泡菜中1株高產(chǎn)γ-氨基丁酸且具有抗菌性乳酸菌株的篩選和鑒定*

劉文麗，劉洪霞，張傳香，柳全文，貢漢生，邢少華

1(魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái)，264025)

2(深圳市華測(cè)檢測(cè)技術(shù)股份有限公司上海分公司，上海，201206)

泡菜是一種傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵食品，具有維持人體消化道健康、減肥、抗腫瘤、抗病毒、預(yù)防心腦血管疾病等功能［1］。乳酸菌是泡菜自然發(fā)酵過程中最重要的優(yōu)勢(shì)菌群，其種類和數(shù)量對(duì)泡菜的品質(zhì)起到了關(guān)鍵性作用［2-3］。泡菜中含有許多功能性乳酸菌株，包括產(chǎn)胞外多糖菌株、抗菌性菌株、耐酸性菌株、抗氧化菌株等［4-5］，泡菜的許多功能性被認(rèn)為與乳酸菌及其代謝產(chǎn)物息息相關(guān)［2，6］。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種天然存在的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸［7］，對(duì)中樞神經(jīng)性疾病、高血壓、癌癥、糖尿病、人體免疫力等都具有調(diào)節(jié)作用［8-11］。2009年9月，衛(wèi)生部批準(zhǔn)GABA為新資源食品，可用于飲料、可可制品、焙烤食品及膨化食品等，為GABA在國內(nèi)的應(yīng)用提供了依據(jù)［12］。GABA在動(dòng)植物組織中分布廣泛，但含量較低［13］。除植物富集外，食品級(jí)GABA主要通過微生物谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)作用底物谷氨酸生產(chǎn)［14］。利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA是一種比較安全理想的生產(chǎn)方式，而且越來越多的乳酸菌株被發(fā)現(xiàn)具有GAD酶活性，如短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)，米酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)以及唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus salivarius ssp.thermophilus)等［15］，這些菌株分別分離自泡菜、新鮮牛奶、奶酪、發(fā)酵魚肉、馬奶酒等不同的食品。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA，具有成本低、含量高及安全可用于食品的優(yōu)點(diǎn)［8］。篩選具有產(chǎn)GABA能力的乳酸菌株，并將其重新應(yīng)用于發(fā)酵食品，或利用優(yōu)良菌株生產(chǎn)GABA作為功能性食品因子［8］具有非常重要的意義。

乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種天然抑菌物質(zhì)，包括酸類、醇類、雙乙酰、過氧化氫和乳酸菌素等［16］。乳酸菌發(fā)酵形成的酸性環(huán)境和產(chǎn)生的抗微生物活性物質(zhì)對(duì)腐敗菌和致病菌具有較強(qiáng)的控制作用［2］。由于乳酸菌的這些特性，可以將乳酸菌或其相關(guān)代謝產(chǎn)物應(yīng)用于發(fā)酵食品中腐敗菌或致病菌的控制，以及各種食品的貯藏保鮮中［17］。

本研究從泡菜中分離篩選出高產(chǎn)GABA的乳酸菌株，對(duì)其抗菌特性進(jìn)行了研究，以期為食品級(jí)GABA的生產(chǎn)以及相關(guān)發(fā)酵食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)室保藏乳酸菌82株，均分離自泡菜。

抑菌用指示菌株:藤黃微球菌(Micrococcus luteus)ATCC13513、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6633、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)ATCC27348、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ATCC8014、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC19113、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemoliticus)ATCC27969、大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922。

1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌選用MRS培養(yǎng)基:葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母提取物 5.0 g，吐溫-80 1.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，磷酸二鈉2.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，MgSO40.1 g/L，MnSO40.05 g/L;調(diào)pH值至6.5左右，121℃滅菌15 min。

單增李斯特菌選用BHI培養(yǎng)基、副溶血性弧菌選用TSA培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司;其他指示菌選用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星公司。

1.3 試劑

過氧化氫酶、胃蛋白酶、GABA(純度≥99%)、異硫氰酸苯酯(protein sequencing grade)、三乙胺(純度≥99%)，美國Sigma公司;谷氨酸鈉(生化試劑純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈(色譜純)，美國Fisher公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

pB-10型pH計(jì)，新銳儀表儀器有限公司;薄層層析硅膠板，青島海洋化工廠分廠;高效液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司;C18色譜柱(250 mm×4.6 mm I.D.，particle size 5 μm)，美國 Phenomenex 公司;游標(biāo)卡尺，哈爾濱量具刃具集團(tuán)有限責(zé)任公司;PCR擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根生化科技有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 菌株活化及培養(yǎng)

將-80℃冰箱內(nèi)保藏的乳酸菌株在4℃下融化，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，30℃下培養(yǎng)48 h，挑取單一菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h。

1.5.2 產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選

將活化后的菌株按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于含10 g/L谷氨酸鈉(sodium glutamate，MSG)的MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液在6 000×g條件下離心10 min，收集上清液。利用薄層層析法定性測(cè)定上清液中GABA的生產(chǎn)情況，展開劑為V(正丁醇)∶V(醋酸)∶V(水)=4∶1∶5，顯色劑為 5 g/L的茚三酮-乙醇溶液［18］。

1.5.3 菌株的一般特性

對(duì)菌株進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn);革蘭氏染色后用顯微鏡觀察其形態(tài)并記錄。

將活化后的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，用PB-10型pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH值。

1.5.4 GABA 的定量測(cè)定［18］

將產(chǎn)GABA的乳酸菌株按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量，接種于含10 g/L或50 g/L MSG的MRS液體培養(yǎng)基中，30℃下分別培養(yǎng)24、48和72 h，將培養(yǎng)液在6 000×g條件下離心10 min，收集上清液。上清液經(jīng)異硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate，PITC)衍生并通過0.45 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜法測(cè)定GABA的含量。色譜柱為C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相A為1.4 mmol/L乙酸鈉、體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三乙胺和體積分?jǐn)?shù)為6%的乙腈(調(diào)節(jié)pH為6.1)，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為60%的乙腈;流速為1.0 mL/min;流動(dòng)相B按線性梯度0～100%洗脫20 min。柱溫46℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

GABA轉(zhuǎn)化率按(1)式計(jì)算:

式中，MS0為底物中MSG的摩爾數(shù);MS為產(chǎn)物中MSG的摩爾數(shù)。

1.5.5 抗菌性實(shí)驗(yàn)

采用濾紙片-瓊脂擴(kuò)散法［19］篩選具有抑菌活性的菌株，無菌水作為陰性對(duì)照。指示菌選用藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、植物乳桿菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌。抑菌環(huán)直徑用游標(biāo)卡尺測(cè)量，抑菌環(huán)直徑3～6 mm、6～10 mm、10 mm，以上3個(gè)范圍分別用+、++、+++表示其抑菌能力。

1.5.6 抑菌物質(zhì)的初步鑒定［20-21］

使用3 mol/L的NaOH調(diào)PD1-2發(fā)酵上清液pH值至7.0，排除有機(jī)酸干擾。將1 mol/L的過氧化氫酶、胃蛋白酶分別加入PD1-2發(fā)酵上清液中，37℃培育2 h，以枯草芽孢桿菌為指示菌，通過1.5.5的抗菌性實(shí)驗(yàn)，觀察處理前后發(fā)酵上清液抑菌情況的變化。

1.5.7 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將篩選的乳酸菌株接種于MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液于6 000×g條件下離心10 min，收獲菌體并用無菌生理鹽水洗滌、重懸菌體制成細(xì)胞懸液。根據(jù)API 50 CHL系統(tǒng)說明書進(jìn)行操作。將結(jié)果輸入系統(tǒng)測(cè)定軟件API plus中，通過歸納菌株可發(fā)酵糖的種類初步確定其歸屬種類。

1.5.8 16S rDNA序列分析

應(yīng)用天根公司的基因組提取試劑盒說明書方法提取菌株的基因組DNA，使用細(xì)菌一般通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和 1492R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)擴(kuò)增［22］。PCR 產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。得到的基因序列通過BLAST在GenBank中進(jìn)行同源性比較，并將其鑒定到種。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)GABA乳酸菌株的篩選

將實(shí)驗(yàn)室保藏的82株乳酸菌進(jìn)行編號(hào)，通過薄層層析法初篩，產(chǎn)GABA的菌株結(jié)果如圖1所示。與GABA及MSG標(biāo)準(zhǔn)品比較Rf值，結(jié)果表明，層析編號(hào)為30的乳酸菌具有生產(chǎn)GABA的能力，被命名為PD1-2。

圖1 菌株產(chǎn)GABA的薄層層析定性檢測(cè)Fig.1 Qualitative detection of GABA by TLC

2.2 PD1-2菌株的一般特性

通過革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PD1-2菌株為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性菌，測(cè)定菌液pH值為4.68，產(chǎn)酸性良好，結(jié)果如表1所示。經(jīng)革蘭氏染色顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，PD1-2菌株為桿狀菌，單一或成對(duì)存在，不產(chǎn)芽孢，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，顯微圖片如圖2所示。

表1 產(chǎn)GABA菌株的生化特性Table 1 Biological characteristics of GABA producers

2.3 GABA的定量測(cè)定

GABA和MSG標(biāo)樣經(jīng)衍生化后在上述色譜條件下進(jìn)樣20 μL，圖3 中(A)、(B)分別為GABA 和MSG標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖譜，GABA的保留時(shí)間為13.409 min，MSG的保留時(shí)間為9.180 min。

圖2 PD1-2的革蘭氏染色形態(tài)特征Fig.2 Microscopic picture of PD1-2 after gram staining

圖3 GABA(A)和MSG(B)標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.3 RP-HPLC chromatogram of GABA(A)and MSG(B)standard

將PD1-2的發(fā)酵液樣品在相同條件下衍生處理并通過高效液相色譜檢測(cè)，計(jì)算MSG的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如表2所示，底物MSG質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，菌株培養(yǎng)24 h，GABA轉(zhuǎn)化率達(dá)到75.6%;菌株培養(yǎng)48 h后，GABA轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，GABA產(chǎn)量達(dá)到53.4 mmol/L。底物MSG質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，菌株培養(yǎng)24 h、48 h后，GABA轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到7.1%、72.6%，并于發(fā)酵72 h達(dá)到93.7%，GABA產(chǎn)量達(dá)到250.3 mmol/L。

表2 PD1-2發(fā)酵產(chǎn)GABA的轉(zhuǎn)化率Table 2 GABA conversion rate of PD1-2 analyzed by HPLC

2.4 抗菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PD1-2對(duì)7種不同的革蘭氏陽性菌及陰性菌的抗菌結(jié)果如表3所示，PD1-2對(duì)藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和單增李斯特菌4株革蘭氏陽性菌均具有抗菌性;對(duì)革蘭氏陰性菌的大腸桿菌具有抗菌性;對(duì)植物乳桿菌和副溶血性弧菌不具有抗菌性。

表3 PD1-2抗菌性結(jié)果Table 3 Antimicrobial activity of PD1-2

調(diào)節(jié)PD1-2發(fā)酵上清液的pH值至7.0，抑菌效果無明顯差別，排除了有機(jī)酸的干擾;經(jīng)過氧化氫酶處理后，抑菌效果也無明顯差別，排除了過氧化氫的干擾。發(fā)酵上清液經(jīng)胃蛋白酶處理后，抑菌圈顯著減小，從而可以初步判定該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。

2.5 糖發(fā)酵結(jié)果

按照API 50 CHL試劑條使用說明對(duì)菌株P(guān)D1-2進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。將表4中的鑒定結(jié)果用API plus軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，菌株P(guān)D1-2與短乳桿菌(Lactobacillus brevis)有88.1%的同源性。

表4 菌株P(guān)D1-2的API 50 CHL反應(yīng)結(jié)果Table 4 The carbohydrate utilization of PD1-2 using API 50 CHL test

續(xù)表4

2.6 16S rDNA菌株鑒定結(jié)果

16S rDNA測(cè)序結(jié)果表明，PD1-2菌株與Lactobacillus brevis ATCC14869(T)的同源性達(dá)到99%以上，確定該菌株為乳桿菌屬(Lactobacillus)的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，將其命名為:Lactobacillus brevis PD1-2。

3 結(jié)論及討論

本研究從泡菜中分離的82株乳酸菌中篩選出1株具有產(chǎn)GABA的菌株，經(jīng)抗菌性實(shí)驗(yàn)測(cè)定，該菌同時(shí)對(duì)革蘭氏陽性菌的蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、單增李斯特菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌具有抗菌性。通過API 50CHL糖發(fā)酵測(cè)定、16S rDNA序列分析鑒定該菌為短乳桿菌，命名為L(zhǎng)actobacillus brevis PD1-2。

通過與文獻(xiàn)中其他泡菜源乳酸菌產(chǎn)GABA的能力進(jìn)行比較，Lactobacillus buchneri MS在底物MSG質(zhì)量濃度為50 g/L，優(yōu)化后的MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，GABA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%［18］;Lactobacillus brevis BH2可將50 g/L的MSG在48 h內(nèi)轉(zhuǎn)化73%(72 h未檢測(cè))［23］;Lactobacillus plantarum K154 在含 10 g/L、20 g/L和30 g/L MSG的MRS培養(yǎng)基中GABA的轉(zhuǎn)化量分別為 154.86 μg/mL、170.42 μg/mL 和 201.78 μg/mL［24］。本研究中，PD1-2在未經(jīng)優(yōu)化的 MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵，不僅在較低底物質(zhì)量濃度(10 g/L)條件下，達(dá)到了100%的轉(zhuǎn)化率，而且在較高底物質(zhì)量濃度(50 g/L)條件下，72 h發(fā)酵后GABA轉(zhuǎn)化率達(dá)到了93.7%，相比其他乳酸菌具有較高的生產(chǎn)GABA的能力，同時(shí)，可以通過菌株誘變或發(fā)酵條件優(yōu)化等方法進(jìn)一步提高GABA的產(chǎn)量［25］。除了將乳酸菌生產(chǎn)的GABA應(yīng)用于食品及醫(yī)藥行業(yè)之外，近年來，將具有益生作用的產(chǎn)GABA的乳酸菌直接應(yīng)用于發(fā)酵食品中，生產(chǎn)功能性發(fā)酵食品也越來越受到人們的關(guān)注。如薛玉清等利用蒙古發(fā)酵乳制品中分離出的高產(chǎn)GABA的乳酸菌株與傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶的菌株相結(jié)合，研制出GABA發(fā)酵乳［26］。有研究利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)富含GABA的大豆制品，研制出功能性的醬類或大豆酸奶等［27-28］。利用乳酸菌發(fā)酵研制自然產(chǎn)生GABA的功能性食品，具有工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、食用方便、安全等優(yōu)點(diǎn)［26］。

乳酸菌發(fā)酵過程中，會(huì)產(chǎn)生許多抗菌物質(zhì)，抗菌性對(duì)于發(fā)酵過程中防止其他有害微生物的生長(zhǎng)繁殖具有十分重要的意義。本研究中PD1-2對(duì)多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有抑菌性，且通過實(shí)驗(yàn)證明其產(chǎn)生的主要抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。細(xì)菌素?zé)o毒、無副作用、無污染性、無抗藥性、無殘留，而且加入食品后不影響食品感官，而受到食品工業(yè)的青睞，目前已成功應(yīng)用于乳制品、肉制品、果蔬制品等食品的防腐處理上［21］。同時(shí)，有研究利用泡菜中篩選出的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌作為發(fā)酵菌種生產(chǎn)泡菜，從而提高泡菜的貨架期［29-30］。

本研究從泡菜中篩選出具有抗菌性的高產(chǎn)GABA乳酸菌株P(guān)D1-2，可利用該菌株生產(chǎn)GABA和細(xì)菌素應(yīng)用于功能性食品的添加及食品的貯藏保鮮，另外，也可作為發(fā)酵劑生產(chǎn)貯藏性良好的功能性發(fā)酵食品，為今后開發(fā)功能性食品提供基礎(chǔ)。

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