玻璃化凍融后胚胎卵裂球的損傷與生長融合對移植結(jié)局的影響

李偉，施文浩，李明昭，師娟子

（西北婦女兒童醫(yī)院，西安 710061）

1983年，世界首例凍融胚胎移植（FET）后成功妊娠［1］，在隨后的時間里，這項技術(shù)在世界范圍內(nèi)取得了飛速發(fā)展，現(xiàn)在已成為輔助生殖技術(shù)的重要組成部分。FET 不僅能夠增加促排周期的妊娠機會，避免胚胎浪費，降低患者的治療費用［2］；還能減少胚胎移植的數(shù)量，降低多胎妊娠的風(fēng)險［3］?，F(xiàn)在也有文獻報道FET 的臨床妊娠率和種植率與新鮮周期相比并無明顯差異［4］，但FET 比新鮮胚胎移植的異位妊娠率低［5］。影響FET 成功的因素很多，其中復(fù)蘇后胚胎的質(zhì)量，及其進一步發(fā)育的潛能尤為重要。本文通過對大樣本臨床資料的回顧性分析，探討玻璃化冷凍胚胎復(fù)蘇后卵裂球是否損傷，以及過夜培養(yǎng)后能否恢復(fù)分裂生長對移植結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象

本研究回顧性分析2010年1月至2012年2月的1 679個玻璃化冷凍復(fù)蘇胚胎移植周期。所有周期均為受精后72h玻璃化冷凍胚胎，所有胚胎解凍后均經(jīng)過夜培養(yǎng)。本研究實驗設(shè)計得到醫(yī)院倫理道德委員會批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)胚胎復(fù)蘇后是否有卵裂球損傷分為兩組：A 組（無損傷組，n＝1 357）、B 組（有損傷組，n＝322）。根據(jù)過夜培養(yǎng)后胚胎卵裂球是否分裂生長將A 組分為兩個亞組：AⅠ組（有生長組，n＝1 170）、AⅡ組（無生長組，n＝187）。根據(jù)胚胎卵裂球是否有融合將AⅠ組再分為：AⅠ-1 組（有融合組，n＝316）、AⅠ-2組（無融合組，n＝854）。當(dāng)胚胎卵裂球細胞形成致密連接，細胞邊界不明顯時為胚胎卵裂球融合。

2.胚胎質(zhì)量分級及冷凍胚胎選擇：按Peter卵裂期胚胎評分系統(tǒng)評估第3天胚胎質(zhì)量［6］，選擇評級為Ⅰ-Ⅲ的胚胎進行玻璃化冷凍。

3.胚胎玻璃化冷凍方法：采用Vitrification試劑盒（Kitazato，日本）進行玻璃化冷凍，冷凍液分為ES液和VS液，4℃保存。使用前在室溫（25℃）條件下平衡30min。將胚胎吸入ES液，室溫下放置約5min。胚胎卵裂球出現(xiàn)皺縮時再擴張，待胚胎卵裂球擴張至原體積的80%以上，將其放入VS液。然后胚胎放置于有患者信息的無菌載桿上，迅速投入液氮中。

4.FET 周期內(nèi)膜準(zhǔn)備：內(nèi)膜準(zhǔn)備分自然周期與人工周期兩種。自然周期：對于月經(jīng)規(guī)律、有自然排卵者在月經(jīng)第6～8 天開始B 超監(jiān)測卵泡發(fā)育，確認排卵時間。排卵后第2天下午進行胚胎解凍，第3天上午進行移植。人工周期：對于月經(jīng)不規(guī)律、排卵障礙的患者，在月經(jīng)第3～5天開始口服戊酸雌二醇（補佳樂，先靈，德國）2～4mg／d，5d后監(jiān)測子宮內(nèi)膜生長情況，并根據(jù)內(nèi)膜情況調(diào)整藥物劑量，可增量至6～8mg／d；當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8mm 時，加用黃體酮（浙江仙琚）肌肉注射20～60 mg／d，第4天下午進行胚胎解凍，第5天上午行胚胎移植。

5.胚胎解凍：胚胎解凍于移植前1天的下午進行。使用Vitrification試劑盒，解凍液分為TS液、DS液、WS1液和WS2液，4℃保存。使用前，TS液在37℃平衡30min，其他解凍液在室溫（25℃）條件下平衡30min。將冷凍載桿從液氮中取出，迅速將前端葉片浸入TS液，待胚胎脫落到TS液中（一般1min內(nèi)），將胚胎依次移入DS、WS1和WS2液，分別放置3min、5 min、5min后，轉(zhuǎn)入預(yù)平衡好的培養(yǎng)液中觀察，有≥50%細胞數(shù)目存活的胚胎記為復(fù)蘇，其余的丟棄。復(fù)蘇成功的胚胎隨后放入37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（18～20h）。

6.胚胎移植：采用B超引導(dǎo)下移植。移植時若移植內(nèi)管或外管出現(xiàn)肉眼可見的血液為移植出血。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用卡方（χ2）檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本情況

本研究納入的1 679個FET周期，均為胚胎解凍后、經(jīng)過夜培養(yǎng)后進行移植。其中解凍后胚胎無卵裂球損傷組（A 組）1 357個周期，有卵裂球損傷組（B組）322個周期。A、B兩組患者的促排卵年齡、基礎(chǔ)FSH 值、原發(fā)性不孕比例、移植時子宮內(nèi)膜厚度、移植出血發(fā)生率、移植胚胎數(shù)等比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。A、B兩組的胚胎凍存時間比較，B組為7個月，高于A 組的6.1個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

二、復(fù)蘇后胚胎卵裂球是否損傷對妊娠結(jié)局的影響

A 組的種植率和臨床妊娠率分別為32.33%、54.09%，均明顯高于B 組（23.07%、40.37%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。

三、復(fù)蘇后胚胎能否恢復(fù)分裂生長對妊娠結(jié)局的影響

AⅠ、AⅡ兩組比較，AⅠ組的種植率（33.87%）和臨床妊娠率（56.50%）均顯著高于AⅡ組（分別為22.08%和39.04%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表3）。

四、卵裂球是否融合對妊娠結(jié)局的影響

AⅠ-1 組的種植率和臨床妊娠率分別為40.93%、64.87%，明顯高于AⅠ-2 組的31.31%、53.40%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表4）。

表1 A、B兩組患者的基本情況［（±s），%］

表1 A、B兩組患者的基本情況［（±s），%］

注：與B組比較，＊P＜0.05

組 別 周期數(shù) 促排年齡（歲） 基礎(chǔ)FSH（U／L）原發(fā)性不孕率A 組1 357 29.8±4.3 7.0±4.4 56.9 B組 322 29.7±4.1 6.8±2.0 58.4組 別 周期數(shù) 胚胎凍存時間（月） 移植時內(nèi)膜厚度（mm） 移植出血發(fā)生率 移植胚胎數(shù)（枚）A 組 1 357 6.1±4.2＊9.4±1.4 47.7 2.3±0.5 B組322 7.0±5.9 9.4±1.3 44.1 2.3±0.6

表2 復(fù)蘇后卵裂球是否損傷對妊娠結(jié)局的影響［n（%）］

表3 卵裂球生長情況對妊娠結(jié)局的影響［n（%）］

表4 卵裂球融合對妊娠結(jié)局的影響［n（%）］

討 論

胚胎冷凍過程中，會形成冰晶損傷、冷休克、滲透性休克等冷凍損傷，這些損傷可能導(dǎo)致胚胎卵裂球的破壞，從而影響隨后的胚胎發(fā)育及著床。Houghton等［7］認為損傷的卵裂球釋放的胞質(zhì)能夠影響細胞間的信號傳導(dǎo)，從而降低胚胎活力。杜丹等［8］研究表明對于玻璃化凍融胚胎移植，卵裂球完整胚胎數(shù)小于2枚時其臨床妊娠率和胚胎種植率顯著降低。El-Toukhy等［9］研究發(fā)現(xiàn)解凍后無卵裂球損傷的胚胎和有卵裂球損傷的胚胎相比，移植后的臨床妊娠率（22.8%vs 13.5%）和種植率（17.3%vs 8.1%）差異顯著。也有研究表明胚胎凍融后，隨著卵裂球損傷的增多，臨床妊娠率顯著下降［10-11］。本研究中，凍融后無卵裂球損傷組（A 組）的種植率和臨床妊娠率分別為32.33%、54.09%，均高于有卵裂 球 損 傷 組（B 組）的23.07%、40.37%（P ＜0.01）。與上述文獻報道結(jié)果一致，表明胚胎凍融后如果發(fā)生卵裂球損傷，會影響后續(xù)的胚胎種植與妊娠。此外Nagy等［12］研究發(fā)現(xiàn)，將凍融后損傷的卵裂球移除能夠顯著提高胚胎的種植率。但也有研究表明，解凍后卵裂球損傷率低于25%的胚胎與沒有卵裂球損傷的胚胎相比，其種植率并沒有顯著性差異。

本研究中無卵裂球損傷組（A 組）與有卵裂球損傷組（B組）的胚胎凍存時間有差異，B 組高于A組，其余基本參數(shù)沒有顯著性差異，提示隨著胚胎凍存時間的延長，可能會增加復(fù)蘇后胚胎卵裂球損傷的發(fā)生，進一步影響胚胎種植與妊娠。但最近也有研究認為不管是卵裂期胚胎還是囊胚，凍存時間對其存活率、種植率都沒有影響［13-14］。這可能與胚胎冷凍保存所用的方法不同有關(guān)，Wirleitner等［13］及Liu等［14］使用封閉的保存方法，胚胎不直接接觸液氮，而本研究使用的是開放的保存系統(tǒng)，胚胎直接與液氮接觸。開放系統(tǒng)冷凍保存的胚胎，其凍存時間是否影響解凍復(fù)蘇后胚胎卵裂球的狀態(tài)有待于我們進一步的研究探討。

對復(fù)蘇后無卵裂球損傷組（A 組）進一步研究發(fā)現(xiàn)，有卵裂球分裂生長組（AⅠ組）的種植率和臨床妊娠率均高于無卵裂球分裂生長組（AⅡ組），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與Joshi等［15］研究發(fā)現(xiàn)的解凍后卵裂球恢復(fù)分裂的胚胎有更高的臨床妊娠率結(jié)果一致，表明胚胎解凍后經(jīng)過夜培養(yǎng)，可通過胚胎的卵裂球能否恢復(fù)分裂生長預(yù)測胚胎繼續(xù)發(fā)育的潛能。Laverge等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇后培養(yǎng)24h而無卵裂球分裂生長的胚胎，染色體異常率很高，只有20%的胚胎具有完全正常的二倍體，這可能就是其種植率低的原因。Sole等［11］研究認為解凍后有兩個以上卵裂球恢復(fù)分裂或胚胎發(fā)生融合，是移植成功一個很好的預(yù)測指標(biāo)。本研究中AⅠ組的胚胎，根據(jù)有沒有卵裂球融合分為有融合組（AⅠ-1組）和無融合組（AⅠ-2組），發(fā)現(xiàn)有融合組的種植率和妊娠率分別為40.93%、64.87%，顯著高于無融合組的31.31%、53.40%，表明解凍復(fù)蘇后的胚胎，經(jīng)培養(yǎng)后若達到融合狀態(tài)可以預(yù)測較高的種植率和妊娠率，提示凍融后出現(xiàn)融合的胚胎臨床上是否可以考慮行單胚胎移植。

綜上所述，胚胎凍融后如果有卵裂球損傷會影響后續(xù)的胚胎種植和妊娠。凍融后的胚胎經(jīng)過培養(yǎng)，是否能恢復(fù)分裂生長甚至達到融合狀態(tài)，可用于評價胚胎的發(fā)育潛能，對凍融周期胚胎的選擇有一定的指導(dǎo)作用。對于培養(yǎng)后卵裂球有融合的胚胎，是否可以考慮行單胚胎移植需要進一步的研究探討。

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