蔓越莓原花青素的提取工藝及其體外抗氧化活性研究

柯春林，郭猛，王娣，趙大慶，孫蘭萍

(蚌埠學院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

蔓越莓，也有人叫蔓越橘、小紅莓，歸屬于杜鵑花科越橘屬紅梅臺子亞屬，目前在北美的一些地區(qū)被廣泛種植，在我國的大興安嶺地區(qū)也比較常見［1］。蔓 越 莓 含 有 豐 富 的 原 花 青 素(34.3 mg/100 g)，具有抗氧化、延緩衰老、防治消化系統(tǒng)疾病、防治泌尿道感染、抗癌、保護口腔和牙齒等多種特殊功能［2］。原花青素是一種存在自然界的天然多酚，其主要結構是兒茶素、表兒茶素或者兒茶素與表兒茶素的聚合體，具有抗氧化、保護心血管、抗炎、抗菌、抗腫瘤和免疫調節(jié)等生物活性［3］。它是一種作用力很強的抗氧化劑，能有效地降低羥自由基和超氧根陰離子自由基的含量，保護DNA 細胞免受自由基引起的氧化損害，還可以有效地控制脂質過度氧化［4］。雖然國內外對蔓越莓的研究較多，但是還沒有關于我國大興安嶺蔓越莓原花青素相關的研究報道。

基于原花青素的多種生物活性，以及目前國內外正在進行的原花青素開發(fā)研究背景，探索蔓越莓原花青素的制備條件和生物活性的研究，不僅可以為保障人類健康發(fā)揮著不可替代的作用，而且還可以創(chuàng)造出更大的經濟效益，具有潛在的市場前景。盡管原花青素的制備方法很多，如有機溶劑提取、微波輔助提取、超聲波輔助提取、超臨界二氧化碳萃取、酶提取法等方法［5］，但考慮到乙醇是一種常見的食品原料，無毒性、價格低且回收利用很方便。因此，本文以我國大興安嶺蔓越莓為材料，研究蔓越莓原花青素的乙醇提取工藝以及其體外抗氧化活性，以期為我國蔓越莓資源開發(fā)及利用提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

大興安嶺野生蔓越莓;兒茶素標準品;香草醛、三羥基氨基甲烷鹽酸鹽、鄰苯三酚、鹽酸、乙醇、甲醇、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵等均為分析純。

722 可見光分光光度計;JJ500 型精密電子天平;DS-1 高速組織搗碎機;PHB-4 酸度計;DZKW-4型恒溫水浴鍋;LXJ-0B 型離心機;CS101-2AB 電熱鼓風干燥箱;RE-52A 旋轉蒸發(fā)儀;SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵等。

1.2 原花青素的提取

蔓越莓55 ℃烘干，粉碎(過60 目篩)，脫脂(石油醚法)，除蛋白(三氯乙酸法)。取2.0 g 蔓越粉末，用75% 乙醇提取，料液比1 ∶10 g/mL，溫度70 ℃，時間30 min。過濾，取濾液，旋轉蒸發(fā)濃縮，冷凍，干烘，得原花青素粗品。

1.3 原花青素的測定

原花青素在偏酸性情況下很不穩(wěn)定，4→8 連接鍵容易在酸的作用下解開，在原花青素提取液中加入鹽酸-香草醛顯色劑，可以使溶液變色［6］。本實驗以兒茶素為標準品，建立線性回歸方程，并采用香草醛-濃鹽酸法測定樣品在495 nm 吸光度，根據標準曲線換算原花青素的含量［7］，計算得率。

原花青素得率(%)=［m×V1×d×100］/［103×M］

式中 m——查標準曲線樣品液OD495對應的原花青素含量，mg/mL;

V1——待測樣品的取樣體積，mL;d——樣品溶液稀釋倍數;M——樣品取樣質量，g。

1.4 體外抗氧化活性實驗

1.4.1 對超氧根陰離子自由基(O·－

2 )的影響 采用鄰苯三酚自氧化法［8］，向試管中滴加濃度50 mmol/L的三羥基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液(pH 8.2)4.5 mL，加去離子水4. 2 mL，混合均勻后在25 ℃水浴鍋中水浴20 min，拿出，添加0.3 mL 鄰苯三酚溶液，立即搖勻，反應4 min。滴加0.3 mL 的6 mol/L鹽酸終止反應，測定吸光度A325nm，記為A0，并以鄰苯三酚溶液作為空白對照。再滴加不同濃度的蔓越莓原花青素溶液，作為待測液，測定原花青素的吸光度A325nm，記為A。計算不同濃度待測物對的清除率。

清除率=(A0－A)/A0×100%1.4. 2 還原能力的測定 運用我們以前的方法［9］，分別取1 mL 不同濃度的原花青素待測液與PBS 緩 沖 液0. 2 mL 混 合，準 確 加 入1. 5 mL K3Fe(CN)6溶液(1%)，在50 ℃水浴鍋中水浴20 min。拿出，用流水冷卻，加三氯乙酸1 mL，混勻后離心10 min。取上清2 mL，加0. 5 mL FeCl3(0.3%)和3 mL 去離子水，測定吸光度A700nm。以水代替FeCl3溶液作空白對照。以吸光值(A1－A2)表示樣品還原力，A1表示樣品管吸光值，A2表示樣品空白管吸光值。

2 結果與討論

2.1 乙醇濃度

按料液比為1∶10 的比例加入不同濃度的乙醇溶液，70 ℃水浴30 min，測定吸光值，結果見圖1。

圖1 乙醇濃度對原花青素得率的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on proanthocyanidins yield

由圖1 可知，當提取劑濃度在75%以下時，得率是遞增的，75%達到最大值，濃度繼續(xù)升高時得率下降。這是因為水有穿透植物細胞的作用，如果沒有水的存在，無法提取出有效成分。但另一方面，非結合水如果大量的存在，能溶于水的雜質一定會增加，這些因素都會干擾原花青素的提?。?0］，所以，確定乙醇濃度為75%。

2.2 料液比

乙醇濃度為75%，加入不同比例的乙醇液，70 ℃水浴30 min，測定吸光值，結果見圖2。

圖2 料液比對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of solvent/material ratio on proanthocyanidins yield

由圖2 可知，原花青素的得率與料液比存在量的關系，1∶10 達到最大，但是當料液比繼續(xù)增加時，得率略有降低。這是由于蔓越莓中的原花青素在1∶10 g/mL 時大致全部溶出。考慮到后續(xù)步驟以及經濟效益，所以料液比選擇1∶10 g/mL。

2.3 提取溫度

乙醇濃度75%，料液比為1∶10 g/mL，混合均勻后分別在50，60，70，80，90 ℃水浴鍋中提取30 min，測定吸光值，結果見圖3。

圖3 提取溫度對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on proanthocyanidins yield

由圖3 可知，隨溫度升高，原花青素得率提高，70 ℃時達到最大值，繼續(xù)升高溫度，得率降低。因為原花青素是易氧化物質，結構不是很穩(wěn)定，超過最佳溫度，原花青素的結構的破壞會越來越大，氧化程度越高，有效成分損傷就越多［11］。所以，提取溫度選擇70 ℃。

2.4 提取時間

圖4 提取時間對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on proanthocyanidins yield由圖4 可知，隨著時間的增加，得率逐步上升，

乙醇濃度75%，料液比1∶10 g/mL，混合均勻后在70 ℃水浴鍋中分別提取20，30，40，50，60 min，測定吸光值，結果見圖4。40 min 時，得率最大，時間持續(xù)上升，得率略有降低。這是由于原花青素結構不穩(wěn)定，提取時間增加會使部分原花青素結構遭到破壞分解。所以，時間取40 min為最優(yōu)條件。

2.5 正交實驗

在單因素實驗基礎上采用正交軟件進行正交實驗，因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal test

由表2 可知，對蔓越莓原花青素得率的影響:料液比＞提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間，最佳提取條件為A3B1C2D1。即料液比1∶15 g/mL，乙醇濃度65%，溫度70 ℃，時間30 min。

2.6 抗氧化

2.6.1 蔓越莓原花青素對O·－2的影響 原花青素能夠抑制鄰苯三酚的自氧化，清除超氧陰離子自由基［12］。

由圖5a 可知，含原花青素的蔓越莓乙醇提取液對超氧根陰離子的清除均隨著濃度的增加而提高，當原花青素濃度超過9.8 μg/mL 時，其對O·－2的清除作用明顯呈線性上升趨勢。當原花青素濃度達到24.5 μg/mL 時，其清除率達到55.7%。

圖5 蔓越莓乙醇提取液的抗氧化活性Fig.5 Cranberry ethanol extract antioxidant activity a.超氧陰離子清除能力;b.還原力

2.6.2 還原能力［13］原花青素還原力的測得結果見圖5b。

由圖5b 可知，隨著原花青素濃度的增加，還原力逐漸增加。當原花青素濃度超過2. 66 μg/mL時，其還原力上升趨勢尤其明顯。

3 結論

(1)以乙醇提取蔓越莓中原花青素的最佳工藝參數為:料液比1 ∶15 g/mL，乙醇濃度65%，溫度70 ℃，時間30 min。

(2)體外抗氧化實驗表明，含原花青素的蔓越莓乙醇提取液具有抗氧化活性，表現(xiàn)出較好的清除超氧根陰離子自由基效果和較高的還原能力，而且其抗氧化活性隨原花青素濃度的增加呈上升趨勢。

［1］ 李建科，楊靜慧，楊恩芹，等. 蔓越莓引種栽培的環(huán)境因素研究［J］.天津農學院學報，2011，18(4):27-30.

［2］ 姚立君，李赫宇，李許偉，等. 蔓越莓營養(yǎng)與保健功能研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34(8):120-123.

［3］ 張妍，吳秀香.原花青素研究進展［J］.中藥藥理與臨床，2011，27(6):112-116.

［4］ Wangensteen H，Brunlich M，Nikolic V，et al.Anthocyanins，proanthocyanidins and total phenolics in four cultivars of aronia:Antioxidant and enzyme inhibitory effects［J］.Journal of Functional Foods，2014，7:746-752.

［5］ 秦菲，王龍.原花青素提取方法的研究進展［J］.北京聯(lián)合大學學報:自然科學版，2012，26(4):36-40.

［6］ 陳鈞輝，李俊，張?zhí)?，?生物化學實驗［M］.4 版.北京:科學出版社，2008.

［7］ 李春陽，許時嬰，王璋.低濃度香草醛-鹽酸法測定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究［J］. 食品工業(yè)科技，2004，25(6):128-130.

［8］ 玄紅專，桑青，麻建軍.鄰苯三酚自氧化法測定不同蜂產品抗氧化活性的研究［J］.食品科技，2008(4):137-139.

［9］ Ke C L，Qiao D L，Gan D，et al. Antioxidant acitivity in vitro and in vivo of the capsule polysaccharides from Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus［J］. Carbohydrate Polymers，2009，75(4):677-682.

［10］黃思梅，張鏡，范玉琴，等. 短穗魚尾葵果實原花青素的提取工藝［J］.食品科學，2012，33(20):104-108.

［11］汪志慧，孫智達，謝筆鈞.蓮房原花青素的穩(wěn)定性及熱降解動力學研究［J］.食品科學，2011，32(7):77-82.

［12］吳春，陸海燕，代麗君，等. 原花青素的抗氧化活性研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學學報:自然科學版，2005(4):457-460.

［13］Leskovar D I，Cantamutto M，Marinangelli P，et al. Comparison of direct-seeded，bareroot，and various tray seedling densities on growth dynamics and yield of long-day onion［J］.Agronomie，2004，24:1-6.