超聲輔助提取麻竹筍多糖*

鄭炯，吳金松，闞建全

1(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400715)

竹筍(bamboo shoot)是禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambusoideae)植物的新生芽，一直以來(lái)以高纖維、低脂、營(yíng)養(yǎng)豐富的“素食第一品”著稱(chēng)［1］。竹筍含有豐富的膳食纖維，具有促進(jìn)消化、降低血清膽固醇以及預(yù)防心血管疾病和癌癥等作用［2-8］。麻竹筍作為產(chǎn)筍量較高的品種之一，同樣具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。從麻竹筍中提取出的多糖可以作為益生元，同時(shí)具有抗氧化的活性［9-11］，具有較高的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值，然而國(guó)內(nèi)外對(duì)麻竹筍多糖的提取方法報(bào)道較少。

目前關(guān)于竹筍多糖的提取工藝研究，主要有水提醇沉法、酸堿水解法和酶法輔助提取法［12-15］等傳統(tǒng)方法，而對(duì)于超聲波輔助提取工藝的研究鮮有報(bào)道。超聲波輔助提取方法是從植物中提取有效成分的一種重要方法，主要是依靠超聲波的“空化作用”及其次級(jí)效應(yīng)，加速細(xì)胞壁的破碎，促進(jìn)胞內(nèi)多糖的流出，減少提取時(shí)間［16-19］。本實(shí)驗(yàn)擬采用響應(yīng)面曲線(xiàn)法，以麻竹筍多糖提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心設(shè)計(jì)法對(duì)超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間等關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，建立并驗(yàn)證相關(guān)的工藝數(shù)學(xué)模型，并對(duì)提取的多糖進(jìn)行了紅外光譜分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻竹筍，采自重慶市北碚區(qū)施家梁鎮(zhèn)麻竹筍種植基地。

葡萄糖標(biāo)品，美國(guó)Sigma公司;無(wú)水乙醇、苯酚、硫酸、無(wú)水乙醚、丙酮等，均為國(guó)產(chǎn)分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004分析天平，沈陽(yáng)龍騰電子儀器有限公司;722可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司;SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器有限公司;JP-500B高速多功能粉碎機(jī)，永州市九品工貿(mào)有限公司;SB25-12DTD臺(tái)式超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司;Spectrum-100 FT-IR紅外光譜儀，美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超聲波輔助提取麻竹筍多糖工藝

新鮮麻竹筍→去殼、切片、烘干、粉碎成末→脫脂→稱(chēng)取5g→超聲輔助提取→離心分離→上清液濃縮→醇沉→離心分離→無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚抽洗→干燥→竹筍多糖

準(zhǔn)確稱(chēng) 5 g竹筍粉，以 40∶1的水料比(mL∶g)［20］，以不同超聲波提取功率、不同超聲提取時(shí)間以及不同超聲溫度提取，將提取液離心，其殘?jiān)凑胀瑯拥某曁崛l件重復(fù)提取1次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空濃縮，加4倍于多糖溶液體積的無(wú)水乙醇沉淀多糖，用無(wú)水乙醇、丙酮多次洗滌后，多糖再?gòu)?fù)溶入水，冷凍干燥即得麻竹筍多糖［21］。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)［22-23］，在推薦的最佳超聲波輔助提取工藝條件下，以時(shí)間(30 min)、溫度(50℃)和功率(頻率20 Hz，功率360 W)為參考，變換各個(gè)單因素水平進(jìn)行試驗(yàn)，考察其對(duì)麻竹筍多糖提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度為自變量，麻竹筍多糖提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。通過(guò)Design Expert 8.0.7軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)超聲輔助提取麻竹筍多糖提取的最佳工藝。平行試驗(yàn)3次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面(RSA)試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor levers of the response surface test

1.3.4 多糖含量和提取率的測(cè)定

1.3.4.1 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

多糖含量采用硫酸-苯酚法［16-18］。分別量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液定容至1.0 mL。加入5%的苯酚溶液1 m、5 mL濃H2SO4，立即混勻，靜置30 min，室溫條件下于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)測(cè)定的值與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為:y=0.008 3x+0.020 9，R2=0.998 9。

1.3.4.2 麻竹筍多糖提取率的計(jì)算

將提取干燥后的多糖溶解，定容于250 mL的容量瓶中，取1.0 mL多糖溶液，依次快速加入1 mL 5%苯酚和5 mL濃H2SO4，混合均勻后用于比色測(cè)定迅速搖勻，室溫放置30 min，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立回歸方程算出竹筍多糖含量，然后按以下公式計(jì)算出麻竹筍多糖提取率:

式中:m為多糖質(zhì)量，mg;m1為竹筍粉末的質(zhì)量，mg。

1.3.5 麻竹筍多糖紅外光譜分析

對(duì)提取的竹筍多糖經(jīng)過(guò)脫蛋白、透析脫鹽、干燥壓片后于紅外光譜儀上進(jìn)行紅外光譜掃描，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理方法

使用 Origin8.6、EXCEL以及響應(yīng)面分析軟件(Design Expert 8.0.7)進(jìn)行相關(guān)圖表的繪制和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲時(shí)間的增加，超聲波空化作用加強(qiáng)，細(xì)胞壁破碎程度加大，竹筍多糖提取率不斷升高，在20 min時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)超聲波提取時(shí)間超過(guò)20 min時(shí)，多糖提取率反而逐漸降低，這可能是因?yàn)槌掷m(xù)的長(zhǎng)時(shí)間超聲作用會(huì)使液體過(guò)熱，使得多糖大分子鏈在超聲波的剪切作用下發(fā)生破壞和斷裂，而小分子的糖在醇沉處理過(guò)程中發(fā)生損失，從而降低多糖的得率［19］。因此，超聲時(shí)間應(yīng)該選擇20 min左右為佳。

圖1 不同超聲功率對(duì)竹筍多糖提取率的影響Fig.1 Effect of different ultrasonic power on the extraction rate of bamboo shoot polysaccharides

2.1.2 不同超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

從圖2可知，在功率120～360 W內(nèi)，超聲功率越強(qiáng)，則多糖提取率越高。當(dāng)功率大于360 W，多糖提取率逐漸降低，其原因可能是超聲波的機(jī)械空化作用導(dǎo)致分子之間的摩擦加劇，碳碳鍵斷裂而引起多糖降解，最終導(dǎo)致多糖提取率的降低［21］，所以超聲功率選取240～480 W較適宜。

圖2 不同超聲功率對(duì)竹筍多糖提取率的影響Fig.2 Effect of different ultrasonic power on the extraction rate of bamboo shoot polysaccharides

2.1.3 不同超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖3可知，在超聲溫度在40～50℃，隨著溫度的不斷升高，麻竹筍多糖提取率不斷提高，溫度在50℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大，而隨后隨著溫度的繼續(xù)升高提取率下降，這可能是因?yàn)樵谳^高溫度下，超聲波的空化作用和高溫破壁效應(yīng)導(dǎo)致多糖在胞外受到破壞進(jìn)而分解，這一結(jié)果與邵信儒等［18］和張桂等［27］的試驗(yàn)結(jié)果相一致。因此，超聲波輔助提取竹筍多糖的溫度選擇在45～55℃較好。

圖3 不同超聲溫度對(duì)竹筍多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic temperatures on the extraction rate of bamboo shoot polysaccharides

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化麻竹筍多糖提取工藝

2.2.1 中心組合試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以超聲時(shí)間、提取功率和提取溫度作為主要因素，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為分析因子，5個(gè)為零點(diǎn)。零點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行5次，以估計(jì)誤差。中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面(RSA)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of RSA

根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)使用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到模型的擬合曲線(xiàn)方程為:Y=2.39+0.11A+0.14B+0.095C-0.11AB-0.12AC+0.043BC-0.23A2-0.21B2-0.076C2。

同時(shí)對(duì)模型進(jìn)行了回歸系數(shù)和方差分析的顯著性檢驗(yàn)，分析和檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面方差分析二次模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface model analysis of variance table

由表3的方差分析可知，該模型的Prob＞F的值為0.001 6，小于0.05，表明該模型的回歸方程具有顯著性。超聲功率對(duì)多糖提取率有極顯著影響，超聲時(shí)間和超聲溫度有顯著影響，各因素對(duì)多糖提取率影響大小順序?yàn)槌暪β剩境晻r(shí)間＞超聲溫度，并且超聲時(shí)間與超聲功率、超聲時(shí)間與超聲溫度對(duì)多糖提取率的交互作用達(dá)到顯著水平。

2.2.2 響應(yīng)面分析因素之間的交互作用

圖4為超聲溫度50℃條件下，超聲時(shí)間和超聲功率的交互作用對(duì)麻竹筍多糖提取率的影響。由圖4可知，超聲功率的提高和超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)都能使多糖得率增加，并且在低水平條件下，提取率變化較大;在高水平條件下，提取率變化較慢，并且2個(gè)因素的交互作用顯著，但是2個(gè)因素達(dá)到一定條件后提取率下降，這是可能是由于超聲時(shí)間的延長(zhǎng)和超聲功率的提高使得糖鏈斷開(kāi)，變?yōu)楣烟腔騿翁牵斐啥嗵翘崛÷氏陆怠?/p>

圖4 超聲波時(shí)間和功率對(duì)提取率交互影響的三維曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.4 Response surface and contour plot of yield versus time and power of ultrasonic pretreatment

圖5為在超聲功率360W條件下，超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用對(duì)麻竹筍多糖提取率的影響。由圖5可知，超聲溫度和時(shí)間在較低水平時(shí)，提取率變化較大;當(dāng)2因素處于中間水平時(shí)，提取率趨向于最高，說(shuō)明兩因素交互作用顯著。在相同超聲時(shí)間下，升高溫度并不會(huì)一直提高多糖提取率，這可能是由于溫度的升高，溶液中分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，在超聲波的作用下，細(xì)胞被破壁后出現(xiàn)裂縫，兩者相互作用使得多糖迅速溶出，但溶出后的多糖在超聲波作用下發(fā)生部分降解，導(dǎo)致提取率下降。

圖5 超聲波時(shí)間和溫度對(duì)提取率交互影響的三維曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.5 Response surface and contour plot of yield versus time and temperature of ultrasonic pretreatment

圖6為在超聲30 min條件下，超聲功率和溫度的交互作用對(duì)麻竹筍多糖提取率的影響。由圖6可知，超聲功率和溫度在較低水平時(shí)，提取率變化較大;當(dāng)兩因素處于中間或者較高水平時(shí)，提取率趨向于最高，說(shuō)明兩因素交互作用不顯著。當(dāng)超聲功率或者超聲溫度在較高水平時(shí)都能使提取率達(dá)到最大。

圖6 超聲波功率和溫度對(duì)提取率交互影響的三維曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.6 Response surface and contour plot of yield versus power and temperature of ultrasonic pretreatment

2.2.3 最佳提取條件的確定和驗(yàn)證

利用Design Expert 8.0軟件，綜合考慮麻竹筍多糖提取率和實(shí)驗(yàn)可操作性等因素，得到最優(yōu)超聲工藝為超聲時(shí)間 29 min，超聲功率 400 W，超聲溫度55℃，在此條件下多糖提取率的預(yù)測(cè)值分別為2.51%。采用上述最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，實(shí)際測(cè)定值為(2.47±0.04)%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該超聲輔助工藝條件的可靠性和準(zhǔn)確性。而本課題組前期試驗(yàn)采用水提醇沉法提取麻竹筍多糖，提取時(shí)間一般要在1 h以上，提取溫度為80℃以上，提取率最高為2.19%，與之相比較，超聲波輔助提取時(shí)間縮短50%以上，提取溫度降低，大大提高了提取效率。

2.3 麻竹筍多糖紅外光譜分析

由圖7可知，在3 600～3 200 cm-1(3 412 cm-1)出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的寬峰，為羥基(—OH)的伸縮振動(dòng);在2 926 cm-1處吸收峰為甲基、亞甲基和次甲基等的C—H伸縮振動(dòng)峰，1 400～1 200 cm-1(31 395 cm-1)處的峰是C—H的變角振動(dòng)。這2組峰為多糖的特征吸收峰，這一鑒定結(jié)果與孫利芹等［28］對(duì)紫球藻多糖的紅外光譜分析結(jié)果相一致。而1 641 cm-1處吸收峰為羰基，1 026 cm-1處吸收峰為常見(jiàn)的吡喃型糖環(huán)，說(shuō)明麻竹筍多糖具有一般多糖在紅外光譜中的特征性結(jié)構(gòu)。因此，紅外光譜分析結(jié)果表明通過(guò)超聲輔助提取分離的物質(zhì)為麻竹筍多糖物質(zhì)。

圖7 竹筍多糖的紅外分析Fig.7 Infrared spectrum of crude polysaccharides extracted from bamboo shoot

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取麻竹筍多糖的最佳提取工藝條件為:超聲時(shí)間29 min、超聲功率400 W、超聲溫度55℃，在此條件下多糖提取率預(yù)測(cè)值為2.51%，驗(yàn)證值為2.49%，與預(yù)測(cè)值接近。與水提醇沉法相比，超聲波輔助提取時(shí)間縮短50%以上，提取溫度降低，大大提高了提取效率。同時(shí)，紅外光譜分析證明通過(guò)超聲輔助提取分離的物質(zhì)為麻竹筍多糖物質(zhì)。

［1］ 李安平，謝碧霞，鐘秋平，等.毛竹春筍提取物抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(5):97-100.

［2］ Debangana C，Jatindra K S，Sharma G D.Bamboo shoot:microbiology，biochemistry and technology of fermentation-a review ［J］.Indian Journal of Traditional Knowledge，2012，11(2):242-249.

［3］ Nirmala C，Madho S B，Sheena H.Nutritional properties of bamboo shoots:potential and prospects for utilization as a health food［J］.Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2011，10(3):153-169.

［4］ Santosh S，Poonam S，Lalit M B，et al.Bamboo shoot:a potential source of food security［J］.Mediterranean Journal of Nutrition and Metabolism，2012，5(1):1-10.

［5］ Fuchigami M.Differences between bamboo shoots and vegetables in thermal disintegration of tissues and polysaccharides fractionated by successive extraction［J］.Journal of Food Science，1990，55(3):739-745.

［6］ Humble C G，Malarcher A M，Tyroler H A.Dietary fiber and coronary heart disease in middle-aged hypercholesterolemic men［J］.American Journal of Preventive Medicine，1993，9(4):197-202.

［7］ Wolk A，Manson J E，Stampfer M J，et al.Long term intake of dietary fiber and decreased risk of coronary heart disease among women［J］.Journal of the American Medical Association，1999，281(21):1 998-2 004.

［8］ Satya S，Bal L，Singhal P，et al.Bamboo shoot processing:Food quality and safety aspect(a review)［J］.Trends in food science and technology，2010，21(4):181-189.

［9］ Singhal P，Bal L M，Satya S，et al.Bamboo ahoots:A novel source of nutrition and medicine［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2013，53(5):517-534.

［10］ Azmi A F M N，Mustafa S，Hashim D，et al.Prebiotic activity of polysaccharides extracted from gigantochloa levis(Buluh beting)shoots［J］.Molecules，2012，17(2):1 635-1 651.

［11］ ZHANG Zhong-shan，WANG Xiao-mei，YU Shu-chi，et al.Isolation and antioxidant activities of polysaccharides extracted from the shoots of Phyllostachys edulis(Carr.)［J］.Biological Macromolecules，2011，49(4):454-457.

［12］ 李義.竹筍水溶性多糖提取工藝研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2008，28(1):99-102.

［13］ 陳蕾俊，王曉梅，張忠山.毛竹筍多糖水浸提工藝條件研究［J］.中國(guó)釀造，2012，31(2):144-146.

［14］ Kato Y，Shiozawa R，Takeda S，et al.Structural investigation of a β-D-glucan and a xyloglucan from bamboo shoot cell-walls［J］.Carbohydrate Research，1982，109:233-248.

［15］ Kweon M H，Hwang H J，Sung H C.Isolation and characterization of anticomp lementary β-2glucans from the shoots of bamboo Phyllostachys edulis［J］.Planta Med，2003，69(1):56-62.

［16］ 張彬，謝明勇，殷軍藝，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取茶多糖工藝的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(9):234-238.

［17］ 陳湘寧，李宇華，丁軻，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取柿子多糖工藝的研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12(7):105-111.

［18］ 邵信儒，孫海濤，劉穎，等.超聲提取野生軟棗獼猴桃多糖工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2012，33(14):64-68.

［19］ 陳紅，張波，劉秀奇，等.超聲波輔助提取水溶性大豆多糖及純化工藝［J］.食品科學(xué)，2011，32(6):139-142.

［20］ 吳金松，鄭炯，闞建全.酶法輔助提取麻竹筍多糖［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40(8):258-262.

［21］ 劉強(qiáng)，吳艷，吳金鴻，等.超聲波輔助提取胖大海多糖工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2012，33(20):99-103.

［22］ ZHENG Yi，LI Yong，WANG Wei-dong.Optimization of ultrasonic-assisted extraction and in vitro antioxidant activities of polysaccharides from Trametes orientalis［J］.Carbohydrate Polymers，2014，111:315-323.

［23］ YING Zhi，HAN Xiao-xiang，LI Jian-rong.Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127(3):1 273-1 279.

［24］ 林肖惠，劉鵬，徐為人，等.牛膝不同炮制品中多糖的測(cè)定［J］.中草藥，2008，39(8):1 180-1 182.

［25］ 董群，鄧麗伊，方積年.改良的苯酚-硫酸法測(cè)定多特和寡糖含量的研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1996，31(9):550-553.

［26］ LI Cong，CAI Jian-ping，GENG Jing-shu，et al.Purification，characterization and anticancer activity of a polysaccharide from Panax ginseng［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，51(5):968-973.

［27］ 張桂，趙國(guó)群.超聲波萃取植物多糖的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26(9):302-306.

［28］ 孫利芹，王凌，馬翠華，等.紫球藻多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)解析［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2012，24(5):569-574.