PINK1對酪氨酸羥化酶的表達調(diào)控

魯玲玲，賈煥珍，楊 慧(首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系，北京市腦重大疾病研究院，北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點實驗室，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100069;通訊作者，E-mail:huiyang@ccmu．edu．cn)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年常見多發(fā)病，主要病理變化是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進行性變性缺失，紋狀體多巴胺(dopamine，DA)含量的降低，進而引起運動功能障礙［1］。研究表明，PD是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。研究PD相關(guān)基因的功能有助于理解PD發(fā)病機制。至今發(fā)現(xiàn)的與PD相關(guān)的基因有α-syn、PINK1(PTEN-induced kinase 1，PTEN誘導(dǎo)的蛋白激酶1)、LRRK2、UCH-L1、parkin 以及 DJ-1 等 16 種［2－4］。其中PINK1又稱PARK6，位于染色體1p35－36，其突變后可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性PD。有報道指出在家族性PD中，PINK1基因存在多個突變位點［5］。在散發(fā)性PD患者的病理學(xué)檢測中發(fā)現(xiàn)，有5%－10%的路易體為 PINK1免疫染色陽性［6－7］。說明 PINK1不僅與家族型PD發(fā)病相關(guān)，而且與散發(fā)性PD發(fā)病也有關(guān)系。

酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是多巴胺合成過程中的限速酶。有文獻報道，PINK1缺失或功能異?？梢鸲喟桶纺苌窠?jīng)元的數(shù)目減少，腦內(nèi)DA水平下降，引發(fā)類似帕金森病的運動障礙［8－11］。并且，在腦內(nèi)PINK1與 TH 存在共定位現(xiàn)象［9］，表明PINK1與TH之間存在某種聯(lián)系。因此，本研究擬在PINK1基因敲減及過表達的細胞模型中，研究PINK1對TH蛋白表達的調(diào)節(jié)作用。

1 材料方法

1．1 細胞株及主要試劑

小鼠多巴胺能神經(jīng)母細胞瘤細胞株(MN9D細胞)由瑞士諾華公司Bastian Hengerer博士惠贈。引物合成(上海英駿生物技術(shù)有限公司北京測序部);Wizard Plus Midipreps DNA Purification systems(Promega公司，美國);DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(Gibco公司，美國);RIPA裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);TH，β-actin抗體及山羊血清(Sigma公司，美國);PINK1抗體，Lipofectamine 2000，HRP標(biāo)記的二抗購于KPL公司(美國);熒光二抗購于Invitrogen公司(美國)。

1．2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

MN9D細胞采用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞實驗共分為四組，PINK1基因敲減組(轉(zhuǎn)染干擾序列PINK1shRNA1#或shRNA2#)及其對照組(轉(zhuǎn)染無關(guān)對照序列)、PINK1基因過表達組(轉(zhuǎn)染PINK1的真核表達質(zhì)粒)與對照組(轉(zhuǎn)染相應(yīng)空載體)。轉(zhuǎn)染前24 h向90 mm培養(yǎng)皿中接種生長狀態(tài)良好的MN9D細胞，每皿1×106個細胞，使轉(zhuǎn)染時生長至90%匯合。取375 μl OPTI-MEM加入轉(zhuǎn)染管中，向內(nèi)加入20 μl Lipofectamine 2000 Reagent，邊加邊振搖，輕混，室溫靜置5 min。然后取375 μl OPTI-MEM加入轉(zhuǎn)染管中，向內(nèi)加入12 μg攜帶 PINK1 shRNA及對照control載體，邊加邊振搖，輕混，室溫靜置5 min。將上述液體混合，室溫靜置20 min;在此期間，吸棄舊培養(yǎng)基，用OPTI-MEM洗滌細胞3次，以去除血清，后加入OPTI-MEM，每個培養(yǎng)皿7．5 ml及上述Lipofectamine 2000/質(zhì)粒 DNA混合液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h，更換為新鮮全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后相應(yīng)時間進行后續(xù)實驗。

1．3 免疫細胞化學(xué)

取正常培養(yǎng)的MN9D細胞，用4%多聚甲醛固定30 min。然后用PBST洗3次，每次10 min。用5%山羊血清室溫孵育1 h，加入anti-Nurr1(1∶200)抗體，4℃過夜，次日用 PBS洗3次，加入相應(yīng)的FITC標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體(1∶500)，37℃避光孵育1 h，PBS沖洗3次，加入DAPI于37℃避光孵育5 min復(fù)染細胞核，PBS沖洗3次，封片后用共聚焦掃描顯微鏡觀察。

1．4 Western blot檢測

選用RIPA蛋白裂解液進行細胞裂解，BCA法測蛋白濃度，SDS PAGE電泳，半濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，8%脫脂牛奶封閉1 h，分別入PINK1(1∶10 000)和 TH(1∶10 000)、Nurr1(1∶500)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃過夜。0．1%TBST 洗膜 3次，入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體中(1∶10 000)，室溫孵育1 h，洗膜同前。加入化學(xué)發(fā)光液，于暗室化學(xué)發(fā)光及顯影、定影。

1．5 real-time-PCR檢測基因表達水平

轉(zhuǎn)染PINK1shRNA于MN9D細胞中，利用Trizol一步法提取(參照試劑盒說明書)總RNA，以oligo(dT)為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。real-time PCR反應(yīng)條件:50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，退火15 s，72℃ 45 s，共40個循環(huán);72℃ 10 min。所用的引物為:小鼠PINK1上游引物:5'－AGAAAACCAAGCGCGTGTCT－3';下游引物:5'－GGAAGCCCTGCCAGCAT－3';小鼠 TH上游引物:5'－CGAGCTGCTGGGACACGTA－3';下游引物:5'－CTGGGAGAACTGGGCAAATG－3'。

1．6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均通過SPSS12．0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，數(shù)值以±s表示。

2 結(jié)果

2．1 干擾PINK1的MN9D細胞模型的建立

MN9D細胞轉(zhuǎn)染PINK1干擾序列(shRNA1#和shRNA2#)后24 h和48 h，檢測正常 MN9D細胞(normal)、轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的對照組細胞(control)、轉(zhuǎn)染干擾序列(PINK1 shRNA1#，shRNA2#)的干擾組細胞等各組細胞中PINK1的表達水平。在熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率很高。Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后24 h、48 h，干擾組(PINK1 shRNA1#，shRNA2#)PINK1的表達水平與對照組相比均明顯降低(P＜0．01，P ＜0．001，n=3)。且 PINK1 shRNA2#的干擾效率優(yōu)于shRNA1#(圖1)。

2．2 敲減PINK1基因組與對照組TH蛋白的表達水平比較

圖1 MN9D細胞轉(zhuǎn)染干擾序列(shRNA1#和shRNA2#)后24 h和48 h PINK1的表達水平Figure 1 PINK1 expression after knocked-down by shRNA for 24 h and 48 h

在MN9D細胞中敲減PINK1基因后24 h、48 h，用Western blot方法檢測p-TH及TH水平。正常MN9D細胞為normal組，轉(zhuǎn)染無關(guān)序列為對照組，轉(zhuǎn)染PINK1shRNA2#為干擾組。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PINK1干擾序列48 h后，p-TH和TH水平均明顯降低，但是p-TH/TH沒有明顯改變(見圖2)，說明示p-TH的水平可能是隨總TH水平的降低而降低的，提示干擾PINK1使總TH的水平降低，進而影響了p-TH的水平。恢復(fù)PINK1水平后，TH水平也明顯恢復(fù)(圖2)，進一步證實了TH水平的降低確實是由于PINK1缺失所引起。

圖2 在MN9D細胞中敲減PINK1基因24 h、48 h后p-TH及TH水平變化Figure 2 Western blot analysis of p-TH and TH protein levels at 24 h and 48 h

2．3 敲減PINK1組與對照組TH mRNA水平比較

本研究發(fā)現(xiàn)PINK1干擾可引起TH蛋白表達水平的降低，那么PINK1是否也影響TH的mRNA水平。為了探討PINK1是否從轉(zhuǎn)錄水平就影響了TH的表達，在MN9D細胞中敲減PINK1基因24 h、48 h后，用Real-time RT-PCR方法檢測TH的mRNA水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PINK1干擾序列24 h，48 h后，PINK1的mRNA水平明顯降低，TH的mRNA水平隨PINK1的干擾而降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖3 敲減PINK1后TH的mRNA水平變化(*P＜0．05，＊＊P＜0．001 vs control;n=3)Figure 3 Real-time PCR analysis of PINK1 and TH mRNA levels after knocking-down PINK1 gene(*P ＜0．05，＊＊P ＜0．001 vs control;n=3)

2．4 過表達PINK1組與對照組TH蛋白表達水平比較

本研究已經(jīng)證實敲減PINK1對TH表達的影響，為了進一步驗證兩者之間的關(guān)系，采用過表達模型來證明PINK1對TH的調(diào)控作用。在MN9D細胞中過表達PINK1基因48 h后，TH蛋白的水平與對照組相比明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義;轉(zhuǎn)染PINK1-G309D突變組細胞，TH蛋白的水平與對照組相比沒有明顯變化(見圖4)。

圖4 過表達PINK1后TH蛋白表達水平變化Figure 4 Western blot analysis of TH protein levels in MN9D cells after PINK1 overexpression

3 討論

PD的病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進行性丟失。PINK1突變不僅可引起家族性PD，而且與散發(fā)性的PD密切相關(guān)，但PINK1突變引起多巴胺代謝異?；蛘叨喟桶飞窠?jīng)元功能異常的機制尚不清楚。本實驗通過干擾PINK1基因的表達，成功建立 PINK1敲減的 MN9D細胞模型。在敲減PINK1的MN9D細胞模型中，發(fā)現(xiàn)p-TH和TH蛋白表達水平與對照組相比均明顯降低，而p-TH/TH的水平雖有減少，但是不具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示PINK1可能是從慢速調(diào)節(jié)(TH表達量)來影響TH的活性即p-TH的水平。為了進一步探討PINK1如何調(diào)控TH，在敲減PINK1的細胞中，檢測TH的mRNA水平，結(jié)果顯示TH無論是在mRNA水平還是蛋白水平均明顯降低。相反，當(dāng)過表達PINK1時，TH的表達出現(xiàn)上調(diào)。本研究首次從敲減和過表達正反兩方面證明了PINK1對于TH的調(diào)節(jié)作用。在斑馬魚模型中抑制PINK1的表達可引起TH mRNA水平下降［12］。同樣，在轉(zhuǎn)基因鼠中，敲減 PINK1之后，DA水平下降，但 TH陽性神經(jīng)元卻沒有明顯的降低［11］，說明敲減PINK1引起的DA水平下降可能不是由于多巴胺能神經(jīng)元減少造成的，而是調(diào)控了TH蛋白表達所造成的。因此，本研究所得結(jié)論與文獻報道的結(jié)果是相一致。由于TH是多巴胺合成過程中的限速酶，因此是PD基因治療中的一個重要靶基因。由于PINK1可以調(diào)節(jié)TH的表達，因此也可以作為將來PD基因治療的候選基因。這為PD的治療提供了一條新的思路。

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