(gòu)自Takara。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

Taq 酶、dNTP、T4DNA Ligase、EcoRI、NotI購(gòu)自Takara;胰蛋白胨、酵母粉、UNIQ-10柱式 Trizol總RNA抽提試劑盒、IPTG、氨芐硫酸鹽試劑、Acrylamide、Bis-acrylamide、AP、TEMED 引物設(shè)計(jì)購(gòu)自上海Sangon 公司;BSA、Avicel購(gòu)自 Sigma;HiTrap Ni，Hi-Trap DEAE FF，HiTrap Desalting，SephadexTMG-75 購(gòu)自GE公司;其他藥品均為國(guó)藥分析純。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基［13］

1.3 cbh2的克隆表達(dá)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI報(bào)道的cbh2基因進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)合生物信息學(xué)分析手段和測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)引物如表1所示。

表1 PCR各引物序列Tabel 1 The sequences of primers for PCR

1.3.2 cbh2基因的克隆

將Rhizopus stolonifer接種在土豆培養(yǎng)基中活化24 h，以10%接種量轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中30℃ 180 r/min培養(yǎng)匍枝根霉60～72 h，收集菌體，清洗，冷凍干燥。用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取Rhizopus stolonifer的總RNA，以提取的總RNA為模板，Oligo dT-Adaptor為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈，以所合成的鏈為模板，以cbh2-AF/cbh2-AR引物擴(kuò)增cbh2的核心cDNA序列。利用反向PCR技術(shù)［18］，根據(jù)獲得的cbh2的核心cDNA序列，設(shè)計(jì)反向引物，將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA利用槽式引物進(jìn)行擴(kuò)增并用EcoRI切割，取單鏈cDNA 8 μL在T4連接酶的作用下16℃連接12 h，連接產(chǎn)物在65℃滅酶處理10 min。以環(huán)化好的cDNA為模板，cbh2-BF/cbh2-BR引物擴(kuò)增cbh2的側(cè)翼序列，并通過(guò)膠回收與pMD18-T載體連接，藍(lán)白斑篩選送測(cè)序，獲得側(cè)翼序列。利用DNAStart軟件分析并設(shè)計(jì)cbh2-CF/cbh2-CR引物擴(kuò)增出cbh2的全基因序列。根據(jù)CTAB的方法提取基因組DNA，并以基因組DNA為模板cbh2-CF/cbh2-CR為引物擴(kuò)增cbh2的DNA序列。

1.3.3 cbh2表達(dá)載體的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)

把去掉信號(hào)肽的cbh2基因和表達(dá)載體pET22-b用EcoRI和NotI雙酶切，連接轉(zhuǎn)化到 E.coli BL21(DE3)進(jìn)行克隆。挑取陽(yáng)性克隆子驗(yàn)證并測(cè)序，在LB培養(yǎng)基中，以未添加誘導(dǎo)劑的為對(duì)照，設(shè)計(jì)不同濃度的IPTG、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度對(duì)產(chǎn)酶進(jìn)行表達(dá)研究。

1.4 氨基酸序列分析和同源建模

通過(guò)生物信息學(xué)的方法，利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析CBHII蛋白序列，選取最低的E-Value蛋白作為模板，其登錄號(hào)分別為:1QJW、4I5R、3CBH、1OC5、1OCN、1GZ1。通過(guò)DS 2.5軟件進(jìn)行同源建模，并進(jìn)行分子對(duì)接分析關(guān)鍵氨基酸與底物之間氫鍵的變化，及在催化過(guò)程中的重要性。

1.5 CBH 活性的測(cè)定［19］

在50℃的反應(yīng)體系中，以微晶纖維素為底物，將0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液加入試管中，混勻后于50℃水浴中反應(yīng)30 min，終止反應(yīng)，離心，加入DNS在沸水浴中顯色，測(cè)定上清液中的還原糖，每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活國(guó)際單位(IU)。

1.6 CBHII酶的純化

1.6.1 粗酶液的制備

在3 L自動(dòng)發(fā)酵罐中以最佳條件培養(yǎng)重組大腸桿菌并收集菌體，清洗并超聲破碎獲得粗酶液，10 000×g離心10 min，上清液中加入飽和度為50%的固體(NH4)2SO4，鹽析過(guò)夜，4℃ 10 000×g離心10min，取沉淀物用適量緩沖液 A(20 mmol/L Tris-HCl+500 mmol/L NaCl+20 mmol/L C3H4N2，pH 7)溶解，并在此緩沖液中透析24 h，通過(guò)0.45 μm膜過(guò)濾后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 CBHII酶的3步純化

利用?KTA prime plus純化系統(tǒng)，Ni柱用緩沖液A平衡后，將樣品吸附在Ni柱上并平衡，用緩沖液B(20 mmol/L Tris-HCl+500 mmol/L NaCl+200～500 mmol/L C3H4N2，pH 7)進(jìn)行線性洗脫，收集洗脫峰并測(cè)酶活。收集酶活樣品，使用HiTrap Desalting脫鹽后上樣于經(jīng)過(guò)緩沖液C(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0)平衡的HiTrap DEAE FF，用緩沖液D(20 mmol/L Tris-HCl+0 ～500 mmol/L NaCl，pH 7.0)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰并測(cè)酶活;合并酶活樣品使用HiTrap Desalting脫鹽后上樣5%于經(jīng)緩沖液E(50 mmol/L HAc-NaAc，pH 4.8)平衡的G-75分離目的蛋白，收集洗脫峰并測(cè)酶活，并通過(guò)SDS-PAGE分析。

1.7 酶特性研究

1.7.1 溫度對(duì)酶活性的影響

在不同溫度(30～80℃)下，按1.5的方法測(cè)定CBHII的活性，最適溫度定義為最高酶活性(以相對(duì)活性100%計(jì))所對(duì)應(yīng)的溫度。將適量酶液與50 mmol/L、pH值為5.0的HAc-NaAc緩沖液在不同的溫度下(55～80℃)分別保溫不同時(shí)間后，立即在0℃冰箱中冷卻，然后在50℃下測(cè)酶的活性，以未經(jīng)過(guò)保溫處理的酶活性作為評(píng)價(jià)熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。

1.7.2 pH對(duì)酶活性的影響

在不同 pH值(pH 3.0～6.0、50 mmol/L HAc-NaAc;pH 6.1～8.0、50 mmol/L PBS)緩沖液配制2%的微晶纖維素底物，按1.5的方法測(cè)定酶活性，最適pH定義為最高酶活性所對(duì)應(yīng)的pH值。將酶液在不同pH值的緩沖液中50℃保溫30 min測(cè)定殘余酶活性。酶的pH穩(wěn)定性定義為殘余酶活性在85%以上的pH范圍。

1.7.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

用50 mmol/L、pH為5.0的HAc-NaAc緩沖液配制不同質(zhì)量濃度的微晶纖維素底物，按照1.5的方法測(cè)定，依據(jù)Hanes woolf plot的方法以［S］和［S］/V作圖，計(jì)算出CBHII的Km和Vmax值。

2 結(jié)果和分析

2.1 cbh2基因的分離和序列分析

利用反向PCR技術(shù)從匍枝根霉中獲得cbh2基因，并在基因組中獲得cbh2的DNA。該基因的DNA通過(guò)測(cè)序編碼1647 bp，cDNA通過(guò)測(cè)序編碼1323 bp;cbh2基因編碼含有3個(gè)內(nèi)含子，獲得GenBank的登陸號(hào)KF916016.1。cbh2編碼440個(gè)氨基酸，其分子式為C2005H3083N539O658S17，分子質(zhì)量(MW)約為46 kDa，等電點(diǎn)(pI)約為 4.81。1～33為結(jié)合區(qū)域(CBM)，34～85為連接區(qū)域(Linker)，86～440為催化區(qū)域(CD)。通過(guò)CDD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，纖維二糖水解酶cbh2屬于糖苷水解酶第6家族。

2.2 cbh2催化過(guò)程的關(guān)鍵位點(diǎn)分析

將CBHII蛋白序列與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，選取最低E-Value的蛋白結(jié)構(gòu)作為模板，催化域與1QJW的同源性為68.5%。結(jié)合DS 2.5軟件對(duì)匍枝根霉CBHII蛋白進(jìn)行同源模擬，模型的PDF Total Energy最低值為9 303.7，DOPE值最低為-40 612.6，表明此模型可信度較高，并根據(jù)Ramanchandran Plot分析氨基酸的構(gòu)象，表現(xiàn)出所建立模型的合理性。結(jié)構(gòu)如圖1所示，CBM上保守的芳香族氨基酸殘基(Tyr和Trp)形成平坦的疏水性平面，與報(bào)道的T.reesei纖維二糖水解酶CBM的研究類似［20］。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)研究，在催化過(guò)程中CBM首先與纖維素表面結(jié)合，CBM上3個(gè)平行的Tyr基團(tuán)結(jié)合纖維素表面，增加其表面的親和力，結(jié)合域與纖維表面的結(jié)合是纖維酶解的必需和限速步驟;纖維六糖在CBHII催化隧道中主要與Arg179，Trp371，Lys399和 His418產(chǎn)生氫鍵，如圖2所示，在CD區(qū)的催化隧道中，由上述關(guān)鍵氨基酸對(duì)底物進(jìn)行作用。通過(guò)動(dòng)力學(xué)模擬整個(gè)催化過(guò)程的氫鍵分析，在底物不斷運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中，氫鍵的大小和成鍵的基團(tuán)都在不斷的變化，尤其是在His418上，是酶酸堿催化過(guò)程中最活潑的一個(gè)催化官能團(tuán)，是影響催化反應(yīng)速度的因素之一，His上咪唑基解離下來(lái)的質(zhì)子濃度與水中的［H+］相近，在中性環(huán)境下一半以酸形式存在，一半以堿形式存在，既是供氫體又是受氫體，供出和接受質(zhì)子的速度是相等的，結(jié)合其他的作用力通過(guò)纖維素鏈的移動(dòng)降解β-1，4糖苷鍵，水解產(chǎn)生纖維二糖。

圖1 CBHII結(jié)構(gòu)同源模擬和CBM的關(guān)鍵位點(diǎn)分析Fig.1 The structure homology modeling of CBHII and analysis of key sites in CBM

圖2 CD區(qū)催化隧道內(nèi)關(guān)鍵位點(diǎn)分析Fig.2 Analysis of Catalytic Domain key sites in the tunnel

2.3 cbh2的克隆表達(dá)和純化

2.3.1 cbh2的克隆表達(dá)

cbh2基因與pET22b質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切連接轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中，在Amp抗性平板上挑取陽(yáng)性克隆子過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并送測(cè)序。結(jié)果表明，重組菌E.coli BL21(DE3)/pET22bcbh2構(gòu)建正確。

2.3.2 CBHII蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

在搖瓶中以不同濃度的IPTG、不同的誘導(dǎo)時(shí)間和不同的誘導(dǎo)溫度進(jìn)行產(chǎn)酶優(yōu)化，最佳的條件:在LB液體培養(yǎng)基中，接種5%在37℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8左右，加入IPTG使終濃度達(dá)到0.2 mmol/L并在25℃誘導(dǎo)14 h。以搖瓶的最佳產(chǎn)酶條件為基礎(chǔ)，在3 L全自動(dòng)發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溶氧控制在30%，發(fā)酵結(jié)束收集菌體，通過(guò)超聲破碎細(xì)胞，離心獲得粗酶液。

利用?KTA prime plus純化系統(tǒng)選擇鎳柱層析、DEAE FF層析和G-75層析分離帶標(biāo)簽的目的蛋白，純化過(guò)程見表2，純化倍數(shù)提高了8.19倍，比活力達(dá)到4.67I U/mg。誘導(dǎo)表達(dá)和純化過(guò)程SDS-PAGE電泳圖見圖3所示，獲得46 kDa的酶蛋白。

表2 CBHII純化過(guò)程Table 2 The purification process of CBHII

圖3 CBHII分離純化SDS-PAGE凝膠電泳分析Fig.3 Purification and SDS-PAGE analysis of CBHII

2.4 CBHII酶的特性研究

2.4.1 酶的最適溫度

利用純化的CBHⅡ酶蛋白，在不同溫度(30～80℃)下，測(cè)定酶的最適反應(yīng)溫度，結(jié)果如圖4(A)所示，CBHⅡ的最適反應(yīng)溫度為50℃;通過(guò)不同的溫度下分別保溫不同時(shí)間研究酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4(B)所示，在60℃以下酶的穩(wěn)定性較好，溫度降低后酶活性就恢復(fù)正常，在50℃以上催化活力趨于下降，在50～60℃呈現(xiàn)可逆失活，65～70℃出現(xiàn)不可逆變性。(酶學(xué)性質(zhì)研究的酶活測(cè)定數(shù)據(jù)根據(jù)5組平行實(shí)驗(yàn)，分別去除最高值和最低值，以平均值計(jì)，下同)

圖4 CBHII的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.4 The optimum temperature and thermostability of CBHII

2.4.2 酶的最適pH

CBHII的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性研究結(jié)果如圖5所示?？芍?，CBHII的最適反應(yīng)pH為5，當(dāng)pH低于4和高于7時(shí)，酶的催化活性喪失較快，通過(guò)pH穩(wěn)定性曲線發(fā)現(xiàn)，其在pH為4～7之間具有較好的穩(wěn)定性;pH為5條件下30 min仍能保持原來(lái)的95%酶活，與最適反應(yīng)pH也是一致的。

圖5 CBHII的最適pH和pH穩(wěn)定性Fig.5 The optimum pH and pH stability of CBHII

2.4.3 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

CBHII酶液與不同濃度的底物反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定酶活力，根據(jù)Hanes woolf plot作圖法以不同濃度的微晶纖維素為底物，求得米氏方程結(jié)果如圖6所示，求得 Km為 7.358 mg/mL，Vmax為 6.501 7［mg/(min·mL)］。

圖6 CBHII的 Hanes woolf plot圖Fig.6 Hanes woolf plot of CBHII

3 討論

利用反向PCR技術(shù)從匍枝根霉中克隆cbh2基因，其屬于GH6家族。本文就cbh2基因做了克隆表達(dá)、純化與酶性質(zhì)方面的研究，并用同源建模和分子動(dòng)力學(xué)的方法對(duì)其結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理進(jìn)行探討研究，旨在為CBHII的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考和理論支持。采用E.coli BL21為宿主，將去除信號(hào)肽的cbh2基因整合到表達(dá)載體上，獲得E.coli BL21(DE3)/pET22b-cbh2重組菌，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，粗酶液酶活力為0.71 IU/mL，低于綠色木霉［21］cbh2在釀酒酵母中表達(dá)，但具有發(fā)酵周期短的特點(diǎn)。利用三步法進(jìn)行純化，其優(yōu)點(diǎn)在于純化過(guò)程中梯度去除雜蛋白，獲得純度較高的CBHII酶蛋白，比活力為4.67 IU/mg，對(duì)微晶纖維素表現(xiàn)出較高的酶活。

目前，對(duì)纖維二糖水解酶的研究主要在里氏木霉、黑曲霉、哈茨木霉、微紫青霉等的研究，在匍枝根霉中分離獲得外切纖維二糖水解酶基因的報(bào)道較少。在Neocallimastix patriciarum［18］中纖維二糖水解酶在E.coli BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，且純化后獲得活力較高的蛋白。本研究獲得的重組CBHII酶的最適反應(yīng)pH和溫度的研究結(jié)果與里氏木霉、草酸青霉分析表明，CBHII酶的最適反應(yīng)pH與里氏木霉、草酸青霉相近，但最適反應(yīng)溫度較里氏木霉具有耐熱性，CBHII酶活力與哈茨木霉相近，在E.coli BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)CBHII，酶活力相對(duì)較低，原因可能是大腸桿菌缺乏協(xié)助蛋白折疊的系統(tǒng)［22］，真菌蛋白在表達(dá)的過(guò)程中無(wú)法形成正確折疊的高級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白以錯(cuò)誤形成包涵體出現(xiàn)，導(dǎo)致表達(dá)的CBHII酶活力低。本研究采用降低溫度來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)，降低CBHII酶蛋白在大腸桿菌中的折疊速度，減少包涵體的形成，形成可溶性表達(dá)。構(gòu)建的重組菌培養(yǎng)周期短，誘導(dǎo)劑使用濃度低，表達(dá)的CBHII蛋白在pH 4～7之間酶活力較穩(wěn)定，但CBHII在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)活力較低，我們將優(yōu)化發(fā)酵條件和酶活測(cè)定方法來(lái)提高酶活，為制備以及在木質(zhì)纖維素水解中的實(shí)際應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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