復(fù)合中藥發(fā)酵乳的制備及其體外抗氧化性研究

王景晨，顧瑞霞，曹榮，韓抒

1(南京金陵中等專業(yè)學(xué)校，江蘇南京，210000)2(揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州，225127)

中藥作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的文化遺產(chǎn)及國(guó)寶。中藥中的黃酮、酚以及多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，具有良好的保健功能，鎮(zhèn)靜催眠作用，抗腫瘤作用，抗炎，降血脂作用，而且其中含有多種益生因子能夠促進(jìn)乳酸菌及腸道益生菌的生長(zhǎng)［1-4］。

研究人員從中藥中選擇了4種藥食同源的中藥——酸棗仁、決明子、枸杞子以及甘草，研究了4味中藥對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響，優(yōu)化了復(fù)合中藥發(fā)酵乳的制備工藝，并對(duì)復(fù)合中藥發(fā)酵乳的體外生物活性進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材料

酸棗仁、甘草、決明子、枸杞均購(gòu)于揚(yáng)州樂(lè)購(gòu)超市;全脂奶粉為新西蘭威士蘭乳業(yè)公司產(chǎn)品;白砂糖為廣西風(fēng)糖生化股份有限公司產(chǎn)品;干乳酪桿菌(實(shí)驗(yàn)室自選分離菌種);DPPH自由基購(gòu)自Sigma公司;無(wú)水乙醇、三氯乙酸、鐵氰化鉀、抗壞血酸、NaCl、FeCl2、FeSO4、水楊酸和EDTA，均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;菲洛嗪購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 設(shè)備

電子天平，上海天平儀器廠;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司;755S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司生產(chǎn);pHS-3B型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠;康寶電磁爐，國(guó)華電器有限公司;SW-CJ-IF型無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;組織搗碎勻漿機(jī)(JJ-2)，中外合資深圳天南海北有限公司;全自動(dòng)黏度計(jì)(RVDV-Π)，美國(guó)BrooKfield Engineer in Laboratories，INC;10 速多功能攪拌器，佛山市三水合成塑料五金制品有限公司;微量移液器，Eppendorf公司;XW-80A旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司;其余均為常規(guī)儀器設(shè)備。

1.3 樣品的制備

1.3.1 藥液制備

以酸棗仁為例的藥液煎煮方法:

決明子、枸杞子、甘草藥液制備方法與酸棗仁相同。

1.3.2 中藥發(fā)酵乳工藝

奶粉(蛋白質(zhì)質(zhì)量12.8%)→40～50℃的水溶解→加熱至60～70℃加糖(6.5%)、加中藥液→均質(zhì)(20 MPa)→殺菌(95℃，5 min)→接種(3%)→發(fā)酵(40℃，3.5 h)→冷藏(4℃)

1.4 感官評(píng)定

組織15位具有一定專業(yè)知識(shí)的人組成評(píng)價(jià)小組，就發(fā)酵乳的感官進(jìn)行評(píng)分。最高分10分，確定加權(quán)系數(shù)分別為色澤1分，組織狀態(tài)3分，香氣2分，滋味4分，最后得分為15位評(píng)分員評(píng)分的算術(shù)平均值。按表1方法對(duì)發(fā)酵乳進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，每個(gè)樣品做3組平行試驗(yàn)，將平均值作為最終評(píng)價(jià)結(jié)果［5］。

表1 產(chǎn)品的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation Qandard for product

1.5 中藥發(fā)酵乳產(chǎn)品質(zhì)量的測(cè)定

蛋白質(zhì)、脂肪和微生物指標(biāo)等按GB 19302-2010 測(cè)定［6］。

酸度的測(cè)定:取菌種10.0 mL到250 mL的三角燒瓶中，再加入20 mL的蒸餾水和0.5 mL的酚酞溶液，搖勻，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至微紅色，并在1min內(nèi)不消失為止。記錄0.1 mol/L的NaOH的溶液所消耗的體積(mL)。

1.6 發(fā)酵乳抗氧化活性的測(cè)定

用乳酸菌發(fā)酵添加復(fù)合4味中藥和不添加中藥來(lái)研究復(fù)合中藥發(fā)酵乳的抗氧化活性。

1.6.1 DPPH自由基的清除能力

參照文獻(xiàn)所述方法［7］，將兩種乳酸菌發(fā)酵乳系稀釋后，取濾液2.0 mL與2.0 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇混勻，再加入濃度為0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL于具塞試管中，搖勻，避光放置30 min后，3 000 r/min下離心10 min，用95%乙醇作參比測(cè)定其吸光度Ai。同時(shí)測(cè)定0.2 mmol/L DPPH溶液與等體積95%乙醇混合液的吸光度Ac，以及待測(cè)液與等體積95%乙醇混合液在517nm處的吸光度Aj。按公式(1)計(jì)算清除率:

式中:Ac，未加待測(cè)液時(shí)DPPH溶液的吸光度;Ai，加待測(cè)液時(shí)DPPH溶液的吸光度;Aj，待測(cè)液與95%乙醇混合液的吸光度。

1.6.2 羥基自由基(·OH)的清除能力

參照文獻(xiàn)［10］所述方法，將2 mL的6 mmol/L硫酸亞鐵水溶液與2 mL的6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合后，將不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵乳加入后，再加入2 mL的20 mmol/L的過(guò)氧化氫溶液，混勻后在37℃的恒溫水浴中反應(yīng)1 h時(shí)，3 000 r/min下離心10 min，取出冷卻后在510 nm處測(cè)定吸光值，每一吸光值平行測(cè)定3次，取其平均值?！H清除率按公式(2)計(jì)算:

式中:A0，不含樣品和H2O2;A1，不含樣品，含H2O2;A2，含樣品和 H2O2。

1.6.3 Fe2+螯合能力

參考Deeker［11］的方法并略做改進(jìn)。取稀釋后的2 mL待測(cè)液，加入2 mL 0.01 mmol/L FeCl2·4H2O溶液和2 mL 0.25 mmol/L菲洛嗪，振蕩混勻。反應(yīng)混合物靜置10 min，在562 nm下測(cè)定吸光度，用雙蒸水做空白對(duì)照。亞鐵離子鰲合能力用公式(3)表示:

式中:Acontrol，不含樣品;Asample，含樣品。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥的添加對(duì)干酪乳桿菌發(fā)酵特性的影響

2.1.1 酸棗仁浸提液添加量對(duì)干酪乳桿菌發(fā)酵特性的影響

以上述藥液制備方法制備的酸棗仁浸提液，默認(rèn)為1 mL浸提液相當(dāng)于0.1 g酸棗仁。在4份還原奶中分別加入0，0.5%，1.0%，2.0%的酸棗仁浸提液，然后均質(zhì)、殺菌、接種量3%、40℃發(fā)酵4 h、4℃下冷藏24 h，測(cè)定活菌數(shù)、酸度、pH值，結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2中可以看出，添加酸棗仁浸提液對(duì)酸度、pH值、活菌數(shù)及感官都有很大的影響，對(duì)干酪乳桿菌有增菌作用。隨著酸棗仁浸提液添加量的增加，酸度上升，pH值下降，活菌數(shù)上升。

表2 酸棗仁浸提液的添加量對(duì)干酪乳桿菌發(fā)酵特性的影響Table 2 The influence of Semen Ziziphi spinosae on the fermentation properties of Lactobacillus casei

2.1.2 決明子浸取液添加量對(duì)干酪乳桿菌發(fā)酵特性的影響

以上述藥液制備方法制備的決明子浸提液，默認(rèn)為1 mL浸提液相當(dāng)于0.1 g決明子。由于決明子浸提液的色澤較深，且味苦澀，對(duì)口味的影響很大，故添加量較小。在4份還原奶中分別加入0，0.2%，0.4%，0.6%的決明子，其他工藝條件同2.1.1，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 決明子浸提液的添加量對(duì)干酪乳桿菌發(fā)酵特性的影響Table 3 The influence of Semen Cassia on the fermentation properties of Lactobacillus casei

由表3中可以看出，0.4%的決明子添加量效果較好。

2.1.3 枸杞子浸提液添加量對(duì)乳酸菌發(fā)酵特性的影響

以上述藥液制備方法制備的枸杞子浸提液，默認(rèn)為1 mL浸提液相當(dāng)于0.1 g枸杞子。在4份還原奶中分別加入0、0.5%、1.0%、2.0%的枸杞子浸提液，其他工藝條件同2.1.1，測(cè)定活菌數(shù)、酸度、pH值，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可以看出，枸杞子浸提液對(duì)干酪乳桿菌發(fā)酵特性的影響比較大，0.5%的添加量效果較好。

2.1.4 甘草浸提液添加量對(duì)干酪乳桿菌發(fā)酵特性的影響

以上述方法制備的甘草浸提液，默認(rèn)為1 mL浸提液相當(dāng)于0.1 g甘草。在4份還原奶中分別加入0，0.5%，1.0%，2.0%的甘草浸提液，其他工藝條件同2.1.1，測(cè)定活菌數(shù)、酸度、pH值，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 枸杞子浸提液的添加量對(duì)干酪乳桿菌發(fā)酵特性的影響Table 4 The influence of Fructus lycii on the fermentation properties of Lactobacillus casei

表5 甘草浸提液的添加量對(duì)干酪乳桿菌發(fā)酵特性的影響Table 5 The influence of Radix glycyrrhiza on the fermentation properties of Lactobacillus casei

從表5可以看出，由于甘草味甜，少量的添加對(duì)口味的影響不大。但是隨著添加量的增加，酸度、pH值、活菌數(shù)以及發(fā)酵乳的感官等影響較大。添加量在1%時(shí)的感官較好、酸度較高。

2.1.5 復(fù)合中藥配比優(yōu)化

根據(jù)單一中藥的試驗(yàn)結(jié)果，按表3～表8中的5種比例添加到還原奶中，其均質(zhì)壓力為20 MPa、接種量3%干酪乳桿菌、40℃發(fā)酵3.5 h、4℃下冷藏24 h，測(cè)定活菌數(shù)、酸度、pH值，經(jīng)過(guò)重復(fù)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 復(fù)合藥的混合比例Table 6 The mixture ratio of compound herbal

由表7可以看出，②號(hào)和⑤號(hào)配方與①號(hào)相比，酸度升高，pH值下降，活菌數(shù)變化不大，可以認(rèn)為這兩個(gè)配方促進(jìn)干酪乳桿菌產(chǎn)酸;③號(hào)和④號(hào)配方與①號(hào)相比，酸度下降，pH值下降，活菌數(shù)下降，可以認(rèn)為這兩個(gè)配方抑制干酪乳桿菌發(fā)酵。經(jīng)感官評(píng)價(jià)后，一致認(rèn)為⑤號(hào)口味較好，故選⑤號(hào)為最終配方。

表7 復(fù)合藥比例對(duì)干酪乳桿菌發(fā)酵特性的影響Table 7 The influence of compound herbal on the fermentation properties of Lactobacillus casei

2.1.6 復(fù)合中藥發(fā)酵乳儲(chǔ)藏過(guò)程中的指標(biāo)變化

按⑤號(hào)配方制做發(fā)酵乳樣品，即酸棗仁2.0%、決明子0.2%、枸杞子0.5%、甘草1.0%、加糖量6.0%，對(duì)照組加糖6.5%，其他如均質(zhì)壓力、殺菌溫度、殺菌時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間均相同。進(jìn)行冷藏試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

由圖1和圖2可以看出，無(wú)論是樣品組還是對(duì)照組都隨冷藏時(shí)間的增加，pH值不斷下降，而與此同時(shí)酸度不斷增加。GB 19302-2010中規(guī)定，酸度應(yīng)大于70.0 °T。

圖1 酸度的變化曲線Fig.1 The acidity change curve

圖2 pH值的變化曲線Fig.2 The pH change curve

圖3 活菌數(shù)的變化曲線Fig.3 Theviable count change curve

由本試驗(yàn)可以看出，發(fā)酵乳制品在冷藏的第2天即發(fā)生后酸化，且隨冷藏時(shí)間的增加，后酸化越來(lái)越嚴(yán)重。發(fā)酵乳的后酸化現(xiàn)象是由發(fā)酵劑菌體繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖造成的，菌體要消耗殘存的乳糖產(chǎn)生乳酸，故導(dǎo)致發(fā)酵乳制品酸度提高。

由圖3可以看出，無(wú)論是樣品組還是對(duì)照組，其菌數(shù)都隨冷藏時(shí)間的增加而減少，這是因?yàn)榘l(fā)酵劑菌體本身的所處介質(zhì)酸度較高，溫度較低，使發(fā)酵劑菌體生長(zhǎng)繁殖受到一定的抑制，所以菌數(shù)逐漸減少。

2.1.7 復(fù)合中藥發(fā)酵乳的質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定

按優(yōu)化的工藝條件制備復(fù)合中藥發(fā)酵乳，并對(duì)3批次產(chǎn)品質(zhì)量按GB 19302-2010進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表8。本實(shí)驗(yàn)復(fù)合中藥發(fā)酵乳組織均勻，口感細(xì)膩，酸甜適中，具有良好的中藥香味和乳香;蛋白質(zhì)含量＞2.3%，滴定酸度115°T左右;未檢出致病菌。產(chǎn)品符合GB 19302-2010。

2.2 復(fù)合中藥發(fā)酵乳抗氧化活性研究

2.2.1 DPPH自由基的清除能力

普通發(fā)酵乳及復(fù)合中藥發(fā)酵乳對(duì)DPPH自由基清除能力結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出，不同濃度的復(fù)合中藥發(fā)酵乳對(duì)DPPH自由基的清除能力高于普通發(fā)酵乳。中藥中的抗氧化功效成分以及中藥作為益生因子刺激了乳酸菌的生長(zhǎng)，從而共同發(fā)揮了抗氧化作用。

表8 復(fù)合中藥發(fā)酵乳質(zhì)量指標(biāo)Table 8 Quality index of the Chinese herbal fermented milk

圖4 發(fā)酵乳清除DPPH自由基的能力Fig.4 Scavenging effect of fermented milk against the DPPH·radical

2.2.2 羥基自由基(·OH)的清除能力

由圖5可以看出，復(fù)合中藥發(fā)酵乳原液對(duì)·OH的清除能力最高，為75.43%;不同濃度的復(fù)合中藥發(fā)酵乳和普通發(fā)酵乳對(duì)·OH的清除能力隨稀釋倍數(shù)的增大而降低，但復(fù)合中藥發(fā)酵乳對(duì)·OH的清除能力普遍高于普通發(fā)酵乳。

圖5 發(fā)酵乳清除·OH能力Fig.5 Scavenging effect of fermented milk against the hydroxyl radical

2.2.3 Fe2+螯合能力

將2種發(fā)酵乳分別稀釋0倍、2倍、4倍、6倍、8倍后測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 發(fā)酵乳的Fe2+螯合作用Fig.6 Chelating effect of fermented milk

由表6看出，不同濃度的復(fù)合中藥發(fā)酵乳對(duì)Fe2+的螯合能力不同，原液稀釋8倍后，對(duì)Fe2+的螯合率為22.43%，高于普通發(fā)酵乳。不同濃度的復(fù)合中藥發(fā)酵乳對(duì)Fe2+的螯合能力都高于普通發(fā)酵乳。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)酸棗仁、決明子、枸杞子、甘草的預(yù)處理，研究了它們對(duì)發(fā)酵乳質(zhì)量的影響，并確定了復(fù)合中藥乳酸菌發(fā)酵乳的最優(yōu)制備工藝，結(jié)果表明當(dāng)酸棗仁、決明子、枸杞子、甘草的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.0%、0.2%、0.5%、1.0%，干酪乳桿菌接種量為3%，發(fā)酵溫度為40℃時(shí)，中藥發(fā)酵乳在感官品質(zhì)和穩(wěn)定性方面都比較好。

通過(guò)發(fā)酵乳抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合中藥發(fā)酵乳原液對(duì)DPPH自由基清除率最高，為89.25%，且高于不添加中藥的發(fā)酵乳。復(fù)合中藥發(fā)酵乳在不同的稀釋度對(duì)·OH的清除率均高于對(duì)照的普通發(fā)酵乳，復(fù)合中藥發(fā)酵乳原液對(duì)·OH的清除率最大，為75.43%。

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