牛血清白蛋白對(duì)牛胰脂肪酶交聯(lián)酶聚體制備及催化性能的影響*

崔建東，劉容麟

(河北科技大學(xué)，生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊，050018)

脂肪酶(EC3.1.1.3，Lipase)是一種重要的生物催化劑，是一類特殊的酯鏈水解酶。該酶能催化多種反應(yīng)，如酯化、水解和聚合反應(yīng)等，在食品工業(yè)中可用于油脂加工、乳品中乳脂的降解以及作為酯溶性抗氧化劑及營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑等［1-2］。但游離的脂肪酶在應(yīng)用過(guò)程中，表現(xiàn)出不穩(wěn)定、易失活的問(wèn)題，限制了該酶的應(yīng)用。大量研究表明，酶固定化技術(shù)能改善酶的穩(wěn)定性和催化性能［3-5］。

交聯(lián)酶聚體技術(shù)(CLEAs)是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外固定化酶研究的熱點(diǎn)，該技術(shù)具有制備條件溫和、操作簡(jiǎn)單、酶固定化效率和酶活保留率高等優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)被成功應(yīng)用在苯丙氨酸解氨酶［6］、漆酶［7］、氨基?；福?］等多種酶的固定化。但該方法也存在一些缺點(diǎn)，如形成的固定化酶顆粒小、機(jī)械強(qiáng)度低等。特別是，如果被固定化的酶表面所含有的氨基(—NH2)較少，則難以用交聯(lián)劑(戊二醛)交聯(lián)，導(dǎo)致交聯(lián)固定化效率下降［9］。為了克服這個(gè)問(wèn)題，有學(xué)者利用富含氨基的高分子多聚物和酶共沉淀交聯(lián)，以提高CLEAs的交聯(lián)效率［10-11］。但這些高分子聚合物含有大量的電荷，這些電荷會(huì)影響酶活性中心的微環(huán)境，導(dǎo)致酶的活性構(gòu)象改變［12］。牛血清白蛋白(BSA)是一種富含氨基的惰性蛋白，由于BSA自身是一種蛋白質(zhì)，對(duì)所要交聯(lián)固定的酶沒(méi)有負(fù)作用，因此是替代高分子聚合物提高CLEAs交聯(lián)效率的理想輔助交聯(lián)劑。因此，本研究以牛血清白蛋白作為一種輔助交聯(lián)劑，研究了BSA對(duì)牛胰脂肪酶CLEAs制備及其催化性能的影響，以期能顯著提高CLEAs固定化效率及催化效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛胰脂肪酶(lipase，15 mU/mg)，阿拉丁試劑(上海)有限公司;牛血清白蛋白，Sigma公司;50%戊二醛，阿拉丁試劑(上海)有限公司;其他試劑均為市售分析純。

S-4800-Ⅰ型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本HITACHI;IX51倒置熒光顯微鏡，美國(guó)OLYMPUS;752型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;TGL-16C型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;HC-3018型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;85-1B磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;FD-27真空冷凍干燥機(jī)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛血清白蛋白輔助交聯(lián)制備脂肪酶交聯(lián)酶聚體

取1.0 mL質(zhì)量濃度為100 mg/mL游離脂肪酶與50 mg/mL的牛血清白蛋白混合(pH 7.5，50以mmol/L磷酸緩沖液配制)置于7 mL離心管中，并加入硫酸銨使體系中硫酸銨濃度為80%使蛋白析出。之后加入體積分?jǐn)?shù)為50%的戊二醛，使其終濃度為1%，在25℃下攪拌交聯(lián)1 h。離心分離后的沉淀用磷酸緩沖液(pH7.5，50 mmol/L)洗滌，獲得交聯(lián)脂肪酶聚集體(BSA-Lipase-CLEAs)。對(duì)于Lipase-CLEAs，除了在制備過(guò)程中不添加 BSA，其他制備條件與BSA-Lipase-CLEAs一致。

1.2.2 固定化脂肪酶的形態(tài)觀察

固定化脂肪酶樣品經(jīng)真空冷凍干燥后，在真空條件下噴鉑金，利用電子掃描顯微鏡(電子發(fā)射電壓60～100 kV)檢測(cè)。利用50 mg異硫氰酸熒光素(FITC)溶于8 mL二甲基亞砜(DMSO)，加入100 mL溶有1 g脂肪酶的磷酸鈉緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.5)，室溫下避光攪拌溶解2 h。加入無(wú)水乙醇(與溶液的量大約等量即可)沉淀標(biāo)記好的蛋白，離心除去多余的FITC。沉淀需要清洗3次。標(biāo)記好FITC的脂肪酶用于固定化，用熒光倒置顯微鏡觀察固定化酶。

1.2.3 酶活測(cè)定方法

用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶酶活［13］。酶促反應(yīng)液包括一定量的酶樣品(溶于50 mmol/L的磷酸緩沖液，pH 7.5)，5 mL 0.009 g/mL的對(duì)硝基乙酸酯，反應(yīng)在37℃振蕩保溫5 min。10 000×g離心5 min，取上清液在410 nm下測(cè)吸光值。固定化酶的酶活測(cè)定與游離酶相似，根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。酶活力單位定義為:每分鐘催化對(duì)硝基乙酸酯生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.2.4 酶活回收率(公式(1))

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，利用SAS軟件(v8.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.6.1 固定化酶制備條件優(yōu)化

利用單因素實(shí)驗(yàn)考察了BSA添加質(zhì)量濃度(0，0.005，0.01，0.02，0.05 g/L)、戊二醛體積分?jǐn)?shù)(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)以及交聯(lián)時(shí)間(0.5，1，1.5，2，2.5 h)對(duì)固定化酶的影響(考察某一因素時(shí)，其他制備條件不變，制備條件見(jiàn)1.2.1部分)。

1.2.6.2 固定化酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及最適催化條件考察

考察固定化酶的最適催化溫度，將一定量酶樣品分別在30、40、50、60和70℃條件下測(cè)定酶活，酶活的測(cè)定參照1.2.3部分。對(duì)于動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定，取一定量的酶樣品測(cè)定不同底物濃度(120，110，100，90和80 μmol/L對(duì)硝基乙酸酯)下的酶促反應(yīng)速率，利用雙倒數(shù)法得到Km和Vmax。

1.2.6.3 固定化酶的催化穩(wěn)定性考察

對(duì)于溫度穩(wěn)定性，將游離酶和固定化酶分別置于60℃下處理1、2和3 h后，分別檢測(cè)酶活。對(duì)于pH穩(wěn)定性，將游離酶和固定化酶分別置于pH為4、6、8、10和12的磷酸緩沖液中處理12 h后，檢測(cè)酶活。對(duì)于儲(chǔ)存穩(wěn)定性，將游離酶和固定化酶分別保存在50 mmol/L 磷酸鹽(pH 7.5)中，于25 ℃放置1、3、6、9 和12 d，并在相對(duì)應(yīng)的儲(chǔ)存時(shí)間檢測(cè)酶活。重復(fù)使用穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):將一定量的固定化酶在37℃條件下催化底物對(duì)硝基乙酸酯生成對(duì)硝基苯酚，反應(yīng)5 min后，離心分離出固定化酶，用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)洗滌后，在固定化酶中加入新的底物進(jìn)行第2輪反應(yīng)，依此分批催化，每次催化反應(yīng)后分別檢測(cè)固定化酶剩余的酶活。直到檢測(cè)不到酶活為止。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化脂肪酶制備條件優(yōu)化

2.1.1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=5.907 9X+0.028 1，R2=0.999 9，以此計(jì)算酶活。

2.1.2 BSA濃度對(duì)固定化酶的影響

從圖1可以得出，BSA的添加對(duì)脂肪酶交聯(lián)酶聚體的酶活回收率有較大的影響，隨著BSA質(zhì)量濃度的增加，CLEAs的酶活回收率也在增加，當(dāng)BSA質(zhì)量濃度為0.05 g/L時(shí)，最大酶活回收率達(dá)到70%(比不添加BSA制備的CLEAs酶活回收率提高了15%)。但當(dāng)BSA濃度過(guò)大時(shí)，CLEAs的酶活回收率卻又有所下降。這表明富含氨基的BSA提高了脂肪酶的交聯(lián)效率，適當(dāng)BSA的添加使大多數(shù)原本難以被戊二醛交聯(lián)的脂肪酶分子被充分的交聯(lián)，減少了脂肪酶分子的泄露，導(dǎo)致酶活回收率提高。但過(guò)量的BSA會(huì)與脂肪酶共同競(jìng)爭(zhēng)戊二醛分子，使得戊二醛主要被用于交聯(lián)BSA，而脂肪酶分子難以充分被交聯(lián)，從而使脂肪酶的交聯(lián)效率下降［14］。

2.1.3 戊二醛濃度對(duì)固定化酶的影響

由圖2可以看出，隨著戊二醛體積分?jǐn)?shù)的增加，固定化酶的酶活回收率也在增加，當(dāng)戊二醛體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1%時(shí)，酶活回收率達(dá)到最高，而隨著戊二醛體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，酶活回收率卻開(kāi)始下降。有研究表明，戊二醛不僅是酶蛋白的交聯(lián)劑，同時(shí)也會(huì)破壞酶蛋白的結(jié)構(gòu)，過(guò)量的戊二醛能進(jìn)入酶的活性中心，破壞酶活性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶變性失活［15］。從而使酶活回收率下降。

圖1 BSA質(zhì)量濃度對(duì)酶活回收率的影響Fig.1 Effects of BSA concentration on activity recovery

圖2 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶活回收率的影響Fig.2 Effects of glutaraldehyde concentration on activity recovery

2.1.4 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶的影響

從圖3可知，固定化酶的酶活回收率隨著交聯(lián)時(shí)間的增加而增加，交聯(lián)2 h，酶活回收率達(dá)到最大。但隨著交聯(lián)時(shí)間的繼續(xù)增加，酶活回收率下降。這可能是由于戊二醛既能作為酶蛋白的交聯(lián)劑，同時(shí)有是酶蛋白的失活劑，酶蛋白與戊二醛長(zhǎng)時(shí)間的接觸會(huì)導(dǎo)致戊二醛直接作用酶分子的活性中性，改變酶的活性結(jié)構(gòu)，反而使酶失活。導(dǎo)致固定化酶酶活回收率有所下降。

圖3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶酶活的影響Fig.3 Effects of cross-linking time on activity

2.2 固定化酶的形態(tài)觀察

圖4是掃描電鏡和熒光倒置顯微鏡觀察的固定化酶的圖片。從圖4可以看出，在10 μm標(biāo)尺下，沒(méi)有添加BSA制備的CLEAs的顆粒非常小，形態(tài)不規(guī)則，分布不均勻 (圖4a)，而添加BSA制備的CLEAs顆粒較大，且呈現(xiàn)出圓球狀的顆粒，分布較為均勻(圖4b)。這種均勻的球型結(jié)構(gòu)更有利于酶促反應(yīng)過(guò)程中固定化酶均勻地分散在反應(yīng)液中，減少空間位阻現(xiàn)象的發(fā)生。熒光倒置顯微鏡表明，標(biāo)記有FITC的酶蛋白在蛋白聚體中發(fā)出綠光(圖4c，4d)，表明酶蛋白已經(jīng)被交聯(lián)固定化。但添加BSA的脂肪酶CLEAs發(fā)出更多、更強(qiáng)的熒光(圖4d)，表明BSA的添加能提高脂肪酶的交聯(lián)效率。

圖4 固定化酶的形態(tài)Fig.4 Morphology of immobilized lipase

2.3 固定化酶最適催化溫度和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3.1 最適催化溫度

圖5是游離脂肪酶、未添加BSA制備的CLEAs和添加BSA制備的CLEAs的最適反應(yīng)溫度。由圖5可以看出，經(jīng)過(guò)交聯(lián)固定化后，脂肪酶的最適反應(yīng)溫度由50℃遷移到了60℃，最適溫度增加了10℃，當(dāng)溫度從60℃升高到70℃時(shí)，固定化脂肪酶比游離酶表現(xiàn)出更高的催化活性。表明CLEAs比游離酶有更好的溫度適用性。

2.3.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

由表1可以看出，所有固定化的脂肪酶的Km均大于游離的脂肪酶，說(shuō)明固定化導(dǎo)致底物與酶分子之間產(chǎn)生了底物擴(kuò)散效應(yīng)，從而使底物與酶活性中心的親和力降低，最大反應(yīng)速率有所降低。但相比而言，添加 BSA制備的 CLEAs比未添加 BSA制備的CLEAs表現(xiàn)出相對(duì)高的底物親和力，催化效率(νmax/Km)也略高于未添加BSA制備的CLEAs。

圖5 固定化酶的最適催化溫度Fig.5 Effects of temperature on the activity of immobilized lipase

表1 固定化酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table1 Kinetic parameters of free lipase，lipase-CLEAs，and lipase-BSA-CLEAs

2.4 固定化酶催化穩(wěn)定性

2.4.1 固定化酶溫度穩(wěn)定性

圖6是固定化脂肪酶的溫度穩(wěn)定性曲線，結(jié)果表明，與游離酶相比，固定化酶具有更高的耐受高溫的能力，在60℃下處理3 h時(shí)，游離酶基本損失了50%的初始酶活，而CLEAs始終能保持70%以上的酶活，相對(duì)于CLEAs，BSA的添加能提高CLEAs耐受高溫的能力，處理 3 h后，添加 BSA的 CLEAs(Lipase-BSACLEAs)殘留的酶活要高于不添加BSA的CLEAs。說(shuō)明BSA的添加不但增強(qiáng)了脂肪酶的交聯(lián)效率，而且大分子的BSA還能起到減緩高溫傳遞速度，保護(hù)脂肪酶使其不失活，從而降低了脂肪酶的失活速率。

圖6 固定化酶的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of immobilized lipase

2.4.2 固定化酶pH穩(wěn)定性

圖7是固定化酶pH的穩(wěn)定性結(jié)果，與游離酶相比，所有的CLEAs在pH4～12時(shí)表現(xiàn)出較高的耐受性，而且，添加BSA制備的CLEAs比不添加BSA制備的CLEAs表現(xiàn)出更高的pH耐受性。例如，當(dāng)在pH4的緩沖液中處理12 h時(shí)，Lipase-BSA-CLEAs酶活殘留率始終能保持在近80%，但Lipsae-CLEAs只有45%的酶活保留率，而游離酶在此條件下只有20%左右的酶活保留率，這些結(jié)果表明，通過(guò)將脂肪酶固定化成CLEAs，能顯著提高脂肪酶耐受酸堿的能力，而BSA的加入更有利于提高脂肪酶的交聯(lián)效率，降低了酶分子從酶聚體中的泄漏，從而提高了脂肪酶的穩(wěn)定性。

圖7 固定化酶的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH-stability of immobilized lipase

2.4.3 固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性

固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)固定化酶應(yīng)用價(jià)值的重要指標(biāo)［16］。圖8是固定化酶儲(chǔ)存25℃下的穩(wěn)定性結(jié)果，在儲(chǔ)存過(guò)程中，游離酶的酶活迅速下降，在儲(chǔ)存第6天時(shí)酶活只有初始酶活的50%。但所有固定化的CLEAs酶活都表現(xiàn)出明顯的增加，在儲(chǔ)存第6天時(shí)Lipase-CLEAs和Lipase-BSA-CLEAs的酶活分別達(dá)到最大，分別是初始酶活的229%和158%。這種現(xiàn)象也被Ferreira等［17］人發(fā)現(xiàn)。他們認(rèn)為，這種明顯的提高可能是由于殘留在酶聚體內(nèi)部的戊二醛將沒(méi)有被完全交聯(lián)脂肪酶繼續(xù)交聯(lián)固定，同時(shí)，殘留的戊二醛也會(huì)誘導(dǎo)脂肪酶活性中心的變化，導(dǎo)致酶活增加。

圖8 固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of immobilized lipase

2.4.4 固定化酶重復(fù)使用性

圖9是固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性結(jié)果。添加BSA制備的CLEAs的重復(fù)使用穩(wěn)定性要優(yōu)于不添加BSA制備的CLEAs，經(jīng)過(guò)連續(xù)的7次重復(fù)使用后，Lipase-BSA-CLEAs還能保留初始酶活的80%左右，但Lipase-CLEAs只有初始酶活的30%，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，BSA的添加增強(qiáng)了脂肪酶的交聯(lián)效率，脂肪酶的泄漏減少，從而使固定化酶的重復(fù)使用性更好。

圖9 固定化酶重復(fù)使用穩(wěn)定性Fig.9 Recycling stability of immobilized lipase

3 結(jié)論

通過(guò)研究BSA的添加對(duì)脂肪酶交聯(lián)酶聚體制備及穩(wěn)定性的影響，獲得最適的固定化酶制備條件是:BSA的最適添加質(zhì)量濃度是0.05 g/L，戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為1%，交聯(lián)時(shí)間是2 h。所得固定化酶的最大酶活回收率是70%。與不添加BSA所制備的CLEAs相比，酶活回收率增加了15%。同時(shí)，添加BSA所制備的CLEAs表現(xiàn)出較好的溫度適用性、pH和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，而且還具有優(yōu)秀的重復(fù)使用穩(wěn)定性，在連續(xù)重復(fù)使用7批次后，添加BSA所制備的CLEAs還能保持初始酶活的近80%。上述結(jié)果表明，這種通過(guò)添加BSA制備交聯(lián)酶聚體是提高交聯(lián)酶聚體催化效率的有效方法。

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