基于嗅覺可視化技術(shù)的醋酸發(fā)酵過程中酒精度的檢測*

管彬彬，趙杰文，金鴻娟，張丁瑋，林顥，2

1(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)2(江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇鎮(zhèn)江，212013)

我國傳統(tǒng)發(fā)酵歷史悠久，由于固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)有利于微生物的生長［1］，并能產(chǎn)生一些在液態(tài)培養(yǎng)基中不產(chǎn)生的酶或其他代謝產(chǎn)物［2-3］，因此固態(tài)發(fā)酵得到的產(chǎn)品品質(zhì)更好，更受消費者的青睞。鎮(zhèn)江香醋以優(yōu)質(zhì)糯米為主要原料，通過優(yōu)質(zhì)醋酸菌種固態(tài)發(fā)酵而成，其酸味柔和，回甜醇厚［4］。在鎮(zhèn)江香醋的固態(tài)分層發(fā)酵過程中，酒精度的準確測定對于醋酸發(fā)酵過程的分析與控制具有十分重要的意義［5-7］。若酒精度過低，醋的酸度低，產(chǎn)品質(zhì)量不達標，而且當酒精耗盡后，生產(chǎn)出的醋酸會被醋酸菌進一步氧化成二氧化碳和水，造成食醋產(chǎn)量下降;若酒精度過高，不但本升高，且產(chǎn)品口感不適合飲用，利益相應(yīng)減少。

傳統(tǒng)酒精度的檢測方法主要有比重法［8］、蒸餾法［9］、氣相色譜法［10］等。比重法通過酒精比重計來測定乙醇濃度，該法只適合主要含水酒精溶液，無法用于固態(tài)被檢測對象;蒸餾法操作步驟繁瑣，且酒精蒸餾還有不完全吸收和揮發(fā)損失的可能性;氣相色譜法，盡管結(jié)果精確，但設(shè)備昂貴，操作復雜，耗時較長。色敏傳感器技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種氣體表征的新方法［11-12］，本文以不同發(fā)酵階段的醋醅為檢測對象，研究不同發(fā)酵階段醋醅中酒精度的變化，并通過嗅覺可視化技術(shù)對醋醅中的乙醇含量進行定量檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

醋醅樣本由江蘇恒順集團有限公司提供。首先分別取鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵第 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19天的醋醅，利用GC-MS檢測醋酸發(fā)酵過程中醋醅的乙醇含量變化，每天取3個進行平行試驗，共30個樣本。然后分別取醋酸發(fā)酵過程中第3、7、11、15、19天的醋醅進行嗅覺可視化試驗，并用GC-MS測定醋醅中乙醇的實際含量，每天取12個樣本，共60個樣本。

圖1 嗅覺可視化檢測系統(tǒng)示意圖Fig.1 Diagram of artificial olfaction system

圖1是嗅覺可視化檢測系統(tǒng)示意圖。本裝置采用漫反射LED積分球光源(OPT，RID150)，可以均勻反射從底部360°發(fā)射出的光線，使整個圖像的照度十分均勻，方便圖像的進一步處理。采用3CCD相機(JAI，CV-M9GE)，相機內(nèi)置特定三棱鏡，將光源分成R、G、B三原色，并通過3塊獨立的CCD傳感器處理，使得顏色更為準確，確保顏色的真實性。

1.2 試驗內(nèi)容

1.2.1 醋酸發(fā)酵過程中醋醅乙醇含量的變化

試驗前，先將固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)萃取頭(75 μm，CAR/PDMS)在氣相色譜的進樣口于300℃老化1 h，去除萃取頭上雜質(zhì)。稱取3.0 g醋醅樣品，置于15 mL的萃取瓶中，加入15 μL四甲基二戊醇作為內(nèi)標。將萃取瓶放置于40℃的恒溫水浴中，然后通過瓶蓋將SPME萃取頭插入到樣品的頂空部分，推出纖維頭，頂空吸附40 min。待到吸附完成，旋回纖維頭，并拔出SPME萃取頭，再將萃取頭從GC-MS儀的氣相色譜的進樣口垂直輕輕插入，推出纖維頭，于280℃解吸3 mim，完成樣品的進樣。

色譜條件:DB-WAX彈性毛細管柱(60 m×0.25 mm ×0.25 μm)，載氣 He 流量 1.0 mL/min，不分流，進樣口溫度280℃。柱溫:起始溫度35℃，首先以5℃/min升溫至100℃，然后以3℃/min升溫至200℃，再以10℃/min升溫至220℃，保持15 min。

質(zhì)譜條件:接口溫度230℃，離子源溫度220℃，電離方式EI+，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍33～450 amu。通過HP-Chemstation System工作站采集和處理數(shù)據(jù)。

1.2.2 基于嗅覺可視化技術(shù)的醋酸發(fā)酵過程中酒精度的檢測

通過前期試驗，篩選出12種卟啉類化合物及3種pH指示劑共15種色敏材料制作嗅覺可視化傳感器，15種色敏材料如下:

(1)5，10，15，20-Tetraphenyl-21H，23H-porphine manganese(Ⅲ)fluorine

(2)tetraphenylbenzo triphyrin manganese(Ⅰ)

(3)5，10，15，20-Tetraphenyl-21H，23H-porphine cobalt(Ⅱ)

(4)5，10，15，20-Tetraphenyl-21H，23H-porphine zinc(Ⅱ)

(5)5，10，15，20-Tetraphenyl-21H，23H-porphine manganese(Ⅱ)

(6)5，10，15，20-Tetraphenyl-21H，23H-porphine copper(Ⅱ)

(7)5，10，15，20-Tetraphenyl-21H，23H-porphine manganese(Ⅲ)chloride

(8)5，10，15，20-Tetrakis(4-methoxyhenyl)-21H，23H-porphine manganese(Ⅱ)

(9)5，10，15，20-Tetraphenyl-21H，23H-porphine palladium(Ⅱ)

(10)5，10，15，20-Tetraphenyl-21H，23H-porphin

(11)2，3，7，8，12，13，17，18-Octaethyl-21H，23H-porphine manganese(Ⅲ)chloride

(12)Protoporphyrin IX dimethyl ester

(13)中性紅

(14)尼羅紅

(15)溴甲酚綠

其中，(1)、(10)、(11)、(12)以及(14)號色敏材料購于 Sigma-Aldrich，(13)、(15)購于國藥集團，其余的色敏材料由實驗室合成。將12種卟啉類化合物分別溶于二氯甲烷溶劑中，3種酸堿指示劑分別溶解在乙醇中，使其質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，由于卟啉類化合物溶液在硅膠板上的擴散性不好，所以使用微量點樣毛細管將卟啉類化合物溶液沉淀在聚偏二氟乙烯(PVDF，美國，密理博)膜上，而酸堿指示劑沉淀在PVDF膜上制成的傳感器靈敏度不好，因此仍選用反相硅膠板上(德國，默克)作為酸堿指示劑的基底材料，制成色敏材料傳感器陣列。

首先利用3CCD相機獲取反應(yīng)前的傳感器陣列的圖像，然后準確稱取8 g醋醅置于培養(yǎng)皿中，將傳感器陣列固定在培養(yǎng)皿的蓋子上，置于35℃的培養(yǎng)箱中，使得傳感器陣列與醋醅揮發(fā)性氣體充分接觸14 min，最后通過3CCD相機獲取反應(yīng)后的傳感器陣列的圖像。利用特定軟件獲取醋醅揮發(fā)性氣體與傳感器陣列特征區(qū)域反應(yīng)前后的差值。

2 結(jié)果與討論

2.1 醋酸發(fā)酵過程中的乙醇含量變化分析

醋酸發(fā)酵一般周期為19 d，就是指乙醇在醋酸菌的作用下氧化為醋酸的過程［6］，圖2是醋酸發(fā)酵過程中乙醇的含量變化。從圖2中可以看出，隨著醋酸發(fā)酵的進行，乙醇的含量逐漸減少，這是由于乙醇在微生物的作用下與空氣中的氧結(jié)合生成醋酸，待醋酸發(fā)酵至第19天時乙醇的量幾乎為0，此時，乙醇轉(zhuǎn)化完全，發(fā)酵結(jié)束。因此，在后期生產(chǎn)過程中，我們可以通過測量醋酸發(fā)酵過程中的酒精度來控制醋酸的發(fā)酵過程，若酒精度過低，則及時補充酒醪，以免乙醇不夠，生產(chǎn)出的醋酸被醋酸菌繼續(xù)氧化生成CO2和H2O;若酒精度過高，則適當添加麩皮原料，增加食醋產(chǎn)量，增加工廠效益。

圖2 醋酸發(fā)酵過程中乙醇的含量變化Fig.2 Variation of ethanol through acetic acid fermentation

2.2 基于嗅覺可視化技術(shù)的醋酸發(fā)酵過程中乙醇含量的檢測

圖3是不同發(fā)酵時間的醋醅的揮發(fā)性氣體與傳感器陣列的響應(yīng)差值圖譜，從圖中可以看出，不同發(fā)酵時間的醋醅樣品與嗅覺可視化傳感器反應(yīng)后，傳感器中色敏材料的顏色具有一定的差異性，第3天和第7天的差值圖譜上響應(yīng)點較多，這是因為在醋酸發(fā)酵初期，酸類、醇類、酯類以及雜環(huán)類化合物在醋醅中的含量比較均衡，因此各點均有響應(yīng);隨著發(fā)酵的進行，從第9天開始，醋醅中的乙酸大量生成，所以酸堿指示劑對醋醅的響應(yīng)比較大，在通過歸一化的圖中表現(xiàn)為第1～12號的色敏材料的顏色都比較暗淡，13～15號色敏材料的響應(yīng)較大，待發(fā)酵至第15天，大量雜環(huán)化合物生成，所以在第1～12號的色敏材料上顯現(xiàn)出藍紫色，待發(fā)酵后期，乙酸含量優(yōu)勢絕對，因此，13～15號色敏材料的響應(yīng)較大。

圖3 不同發(fā)酵時間的醋醅的傳感器響應(yīng)Fig.3 Characteristic images for the substrate of vinegar in different fermentation days

色敏傳感器的差值圖譜作為實驗的最原始的結(jié)果包含的信息量大，給研究帶來了一定的困難。因此本研究利用嗅覺可視化技術(shù)分別結(jié)合PLS和BPANN模型來檢測醋酸發(fā)酵過程中的乙醇含量。將60個樣本隨機抽取40個樣本作為訓練集，剩下的20個樣本作為預測集。模型的可靠性通過比較訓練集及預測集相關(guān)系數(shù)R、交互驗證均方根誤差(RMSECV)和預測均方根誤差(PMSEP)來評估。

2.2.1 PLS預測結(jié)果

偏最小二乘(PLS)是一種新型的多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析法［13］，它通過最小化誤差的平方和找到一組數(shù)據(jù)的最佳函數(shù)匹配，可以將本實驗預測測得的乙醇含量與GC-MS測得的乙醇含量通過二維平面進行深度的觀察。我們首先應(yīng)用交互驗證方法來確定模型的最佳主因子數(shù)，以主因子數(shù)與內(nèi)部交互驗證的均方殘差(RMSECV)作圖，如圖4所示。從圖4中可以看出，當主因子數(shù)為11，時，RMSECV值達到最小，故取主因子數(shù)11建立PLS定量模型。圖5是主因子數(shù)為11時，酒精度實測值與PLS模型預測值的相關(guān)關(guān)系。從圖5中可以看出，訓練集的Rc值為0.803 9，RMSECV值為1.925 6，預測集的 Rp值為0.474 6，RMSEP值為2.134 8。

2.2.2 BP-ANN預測結(jié)果

圖4 不同PLS主因子數(shù)下的內(nèi)部交互驗證均方根誤差Fig.4 Changes of RMSECV with PLS factor number

圖5 乙醇含量實測值與PLS模型預測值的相關(guān)關(guān)系Fig.5 Correlation between the measured value and the PLS model prediction of alcohol

BP-ANN是一種多層前饋網(wǎng)絡(luò)，按照誤差逆?zhèn)鞑ニ惴▽δＰ瓦M行訓練［14］。研究將15個色敏材料的R、G、B三個顏色分量(共45個特征值)作為特征變量進行主成分分析，分別以前5～10個主成分的特征變量作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入變量，輸出變量分別為不同發(fā)酵天數(shù)醋醅的乙醇含量;初始權(quán)重0.3，學習速率和動量因子為0.1，訓練迭代次數(shù)設(shè)為100次;傳遞函數(shù)為雙曲正切函數(shù)(tanh)。

表1是5～10個主成分因子數(shù)下的乙醇含量的BP-ANN模型評價指標。從表1可以看出，當主成分數(shù)為10的時候，訓練集和預測集的乙醇含量預測值與由GC-MS測得的酒精度的相關(guān)系數(shù)均為最高，此時模型最優(yōu)。圖6是選取前10個主成分數(shù)作為輸入變量時，乙醇含量實測值與BP-ANN模型預測值的相關(guān)關(guān)系，從圖中可以看出訓練集的Rc值為0.997 7，RMSECV值為0.103 9，預測集的 Rp值為0.912 7，RMSEP值為1.501 3。因此，嗅覺可視化陣列采集到的不同發(fā)酵時間醋醅的氣味信息與GC-MS測得的乙醇含量的相關(guān)度較高，因此，該技術(shù)不僅操作簡便，而且適用范圍廣，結(jié)果可靠，可以作為醋酸發(fā)酵過程中固態(tài)醋醅乙醇含量的檢測方法。

表1 醋醅發(fā)酵過程中乙醇含量的BP-ANN模型評價指標Table 1 BP-ANN model results of alcohol during the acetic acid fermentation

圖6 乙醇含量實測值與BP-ANN模型預測值的相關(guān)關(guān)系Fig.6 Correlation between the measured value and the BP-ANN model prediction of alcohol

3 結(jié)論

本研究首先通過GC-MS跟蹤測定了醋酸發(fā)酵過程中醋醅乙醇含量的變化，結(jié)果表明，隨著發(fā)酵過程的進行，乙醇因在醋酸菌氧化酶的作用下被氧化成乙酸而逐漸減少。利用嗅覺可視化技術(shù)結(jié)合PLS、BPANN模型來預測不同發(fā)酵階段醋醅的乙醇含量;結(jié)果表明，BP-ANN模型相比于PLS模型效果較好，預測乙醇含量相關(guān)系數(shù)和預測均方根誤差分別為0.9127和1.5013。因此，該技術(shù)不僅操作簡便，而且可以用于固態(tài)醋醅樣本乙醇含量的檢測，對醋酸發(fā)酵過程的監(jiān)控有著良好的前景。

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