不同抗生素檢測方法檢測乳清粉樣品結(jié)果差異性分析

文∕王媛媛 王 攀 劉曉輝 趙亭亭 楊婧悅 于景華* 姜中航 駱志剛

（1天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院；2北京銀河路經(jīng)貿(mào)有限公司）

脫鹽乳清粉是嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)的重要原料，其主要成分是乳清蛋白和乳糖，在嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)中用來調(diào)節(jié)乳清蛋白和酪蛋白的比例[1，2]。近年來，人們對各種乳制品中的抗生素指標(biāo)非常重視，尤其是嬰兒乳粉。因此，作為嬰兒乳粉主要原料的脫鹽乳清粉，抗生素指標(biāo)的檢測就顯得尤為重要。目前用來檢測生鮮乳、液態(tài)乳和乳粉中抗生素的方法很多，主要分為微生物法和免疫法[3]。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)抗生素檢測方法有：國標(biāo)法1（TTC法）、國標(biāo)法2（嗜熱脂肪芽孢桿菌法）；快速檢測中應(yīng)用比較多的則是微生物法試劑盒和酶聯(lián)免疫法快速檢測試劑盒[4，5]。乳品廠家因其方便性或自認(rèn)為的可靠性而在乳清類配料抗生素檢測上沿用上述某一種快速檢測方法。但實(shí)際上由于每一種檢測方法的原理和適用條件不同，因此得出的檢測結(jié)果未必真實(shí)地反映檢測對象的抗生素狀況。本研究以D90脫鹽乳清粉為樣品，采用不同的檢測方法對抗生素進(jìn)行檢測，比較了不同檢測方法間檢測結(jié)果的差異性，并對其進(jìn)行客觀地分析，以期為生產(chǎn)企業(yè)正確選用檢測方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

脫鹽乳清粉D90（愛爾蘭DAIRYGOLD公司生產(chǎn)）、脫脂乳粉（新西蘭）；青霉素（索萊寶生物制劑有限公司）；嗜熱鏈球菌（中國科學(xué)院微生物研究所CGMCC 1.3996）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC 10392）；利普斯50試劑盒（西班牙ZEU-INMUNOTEC，S.L.）、Charm MRL β-內(nèi)酰胺快速檢測條（北京博歐實(shí)德生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品理化指標(biāo)檢測

p H 值用p H 計(jì)直接測定；灰分測定參照國標(biāo)GB 5009.4—2010；乳糖測定參照國標(biāo)GB 54135—2010；蛋白質(zhì)組成分析采用SDS-Page法[6]。

1.2.2 抗生素檢測

8 個(gè)乳清粉樣品采用10%的復(fù)原液。以10%的無抗滅菌脫脂乳粉復(fù)原液作為陰性對照，以附加青霉素的滅菌脫脂乳復(fù)原液為陽性對照。分別按照國標(biāo)法1（GB/T 4789.27—2008）（嗜熱鏈球菌抑制法）、國標(biāo)法2（GB/T 4789.27—2008）（嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法）進(jìn)行檢測。

1.2.3 利普斯50試劑盒法

樣品準(zhǔn)備：乳清粉樣品配置成10%復(fù)原樣品，同時(shí)做陰性和陽性對照各1 份，陽性對照為青霉素G參照液（精密稱取青霉素G鉀鹽標(biāo)準(zhǔn)品，溶于無菌磷酸鹽緩沖液中，使其濃度為100～1 000 IU/mL，再用無抗生素的滅菌脫脂乳稀釋至0.006 IU/mL），陰性對照為不含抗生素的脫脂乳。具體檢測操作見說明書。

1.2.4 Charm MRL β-內(nèi)酰胺快速檢測條法（酶聯(lián)免疫層析法）

樣品準(zhǔn)備：經(jīng)10%復(fù)原乳清粉樣品，檢測前在（1 200±200）g下離心3 min，靜置后取澄清部分進(jìn)行檢測。另使用β-內(nèi)酰胺陰性樣品作為陰性質(zhì)控，用6 mL陰性質(zhì)控復(fù)原青霉素G陽性質(zhì)控片劑，配置成（4.0±0.4）mg/kg的青霉素陽性質(zhì)控。具體檢測操作和判定方法見說明書。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品部分理化指標(biāo)檢測結(jié)果

8 個(gè)乳清粉樣品的pH值、灰分和乳糖等生化指標(biāo)測定結(jié)果見表1。從表1可以看出，8 個(gè)乳清粉樣品的pH值、灰分、乳糖含量檢測結(jié)果沒有明顯差異。8 個(gè)樣品的SDS-Page分析見圖1。從圖1-A的非還原膠電泳與圖1-B還原膠電泳結(jié)果比較可見，8 個(gè)樣品的蛋白質(zhì)組成主要為：乳鐵蛋白（If）、牛血清蛋白（BSA）、免疫球蛋白（Ig）、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。在圖1-A上部可見復(fù)聚的大分子蛋白質(zhì)。而樣品經(jīng)過β-巰基乙醇還原后電泳圖1-B中可見，復(fù)聚物均被還原為上述5 種蛋白質(zhì)單體，其中免疫球蛋白Ig還原為輕鏈IgL和重鏈IgH，這表明5 種蛋白質(zhì)成分均有少量通過二硫鍵參與附聚物形成。但綜合比較8 個(gè)樣品的蛋白質(zhì)組成和變性程度沒有明顯差異。

表1 乳清粉樣品理化指標(biāo)

圖1 乳清粉樣品SDS-PAGE 電泳分析

2.2 樣品抗生素檢測結(jié)果

8 個(gè)乳清粉樣品抗生素的檢測結(jié)果見表2。由表2可見，按照國標(biāo)GB/T 4789.27—2008所述方法1進(jìn)行8 個(gè)樣品的抗生素檢測，結(jié)果均為陰性，即樣品均不含抗生素。而按照國標(biāo)GB/T 4789.27—2008所述方法2的檢測結(jié)果則與前者截然相反，8 個(gè)樣品均顯示為抗生素陽性。依據(jù)利普斯50試劑盒法檢測結(jié)果顯示，樣品4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)為陽性，樣品7號(hào)為弱陽性，即樣品所含抗生素的量接近檢出限；其余1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和8號(hào)樣品為陰性。Charm MRL β-內(nèi)酰胺快速檢測條法檢測結(jié)果顯示，8 個(gè)樣品抗生素檢測結(jié)果均為陰性，即未檢出抗生素。

表2 8 個(gè)乳清粉樣品的抗生素檢測結(jié)果

本研究所采用的4 種抗生素檢測方法中，國標(biāo)法1和國標(biāo)法2為國家推薦的乳制品抗生素檢測方法，均為微生物法。二者的原理均是以菌體是否正常生長增殖產(chǎn)酸，進(jìn)而使指示劑變色與否來作為樣品中抗生素檢測的判斷指標(biāo)。

國標(biāo)法1是以嗜熱鏈球菌為檢測菌，利用嗜熱鏈球菌在殺菌后的樣品中是否增殖產(chǎn)酸，并使指示劑2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC）變色來判明樣品中是否含有抗生素。此方法嗜熱鏈球菌的增殖產(chǎn)酸主要依靠檢測樣品中營養(yǎng)物質(zhì)是否滿足嗜熱鏈球菌生長條件。嗜熱鏈球菌最適生長溫度為42 ℃，而生長溫度范圍為35～45 ℃，對溫度變動(dòng)相對不甚敏感，在適宜條件下增殖迅速。但該菌對抗生素等生長抑制劑敏感，同時(shí)，該菌株也是酸奶生產(chǎn)菌種同類菌株，因此，該方法也被絕大多數(shù)酸奶生產(chǎn)廠家驗(yàn)收原料奶時(shí)用于抗生素檢測。所以，在本研究中8 個(gè)樣品檢測結(jié)果均顯示為抗生素陰性，檢測結(jié)果是可靠的。當(dāng)然，本方法也有一定的局限，就是當(dāng)檢測樣品中的營養(yǎng)物質(zhì)不夠豐富時(shí)，如樣品為乳清分離蛋白（WPI）時(shí)會(huì)因菌體生長受限而造成假陽性或陰性結(jié)果不明顯的現(xiàn)象。

國標(biāo)法2則從原理上彌補(bǔ)了國標(biāo)法1的不足：它是在含有pH指示劑（溴甲酚紫）的培養(yǎng)基預(yù)先混合嗜熱脂肪芽孢桿菌，加入樣品并孵育后，若該樣品中不含有抗生素或抗生素的濃度低于檢測限，細(xì)菌芽孢將在培養(yǎng)基中生長并利用糖產(chǎn)酸，pH指示劑由紫色變?yōu)辄S色。相反，如果樣品中含有高于檢測限的抗生素，則細(xì)菌芽孢生長受到抑制，pH指示劑的顏色保持不變，仍為紫色。因此，國標(biāo)法2是專門針對像乳清分離蛋白（WPI）或濃縮乳清蛋白（WPC50）以上的這類營養(yǎng)源缺乏的產(chǎn)品開發(fā)的。

利普斯50的檢測試劑盒是基于國標(biāo)法2的檢測原理開發(fā)的一種快速檢測試劑盒。它是在檢測試劑盒的微孔注入嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子和酸堿指示劑溴甲酚紫的瓊脂培養(yǎng)基。

本研究中用國標(biāo)法2對8 個(gè)理化指標(biāo)相近樣品的抗生素檢測結(jié)果全部顯示為陽性，與國標(biāo)法1的結(jié)果截然相反。究其原因，可能是由于國標(biāo)法2中的嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌體熱激后能否產(chǎn)生95%的芽孢很難確定；同時(shí)產(chǎn)生的芽孢對溫度和培養(yǎng)條件比較敏感，溫度波動(dòng)可能會(huì)使芽孢生長受到影響，這2 種情況都會(huì)造成假陽性檢測結(jié)果。利普斯50試劑盒避免了國標(biāo)法2細(xì)菌孢子不足的影響，也在培養(yǎng)溫度條件上加以完善，配有專門的加熱設(shè)備。但是利普斯50試劑盒的檢測結(jié)果也和國標(biāo)方法2有50%的結(jié)果是相互矛盾。由此可見，嗜熱脂肪芽孢桿菌法作為乳清粉抗生素檢測手段，其中存在諸多造成假陽性的因素，其抗生素檢測的穩(wěn)定性和可靠性均有待進(jìn)一步研究。

Charm MRL β-內(nèi)酰胺快速檢測條法屬于酶聯(lián)免疫層析法，較之國標(biāo)法1、國標(biāo)法2、利普斯50試劑盒法，大大縮短了檢測時(shí)間，且酶聯(lián)免疫方法特異性高，準(zhǔn)確度好，是國際上比較通用的方法。在本研究中8 個(gè)乳清粉樣品檢測結(jié)果全部為陰性。這種方法盡管僅對青霉素類和頭孢類抗生素有效，但已在一定程度上佐證了國標(biāo)法1的檢測結(jié)果。

3 結(jié)論

本研究對8 個(gè)在理化指標(biāo)上相近的乳清粉產(chǎn)品進(jìn)行了抗生素檢測，結(jié)果表明國標(biāo)法1和Charm MRL β-內(nèi)酰胺快速檢測條法檢測結(jié)果完全相同，全部為陰性。而國標(biāo)法2和依據(jù)國標(biāo)法2原理開發(fā)的利普斯50試劑盒檢測結(jié)果不僅與前兩者不同，而且二者之間亦有出入，8 個(gè)樣品抗生素檢測結(jié)果分別顯示為全部陽性和部分陽性。分析認(rèn)為，針對乳清制品，營養(yǎng)源豐富的產(chǎn)品，如乳清粉、低蛋白質(zhì)含量的乳清濃縮蛋白均可以采用國標(biāo)法1，即TTC試劑法來進(jìn)行抗生素的檢測，不僅可靠、方便，而且檢測結(jié)果具有仲裁效力。而營養(yǎng)源缺乏的乳清產(chǎn)品，如乳清分離蛋白（WPI）等，可使用國標(biāo)方法2，但一定注意溫度控制及產(chǎn)芽孢率等，避免檢測出假陽性結(jié)果。

[1]張和平，張列兵.現(xiàn)代乳品工業(yè)手冊.北京：中國輕工業(yè)出版社，2012.

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