高效液相色譜—蒸發(fā)光散射法檢測(cè)雪膽溶液中雪膽甲素的研究

駱延波　劉曉東　胡明　李璐璐　齊靜　劉玉慶

摘要：采用HPLC-ELS法，C18柱（4.6mm×250mm），流動(dòng)相為乙腈-水（40：60）；流速0.8mL/min；柱溫為室溫；檢測(cè)器為Alltech 2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；檢測(cè)溫度100℃；ELSD載氣為高純氮?dú)猓惠d氣壓力為0.35MPa，對(duì)雪膽溶液中雪膽甲素含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：在該方法下，雪膽甲素進(jìn)樣量在3.34～16.70μg之間，進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)與峰面積積分值的自然對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，其平均回收率為98.81%，RSD為0.92%（n=6）。所建方法簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確可靠，可用于雪膽溶液中雪膽甲素含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：雪膽溶液；雪膽甲素；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：S853.73

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A

文章編號(hào)：1001-4942（2015）10-0102-04

雪膽溶液是經(jīng)提取雪膽制成的單味藥制劑，其主要有效成分為雪膽甲素。雪膽提取物的檢測(cè)很多采用高效液相一紫外光檢測(cè)法，均為末端吸收法。在用高效液相一紫外檢測(cè)法測(cè)定時(shí)，由于雪膽甲素只在紫外末端有吸收，若采用低波長(zhǎng)（200～210nm）檢測(cè)，則溶劑背景難以消除，難以得到理想的測(cè)定結(jié)果。而示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器均能夠避免紫外檢測(cè)時(shí)末端吸收的缺陷。示差折光檢測(cè)器是基于樣品組分的折射率與流動(dòng)相溶劑折射率有差異的原理。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是基于把從色譜柱分離的組分霧化為小顆粒，在其穿過光束時(shí)導(dǎo)致光散射而被檢測(cè)的原理。但是考慮到示差折光檢測(cè)器對(duì)環(huán)境要求極為苛刻，而且靈敏度低，而利用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可以利用黃芪甲苷分子量大、熔點(diǎn)較高的優(yōu)點(diǎn)，有效避免因?yàn)槟┒宋斩鴰淼碾s質(zhì)峰干擾，是測(cè)定黃芪甲苷較理想的方法。為進(jìn)一步提高檢測(cè)的精確度，對(duì)雪膽甲素的含量采用HPLC法，用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

1材料與方法

1.1材料

雪膽：購(gòu)自河北安國(guó)中藥批發(fā)市場(chǎng)；雪膽甲素對(duì)照品：購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111518-200602；雪膽溶液：由山東德州神牛藥業(yè)有限公司提供，樣品批號(hào)為20120501、20120502、20120503。

1.2儀器與試藥

島津LC-10A高效液相色譜儀，ELSD-All-tech 2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)；色譜柱：C18，4.6mm×250mm，乙腈為色譜純（迪馬）；水為純凈水（娃哈哈）。

1.3HPLC-ELS檢測(cè)法的色譜條件

參照有關(guān)文獻(xiàn)[7～11]，選用C18柱（4.6mm×250mm），流動(dòng)相為乙腈-水（40：60）；流速0.8mL/min；柱溫為室溫；檢測(cè)器為Alltech 2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；檢測(cè)溫度100℃；ELSD載氣為高純氮?dú)?；載氣壓力為0.35MPa。

1.4試驗(yàn)用溶液制備

1.4.1樣品溶液制備 方法（1）：精密量取雪膽溶液1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，再精密移取5mL置25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，備用。方法（2）：精密量取雪膽溶液1mL置25mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，濾過，備用。采用上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄峰面積，方法（1）得到的峰面積為222491，方法（2）得到的峰面積為616732，故取方法（2）制備樣品溶液。

1.4.2對(duì)照品溶液制備 精密稱取雪膽甲素對(duì)照品20.88mg置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成0.835mg/mL的溶液，搖勻，濾過，備用。

1.4.3空白對(duì)照溶液 甲醇溶液。

1.4.4對(duì)照藥材溶液制備 稱取1.0g雪膽藥材，加90%乙醇50mL，超聲提取30min，濾過，取濾液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙庖浦?5mL量瓶中，定容，搖勻，濾過，備用。

1.5檢測(cè)方法檢驗(yàn)

1.5.1專屬性試驗(yàn) 取空白對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液、樣品溶液，按照色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄色譜圖。

1.5.2線性關(guān)系考察 精密量取上述對(duì)照品溶液2、3、4、6、10mL，加甲醇稀釋至10mL，搖勻。分別精密量取上述溶液20μL注入高效液相色譜儀，測(cè)其峰面積積分值，以峰面積（A）的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（C）的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。

1.5.3精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值，求其自然對(duì)數(shù)、平均值和RSD。

1.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品溶液，在0、2、4、8、12h分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積積分值，求其自然對(duì)數(shù)。

1.5.5重現(xiàn)性試驗(yàn) 重復(fù)上述操作，對(duì)批號(hào)為20120501的樣品溶液各測(cè)定6份，取平均值。

1.5.6回收率試驗(yàn) 取批號(hào)為20120501的樣品溶液0.5mL，共6份，分置25mL量瓶中。稱取35.2mg雪膽甲素置50mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取5mL添加至放有樣品溶液的量瓶中。按1.3的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。

回收率=測(cè)得量-樣品中含量/加入對(duì)照品的量×100%

1.5.7樣品測(cè)定 按1.3的色譜條件對(duì)3批樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)2次。

2結(jié)果與分析

2.1專屬性

由圖1可見，在樣品溶液色譜圖中，與對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液相同保留時(shí)間處，有相同的色譜峰呈現(xiàn)；在空白對(duì)照溶液色譜圖中，相同保留時(shí)間處無相同的色譜峰呈現(xiàn)，說明空白無干擾。

2.2線性關(guān)系

表1和圖2結(jié)果表明，雪膽甲素進(jìn)樣量在3.34～16.70μg之間，進(jìn)樣量（C）的自然對(duì)數(shù)與峰面積積分值（A）的自然對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

2.3精密度

表2結(jié)果顯示，ln（A）平均值為12.6889，RSD為0.023%，儀器精密度良好。endprint

2.4穩(wěn)定性

表3結(jié)果顯示，樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5重現(xiàn)性

由表4可見，雪膽甲素平均含量為7.6726mg/mL，RSD=0.33%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6回收率

由表5可見，平均回收率為98.81%，RSD為0.92%，表明該方法回收率良好。

2.6樣品測(cè)定結(jié)果

結(jié)合藥典中含量規(guī)定及本品處方投料量，雪雪溶液每毫升含雪膽甲素（C₃₀H₄₂O₆）不得少于6.0mg。表6可見，3批樣品測(cè)定結(jié)果均大于6.0mg/mL，說明該方法可行。

3討論與結(jié)論

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的響應(yīng)不依賴樣品的化學(xué)性質(zhì)，任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測(cè)，且響應(yīng)因子一致。本試驗(yàn)使用的Alltech 2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是低溫型檢測(cè)器，當(dāng)漂移管的溫度為40℃時(shí)可以把沸點(diǎn)為100℃的水完全霧化，能夠把基線噪音控制在較低水平。本試驗(yàn)結(jié)果表明，以雪膽甲素為指標(biāo)成分，測(cè)定雪膽溶液中雪膽甲素含量，重現(xiàn)性好，無雜質(zhì)峰干擾，簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確可靠，因此可作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制指標(biāo)。

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