水稻種子樣品前處理對轉(zhuǎn)基因成分熒光PCR檢測的影響

王志純，張 冰，邵碧英，江樹勛，繆婷玉，彭 娟，陳文炳

(1.福建省種子管理總站，福建福州350003;2.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建福州350001;3.廈門塔斯曼生物工程公司，福建廈門361023)

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，被推廣應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因生物種類越來越多.2012年全球有28個國家種植了1.7×108hm2的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，比2011年增長6%，是1996年的100倍.據(jù)估計，2012年全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種子創(chuàng)造的價值達(dá)到150億美元，主要有轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、菜籽及甜菜等[1].由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對人類、動物的健康、生態(tài)環(huán)境等存在不確定性與潛在風(fēng)險，許多國家都制定了嚴(yán)格的轉(zhuǎn)基因生物管理法規(guī)[2－3]，對轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品嚴(yán)加監(jiān)控，我國也先后出臺了轉(zhuǎn)基因生物與技術(shù)的相應(yīng)法規(guī)，如國務(wù)院令第304號《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，農(nóng)業(yè)部令第8號《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》等.我國迄今為止尚未批準(zhǔn)水稻等主糧作物的轉(zhuǎn)基因品種商品化生產(chǎn)，但由于一些農(nóng)作物科研單位對轉(zhuǎn)基因科研材料疏于管理、隔離不規(guī)范，可能因串粉而導(dǎo)致鄰近田塊的水稻遭受轉(zhuǎn)基因污染[4－5].歐盟、日本等國屢次從我國出口米制品中檢出未經(jīng)批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因水稻品系成分，對我國米制品實(shí)施更加嚴(yán)苛的入境檢查[6－7]，致使我國出口企業(yè)因此遭受慘重?fù)p失.因此，需要建立精準(zhǔn)的水稻種子轉(zhuǎn)基因檢測方法.實(shí)驗(yàn)室樣品制備與DNA提取等前處理對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性影響較大，但是，在現(xiàn)成的水稻等植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測方法等標(biāo)準(zhǔn)中[8－9]，對實(shí)驗(yàn)室樣品制作與DNA提取純化等處理只有籠統(tǒng)的表述，水稻種子樣品的粉碎細(xì)度等前處理對檢測結(jié)果的影響研究迄今未見報道.

DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)是目前物種鑒定、檢驗(yàn)檢疫與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測常用的方法[10]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于稻谷(米)及其制品的轉(zhuǎn)基因成分檢測[11－16].為提高水稻種子轉(zhuǎn)基因成分熒光PCR檢測方法的準(zhǔn)確性、降低方法的檢出限、規(guī)范操作程序，本研究以轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號種子樣品[含有CaMV 35S啟動子、NOS終止子、蘇云金桿菌(Bt)編碼晶體毒蛋白的Cry1Ab與豇豆胰蛋白酶抑制劑基因CpTI基因等外源基因]為實(shí)驗(yàn)材料，對影響水稻種子中轉(zhuǎn)基因成分檢測的主要前處理因素，包括樣品研磨細(xì)度與 DNA提取過程中的十六烷基三甲基溴化銨 (hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)裂解緩沖液溫育時間等進(jìn)行分析，以期篩選出優(yōu)化的前處理措施組合，提高稻谷轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時熒光PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，為建立水稻種子轉(zhuǎn)基因精準(zhǔn)檢測方法提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

非轉(zhuǎn)基因水稻“汕優(yōu)63”種子與轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號種子(轉(zhuǎn)基因稻谷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，科豐6號轉(zhuǎn)基因大米陽性參照物質(zhì)(轉(zhuǎn)基因大米質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%)由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供.

1.2 試劑

TE緩沖液(pH 8.0)、超純水、蛋白酶K、RNA分解酶為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品;Premix Ex Taq(2×)(Probe qPCR)試劑盒為大連寶生物科技公司產(chǎn)品;水稻內(nèi)源基因(GOS)與外源基因擴(kuò)增用的引物與探針[9]由大連寶生物科技公司合成(表1).其他試劑藥品均為國產(chǎn)分析純.

表1 熒光定量PCR引物/探針序列Table 1 The primer/probe sequence of fluorescence PCR

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 每個樣品均勻分為4份，稱取200 g，烘干研磨.非轉(zhuǎn)基因稻谷樣品研磨成粉末，分別過50目(濾過顆粒＜270 μm)與100目(濾過顆粒＜150 μm)圓振篩，制成顆粒細(xì)度＜50目、50－100目、＞100目3個細(xì)度范圍的樣品.科豐6號轉(zhuǎn)基因稻谷樣品粉末過篩方法同上.

非轉(zhuǎn)基因稻谷樣品粉末分別與顆粒細(xì)度相同的轉(zhuǎn)基因稻谷樣品按照不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行配制.稱取相同顆粒細(xì)度的非轉(zhuǎn)基因稻谷樣品粉末99.99 g與轉(zhuǎn)基因稻谷樣品0.01 g充分混勻，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的轉(zhuǎn)基因稻谷樣品.以同樣的方法制作轉(zhuǎn)基因稻谷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%的轉(zhuǎn)基因稻谷樣品.

1.3.2 DNA提取 采用CTAB法[11]提取DNA，稱取1 g樣品粉末于50 mL離心管中，加入5 mL質(zhì)量濃度為20 g·L－1的CTAB裂解緩沖液，于65℃恒溫?fù)u床中振蕩溫育(1、4、＞8)，最后將獲得的DNA溶于300 μL的0.1×TE緩沖液(pH 8.0)中，充分渦旋后，測定DNA溶液的 D260nm/D280nm值與質(zhì)量濃度(ng·μL－1).每份樣品重復(fù)提取2份DNA.

1.3.3 熒光PCR溫度循環(huán)與閾值設(shè)定 實(shí)時熒光PCR反應(yīng)溫度循環(huán)程序?yàn)?步法:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性35 s，60℃退火及延伸60 s，45個循環(huán).閾值設(shè)定原則[17]根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線略高于正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn).

1.3.4 熒光PCR反應(yīng)體系 熒光PCR單管反應(yīng)體積為20 μL，引物與探針等試劑加樣量如表2.

1.3.5 樣品前處理對熒光PCR檢測的影響 供試稻谷樣品的轉(zhuǎn)基因稻谷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%，按照1.3.1與1.3.2節(jié)設(shè)置的3種顆粒細(xì)度與3種CTAB溫育時間，共9種處理方法，各提取2份DNA，每份DNA做2次熒光PCR反應(yīng)，即每個樣本做4次PCR反應(yīng);共檢測4個基因，包括水稻內(nèi)源基因(GOS)與抗蟲轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種子常見的3個外源基因(CaMV 35S、NOS、Cry1Ab);共進(jìn)行144管PCR反應(yīng)，每次(96孔板)實(shí)驗(yàn)都設(shè)置陽性對照(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%科豐6號轉(zhuǎn)基因大米陽性參照物質(zhì))、非轉(zhuǎn)基因稻谷(汕優(yōu)63)陰性對照與雙蒸水(ddH2O)空白對照各1個.

1.3.6 轉(zhuǎn)基因水稻種子樣品檢出率 CTAB溫育時間同為＞8 h(過夜)的情況下，對3種不同顆粒細(xì)度轉(zhuǎn)基因稻谷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%的稻谷樣品，各提取24份DNA，每份DNA做2次PCR反應(yīng)，進(jìn)行3個外源基因CaM V35S、NOS、Cry1Ab的檢出率測試.

表2 熒光PCR反應(yīng)體系Table 2 Fluorescence PCR reaction systems

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖，對不同處理條件下樣品DNA質(zhì)量濃度與內(nèi)源和外源基因的實(shí)時熒光PCR檢測結(jié)果(Ct值)的差異顯著性進(jìn)行方差分析，并估算邊際均值條形圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品顆粒細(xì)度及CTAB溫育時間對DNA提取效果的影響

轉(zhuǎn)基因稻谷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的樣品DNA溶液的質(zhì)量濃度平均值如表3.各個組合樣品的DNA溶液 D260nm/D280nm值為1.7 －1.9，符合 PCR 檢測要求.

由表3可知，在相同的顆粒細(xì)度下，提取的DNA質(zhì)量濃度均隨著DNA提取過程中CTAB溫育時間的延長而提高，溫育時間＞8h條件下提取的DNA濃度高于其它2個溫育時間處理;在溫育時間相同情況下，DNA質(zhì)量濃度隨樣品顆粒細(xì)度目數(shù)的增加而增高，顆粒大?。?00目的樣品中提取的DNA質(zhì)量濃度比其余2種顆粒細(xì)度高;CTAB溫育時間＞8 h、顆粒大?。?00目的樣品提取的DNA質(zhì)量濃度在9種處理組合中為最高.

方差分析表明，樣品顆粒細(xì)度與CTAB溫育時間對樣品DNA提取質(zhì)量濃度的影響均達(dá)到極顯著水準(zhǔn)(F行=24.18，F(xiàn)列=28.62，F(xiàn)0.01=18.00，P ＜0.01).

表3 稻谷樣品提取到的DNA濃度Table 3 The DNA concentration of rice seed samples ng·μL －1

2.2 樣品前處理對熒光PCR檢測的影響

由表4可知，目數(shù)因素與時間因素對于稻谷樣品的內(nèi)源基因GOS和4個外源基因熒光PCR檢測結(jié)果的Ct值都有極顯著影響;目數(shù)和時間兩因素的交互作用，對樣品內(nèi)源基因GOS有極顯著影響，對外源基因CaMV 35S與NOS的檢測結(jié)果影響顯著，對Cry1Ab的檢測結(jié)果影響不顯著.

表4 前處理對水稻種子轉(zhuǎn)基因樣品(0.01%)4個基因Ct值的影響顯著性F檢驗(yàn)1)Table 4 F test of significant effect of pretreatment to Ct values of 4 genes in transgenic rice seed(0.01%)

基于Microsoft Office Excel 2003數(shù)據(jù)分析(圖1、圖2和圖3)，結(jié)果表明，樣品顆粒細(xì)度 ＞100目、CTAB溫育時間＞8h的前處理條件下，3個外源基因CaMV 35S、NOS、Cry1Ab熒光PCR檢測結(jié)果Ct值均為最小，靈敏度最高.因此選擇可見樣品顆粒細(xì)度＞100目和溫育時間＞8 h為前處理最佳組合.

圖1 0.01%轉(zhuǎn)基因含量稻谷樣品CaMV 35S估算邊際均值Fig.1 Estimating marginal average figure of CaMV 35S of 0.01%GM rice seed

圖2 0.01%轉(zhuǎn)基因含量稻谷樣品NOS估算邊際均值Fig.2 Estimating marginal average figure of NOS of 0.01%GM rice seed

圖3 0.01%轉(zhuǎn)基因含量稻谷樣品Cry1Ab估算邊際均值Fig.3 Estimating marginal average figure of Cry1Ab of 0.01%GM rice seed

2.3 樣品顆粒細(xì)度對稻谷低含量轉(zhuǎn)基因成分檢出率的影響

CTAB緩沖液溫育同為＞8 h的條件下，3個外源基因CaMV 35S、NOS、Cry1Ab的檢出率見表5.樣品顆粒細(xì)度 ＜50 目時，CaMV 35S、NOS、Cry1Ab 的檢出率分別為 52.08%、62.50%、54.17%;樣品顆粒細(xì)度在 50－100目時，3個基因檢出率分別為81.25%、85.42%、83.33%;樣品顆粒細(xì)度＞100目時，3個外源基因檢出率均為100%.

顆粒細(xì)度＞100目的樣品轉(zhuǎn)基因成分PCR檢測的Ct值平均數(shù)(由48個數(shù)據(jù)平均)都在判斷陽性結(jié)果的Ct值(陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)值為≤36)以下[9](表6).說明前處理中的研磨細(xì)度對檢出率有顯著影響，恰當(dāng)?shù)那疤幚泶胧┛梢允沟脵z出限(檢出率穩(wěn)定在95%以上的最低檢出含量[18])降低到0.001%，比報道的轉(zhuǎn)基因大米熒光 PCR 檢出限為0.01%[13，14]降低10 倍.

表5 樣品顆粒細(xì)度對稻谷樣品轉(zhuǎn)基因成分(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%)檢出率的影響Table 5 Effect of sample particle fineness on detection rate of transgenic component(0.001%)in rice seed samples

表6 樣品顆粒細(xì)度＞100目、CTAB溫育時間＞8 h處理組合的稻谷樣品轉(zhuǎn)基因成分(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%)檢測Ct平均值Table 6 Average Ct values detected from transgenic components(0.001%)in rice seed samples treated by combination of sample particle fineness＞100 mesh and CTAB incubation time＞8 hours

3 討論

稻谷(大米)和米制品轉(zhuǎn)基因檢測的研究多數(shù)限于方法的建立[11，12，14]，或是PCR方法的靈敏度試驗(yàn)[13－14]，而樣品前處理對轉(zhuǎn)基因成分檢測的影響研究，鮮見報道.本研究結(jié)果表明，樣品顆粒細(xì)度與CTAB溫育時間對DNA提取效果的影響均達(dá)到極顯著水準(zhǔn).顆粒細(xì)度＞100目與CTAB溫育時間＞8h的處理組合提取的DNA濃度最高.CTAB緩沖液溫育時間與樣品顆粒細(xì)度對內(nèi)源基因GOS和3個外源基因熒光PCR檢測結(jié)果都有極顯著影響;兩因素間的交互作用僅對內(nèi)源基因GOS有極顯著影響，對CaMV 35S、NOS有顯著影響，對Cry1Ab基因影響不顯著.3個外源基因檢測結(jié)果的估算邊際均值圖均表明樣品顆粒細(xì)度＞100目和溫育時間＞8 h為前處理最佳組合.在CTAB溫育時間＞8 h、樣品顆粒細(xì)度目數(shù)＞100目時，轉(zhuǎn)基因稻谷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%)的3個外源基因(CaMV 35S、NOS、Cry1Ab)檢出率均為100%，而且熒光PCR檢測結(jié)果Ct平均值都在陽性結(jié)果判斷值36以下.

當(dāng)置信水平為95%時，樣品測定值與零濃度樣品(不含待測成分)的測定值有顯著性差異即為檢出限，實(shí)驗(yàn)要求重復(fù)20次以上[18].本研究對添加科豐6號轉(zhuǎn)基因稻谷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%)的樣品進(jìn)行3種不同顆粒細(xì)度的處理，各重復(fù)提取24份DNA，每份DNA做2個PCR反應(yīng)，共48個PCR重復(fù)，3個外源基因CaMV 35S、NOS、Cry1Ab的檢出率表明，優(yōu)化的前處理條件與PCR反應(yīng)體系能夠使熒光PCR方法的檢出限從公認(rèn)的轉(zhuǎn)基因物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%降低到0.001%，即檢測方法靈敏度提高10倍.說明樣品前處理對稻谷種子轉(zhuǎn)基因成分檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性有重要影響.

[1]CLIVE J.2012年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J].中國生物工程雜志，2013，33(2):1－8.

[2]KAEPPLER H F.Food safety assessment of genetically modified crops[J].Agronomy Journal，2000，92(4):793 －797.

[3]NICKSON T E.Planning environmental risk assessment for genetically modified crops:problem formulation for stress-tolerant crops[J].Plant Physiology，2008，147(2):494 －502.

[4]戎俊，宋志平，蘇軍，等.Bt/CpTI轉(zhuǎn)基因稻及其非轉(zhuǎn)基因親本對照在間隔種植條件下的轉(zhuǎn)基因漂移[J].生物多樣性，2006，14(4):309 －314.

[5]陸永良，彭于發(fā)，王渭霞，等.抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻基因漂移至常規(guī)栽培稻的頻率研究初報[J].中國水稻科學(xué)，2010，24(6):663－666.

[6]European Community.Commission Decision(2008/289/EC)of 3 April 2008 on emergency measures regarding the unauthorised genetically modified organism‘Bt 63’in rice products[J].Official Journal of the European Union，2008，L096:29 －34.

[7]European Community.Commission Implementing Decision No 2011/884/EU of 22 December 2011 on emergency measures regarding unauthorised genetically modified rice in rice products originating from China and repealing Decision 2008/289/EC[J].Official Journal of the European Union，2011，L343:140 －148.

[8]陳紅運(yùn)，黃文勝，朱水芳，等.SN/T 1194—2003植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測抽樣與制樣方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[9]陳紅運(yùn)，梁新苗，陳雙雅，等.SN/T 2584—2010水稻及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時熒光PCR檢測方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[10]陳文炳，王志明，李壽崧，等.分子標(biāo)記在動植物檢驗(yàn)檢疫與GMO產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，33(4):494－500.

[11]MADE D，DEGNER C，GROHMANN L.Detection of genetically modified rice:a construct-specific real-time PCR method based on DNA sequence from transgenic Bt rice[J].European Food Research Technology，2006，224(2):217 －278.

[12]吳孝橫，路勇.利用實(shí)時熒光PCR方法檢測轉(zhuǎn)Bt基因大米[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25(2):211－216;220.

[13]吳志毅，張明哲，陳曦.大米和米制品Bt63轉(zhuǎn)基因檢測PCR方法的靈敏度研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21(6):549－554.

[14]黃新，張琰，侯立華，等.轉(zhuǎn)基因水稻“科豐6號”實(shí)時熒光PCR定性定量檢測方法研究[J].生物技術(shù)通報，2010(2):90－93.

[15]REITING R，GROHMANN L，MADE D.A testing cascade for the detection of genetically modified rice by real-time PCR in food and its application for detection of an unauthorized rice line similar to KeFeng6[J].Journal of Consumer Protection and Food Safety[J].2012，5(2):185 －188.

[16]魏霜，陳貞，蘆春斌，等.多重 PCR檢測轉(zhuǎn)基因水稻的轉(zhuǎn)基因成分[J].食品科學(xué)，2012，33(12):159－162.

[17]蔣春燕，王泰健，王琴，等.實(shí)時熒光定量 PCR技術(shù)[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(12):97－101.

[18]孫明.檢出限的分類與計算方法[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2012(3):33－34.