PAK 6基因沉默對(duì)前列腺癌細(xì)胞放療敏感性研究

王新敏 ，章樂(lè) ，趙靜 ，李強(qiáng) ，倪釗 ，李應(yīng)龍 ，錢彪 ，王勤章

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，石河子 832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，石河子 832002；3石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放療科，石河子 832002）

前列腺癌（Prostate Cancer，PCa）為老年病，傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療和激素療法對(duì)激素難治性前列腺癌治療效果不佳，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都在探求其在基因水平的調(diào)控方法和尋找治療的新靶點(diǎn)。p21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)是一種最近被證實(shí)而且很少被了解的p21激活的磷酸化蛋白激酶家族成員之一[1]。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中，PAK6的蛋白表達(dá)和mRNA的表達(dá)均呈陽(yáng)性，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前列腺增生組織，和前列腺癌的分化程度密切相關(guān)[2-3]。提示臨床上若要全面阻斷雄激素作用，除要阻斷雄激素受體的信號(hào)外，還需抑制其旁路蛋白的激酶活性。本研究使用本課題組前期篩選并保存的靶向PAK6的shRNA，利用RNA干擾技術(shù)沉默PAK6基因的表達(dá)，研究PAK6沉默后對(duì)前列腺癌細(xì)胞放療敏感性的影響，探討能否通過(guò)干預(yù)PAK6增加前列腺癌細(xì)胞的放療敏感性，為前列腺癌分子治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

前列腺癌細(xì)胞株LNCaP由本室保存，1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司。攜帶GFP綠色熒光的PAK6-shRNA質(zhì)粒和shNC對(duì)照質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，前期篩選出并由本實(shí)驗(yàn)室保存。PAK6多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。LipofectamineTM2000、購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。CCK-8購(gòu)自DOJINDO公司。

1.2 方法

1.2.1 LNCaP細(xì)胞的培養(yǎng) LNCaP細(xì)胞在含10%FBS胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2飽和濕度。

1.2.2 PAK6-shRNA、shNC轉(zhuǎn)染 LNCaP細(xì) 胞轉(zhuǎn)染前24 h取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP細(xì)胞，胰酶消化，用含10%FBS胎牛血清1640培養(yǎng)液（不含抗生素）重懸，細(xì)胞調(diào)整密度為2×105/L接種于六孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞融合度達(dá)到85%轉(zhuǎn)染為宜。轉(zhuǎn)染時(shí)以250μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋10μL LipofectamineTM2000，再以250μLOPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋4μg質(zhì)粒DNA，指腹輕彈混勻。室溫放置5min后將兩者混合，室溫孵育20 min。吸去培養(yǎng)板中的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，然后將500μL shRNALipofectamineTM2000混合液逐滴加入到培養(yǎng)板中，輕混至于37℃ 5%CO2培養(yǎng)。4～6 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為L(zhǎng)NCaP組（空白對(duì)照組）；LNCaP+shNC組（空質(zhì)粒對(duì)照組）；LNCaP+shRNA組（基因沉默組）。各組轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行PAK6蛋白表達(dá)情況測(cè)定；并接受0、1、3、5 Gy單次劑量放射治療，48 h后進(jìn)行增殖和凋亡檢測(cè)。

1.2.4 Western Blot分析PAK6蛋白表達(dá)情況用核算蛋白測(cè)定儀進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定、配平。進(jìn)行SDS-PAGE（12%分離膠、5%濃縮膠）。用 Biorad的半干電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，電壓23V，40 min。室溫封閉 2 h，分別加入一抗(PAK6和 β-actin抗體)、二抗，用 Millipore公司化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影并壓片曝光。用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Image Lab軟件對(duì)Western blot檢測(cè)條帶進(jìn)行灰度值掃描。計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值比值和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況 將轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，單次放療48 h后取出相應(yīng)的孔板，加入 CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（A值）。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況 用冷PBS對(duì)細(xì)胞洗滌2遍，制備單細(xì)胞懸液，再用冷PBS洗劑細(xì)胞2次；用冷的、制備好的1×binding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106/mL，將不同的處理組各吸取100μL的細(xì)胞懸液到干凈流式EP管中。每個(gè)管都加入5μL的Annexin V-APC和10μL的7-AAD，輕輕混合，置于4℃冰箱避光 15 min，再增加 380μL的 1×binding buffer置每個(gè)EP管，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS16.0軟件處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)資料進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)比較各組間差異，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染24h后PAK6蛋白表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染24 h后PAK6蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖1。

圖1 Western Blot檢測(cè)PAK6的表達(dá)Fig.1 PAK6 expression in different groups by Western Blot

各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后β-actin蛋白條帶亮度相似，但PAK6條帶亮度有明顯差異(圖1a)。shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的PAK6蛋白條帶亮度明顯低于LNCaP組和LNCaP+shNC組。LNCaP組和LNCaP+shNC組在24 h無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。但LNCaP+shRNA與LNCaP組、LNCaP+shNC組相比均存在顯著性差異(P＜0.05)。表明實(shí)驗(yàn)室保存的靶向PAK6-shRNA質(zhì)?？擅黠@下調(diào)LNCaP細(xì)胞PAK6蛋白表達(dá)水平（圖1b)。

2.2 LNCaP細(xì)胞的增殖情況

LNCaP細(xì)胞的增殖情況見(jiàn)表1，圖2。各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染 24 h后進(jìn)行了 0、1、3、5 Gy單次劑量放射治療與對(duì)照組相比，shRNA干擾組細(xì)胞對(duì)放療的敏感性明顯高于LNCaP組和LNCaP+shNC組，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，并且隨著劑量的增加，基因沉默組的增殖抑制越明顯(P＜0.05)。

注：與 LNCaP+shNC和 LNCaP組比較，*表示 P＜0.05，與 0Gy組比較，#表示 P＜0.05。

圖2 LNCaP細(xì)胞的增殖情況Fig.2 The proliferation of LNCaP cells

2.3 LNCaP細(xì)胞的凋亡情況

LNCaP細(xì)胞的凋亡情況見(jiàn)（表 2，圖 3）。通過(guò)檢測(cè)各處理組的凋亡率發(fā)現(xiàn)，各組的凋亡率在放射劑量增加時(shí)均有顯著提高(P＜0.05)，而 shRNA干擾組的細(xì)胞在放射劑量為 0、1、3、5 Gy時(shí)均高于LNCaP組和LNCaP+shNC組，并且在放射劑量為5 Gy時(shí)明顯高于 0 Gy劑量組(P＜0.05)；而 LNCaP組和LNCaP+shNC組在放射劑量相同時(shí)均無(wú)明顯差別。

注：與 LNCaP+shNC和 LNCaP組比較，*表示 P＜0.05，與0Gy組比較，#表示 P＜0.05。

圖3 LNCaP細(xì)胞的凋亡情況Fig.3 The apoptosis rate of LNCaP cell with the action of PAK6 shRNA assayed with flow cytometry

3 討論

前列腺癌是歐美國(guó)家最常見(jiàn)的腫瘤，隨著人類平均壽命的延長(zhǎng)和診斷技術(shù)的提高，前列腺癌在世界癌癥總發(fā)病數(shù)中占十分之一，全球范圍內(nèi)每年約有20萬(wàn)患者死于前列腺癌。在美國(guó)，前列腺癌已經(jīng)躍居第2位致死癌，約半數(shù)年齡大于50歲男性前列腺中可發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。我國(guó)進(jìn)入了老齡社會(huì)，并且人民生活水平有了顯著提高，脂肪性食物攝入過(guò)多，前列腺癌的發(fā)病率有明顯增加的趨勢(shì)；新疆少數(shù)民族居多，飲食結(jié)構(gòu)較為單一，以肉食為主，所以此類疾病在新疆是極為重要的一種腫瘤性疾病。

大多數(shù)前列腺癌患者早期無(wú)明顯臨床癥狀，所以一旦發(fā)現(xiàn)并被確診時(shí)往往常常已屬晚期，失去根治性手術(shù)時(shí)機(jī)；且在采用以雄激素全阻斷為主的內(nèi)分泌治療方式一段時(shí)期后，常常轉(zhuǎn)為雄激素非依賴性前列腺癌 (androgen independent prostate Cancer，AlPC)或抵抗性前列腺癌，對(duì)常規(guī)內(nèi)分泌治療不再有效，甚至出現(xiàn)復(fù)發(fā)或多發(fā)轉(zhuǎn)移[4]。而傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療和激素療法對(duì)這種激素難治性前列腺癌(hormone-refraetory prostat cancer，HRPC)治療效果不佳，所以國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都在探求對(duì)前列腺癌基因水平的調(diào)控方法和尋找治療新靶點(diǎn)，還有一些研究嘗試聯(lián)合化療和基因治療結(jié)合的方式，以期在前列腺癌的治療上取得突破。

現(xiàn)有研究表明，雄激素在前列腺（癌）的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與分化中起決定性作用[5]。雄激素主要是通過(guò)雄激素受體（androgen receptor，AR）在前列腺細(xì)胞中傳遞信號(hào)[4]，同時(shí)受到雄激素受體關(guān)聯(lián)蛋白（ARAP）等旁路信號(hào)的調(diào)節(jié)。而新發(fā)現(xiàn)的p21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)可與AR的配體結(jié)合域（LBD）上的氨基酸序列629-919結(jié)合，它也是通過(guò)酵母雙雜交識(shí)別出來(lái)的新ARAP。PAK6能結(jié)合到AR代表著唯一所知的PAK家族成員和雄激素受體之間的相互作用[6]。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中，PAK6的蛋白表達(dá)和mRNA的表達(dá)均呈陽(yáng)性，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前列腺增生組織，和前列腺癌的分化程度密切相關(guān)[2-3]。所以PAK6可能參與了前列腺癌與激素相關(guān)的腫瘤的生物學(xué)行為，因此臨床上若要全面阻斷雄激素作用，除要阻斷雄激素受體的信號(hào)外，還需抑制其旁路蛋白的激酶活性。本研究利用前期篩選出的靶向PAK6的shRNA，從細(xì)胞水平研究阻斷PAK6表達(dá)在前列腺癌放療中的作用，探討其可否作為前列腺癌分子治療的靶點(diǎn)。

本研究用實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的靶向PAK6的shRNA作用于激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株LNCaP，并以空質(zhì)粒shNC作為對(duì)照，檢測(cè)在放療劑量為0、1、3、5 Gy的條件下，LNCaP對(duì)放療的敏感性是否有所增加。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組的凋亡率在放射治療時(shí)均有增加，細(xì)胞增殖也明顯受到抑制；并且 shRNA干擾組的LNCaP細(xì)胞在放射劑量為0、1、3、5 Gy時(shí)凋亡率均高于LNCaP組和LNCaP+shNC組，并且在放射劑量為5 GY時(shí)明顯高于0 GY劑量組 (P＜0.05)；其增殖情況則相反，并且隨著放射劑量的增加這種趨勢(shì)愈加明顯。而LNCaP組和LNCaP+shNC組在放射劑量相同時(shí)凋亡率和增殖情況均無(wú)明顯差別。這說(shuō)明，當(dāng)我們使用靶向PAK6的shRNA干擾PAK6的基因及蛋白表達(dá)時(shí)，可能增加LNCaP細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性，導(dǎo)致殺傷更多的前列腺癌細(xì)胞，增加了其凋亡率及抑制了該細(xì)胞的增殖。這可能與PAK6參與AR的信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。因?yàn)橛醒芯勘砻?，在多種腫瘤的靶向治療中，P21活化蛋白激酶家族顯示出很好的開(kāi)發(fā)潛能[7-9]，有多種腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)抑制激酶蛋白的表達(dá)而改變癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[10-12]。而ARAP信號(hào)通路傳導(dǎo)當(dāng)中 ，PAK6活 化 與 MKK6 (MAP kinase kinase6)/P38MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的結(jié)果是否與這一通路有關(guān)，我們將做進(jìn)一步的研究。因此，通過(guò)基因沉默的方式干擾PAK6的表達(dá)或者干擾其信號(hào)通路，有可能對(duì)前列腺癌生長(zhǎng)調(diào)控和干預(yù)治療提供一定的幫助，作為臨床上治療前列腺癌的一個(gè)有力參考。

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