薄層色譜法測定牛奶、蜂蜜中6種氟喹諾酮類藥物殘留

楊勇　羅奕　+吳琳琳　羅曼　茅向軍　楊微微　王儷甌

摘要：建立動物源性食品牛奶及蜂蜜中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星等6種氟喹諾酮類藥物殘留快速篩查的薄層色譜法。該方法中，樣品經(jīng)5%乙酸乙腈提取，經(jīng)改進的QuEChERS方法凈化，采用薄層色譜法對樣品中6種氟喹諾酮類藥物殘留物進行檢測。結(jié)果表明：該方法對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、雙氟沙星、丹諾沙星、沙拉沙星的檢出限分別為10、10、10、10、2、20 μg/kg；經(jīng)薄層色譜法檢測，在15批牛奶樣品中檢出 3批疑似陽性樣品，在15批蜂蜜樣品中檢出7批疑似陽性樣品；通過最終質(zhì)譜確認(rèn)，15批牛奶樣品中檢出1批陽性樣品，15批蜂蜜樣品中檢出2批陽性樣品。該方法耐受性好，可簡單、快速適用于牛奶、蜂蜜中氟喹諾酮類殘留的大批量篩選。

關(guān)鍵詞：牛奶；蜂蜜；氟喹諾酮類藥物；殘留量；薄層色譜法

中圖分類號： TS207.5 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0380-04

氟喹諾酮類（FQs）系化學(xué)合成藥物，因價格低廉、抗菌活性強，在醫(yī)學(xué)特別是在獸醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛。由于致病菌產(chǎn)生的耐藥性和某些FQs的潛在致癌性質(zhì)，其殘留問題已引起廣泛關(guān)注[1-4]。氟喹諾酮類檢測是動物源性食品中藥物殘留分析的重要研究內(nèi)容。檢測氟喹諾酮類藥物殘留的方法有微生物法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜檢測法等[5-6]，牛奶、蜂蜜中氟喹諾酮類藥物殘留檢測方法主要為高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜法，運用薄層色譜法進行檢測的研究較少。用于檢測食品中喹諾酮類藥物殘留的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 29692—2013《牛奶中喹諾酮類藥物殘留的測定》和GB/T 23412—2009《蜂蜜中喹諾酮類藥物殘留的檢測》均采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定氟喹諾酮類殘留。由于儀器設(shè)備昂貴、檢測方法復(fù)雜、試驗成本高的限制，該方法在國內(nèi)普及還需要較長時間。本研究應(yīng)用近年來在獸藥殘留檢測中應(yīng)用日趨廣泛的分散固相萃取樣品前處理凈化技術(shù)（quickly，easy，cheap，effective，rugged，safe，QuEChERS）[7-11]，用薄層色譜法對牛奶、蜂蜜中氟喹諾酮類殘留進行篩選，以期找出更為經(jīng)濟簡便、更適用于基層部門監(jiān)管食品安全的氟喹諾酮類藥物殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

牛奶樣品、蜂蜜樣品各15批，均為市售。6種氟喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品：恩諾沙星（純度為98.50%，貨號為C 13170000，批號為lot：91111）、沙拉沙星（純度為95.50%，貨號為C 16908000，批號為lot：10407）、雙氟沙星（純度為97.50%，貨號為C 12627000，批號為lot：91103）、諾氟沙星（純度為9950%，貨號為C 15648000，批號為lot：10214）、環(huán)丙沙星（純度為95.00%，貨號為C 11668500，批號為lot：00526）、丹諾沙星（純度為94.00%，貨號為C 11960500，批號為lot：00920），以上標(biāo)準(zhǔn)品均來自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與試劑

儀器：ATS-4型自動點樣儀[瑞士CAMAG（卡瑪）公司]；TD6M型醫(yī)用離心機（長沙平凡儀器有限公司）；BT2202S型電子分析天平（德國Sanorius公司）；TALBOYS 型渦旋儀（美國亨利特里姆有限公司）。

試劑：乙腈（色譜純，美國天地試劑公司）；冰乙酸（優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；三乙胺 （分析純，成都市科龍化工試劑廠）；N-正丙基乙二胺（PSA）（美國SELECTRA公司）；正己烷（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 ）；無水硫酸鎂（分析純，天津市美琳工貿(mào)有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司）；薄層板（Merck板，尺寸為100 mm×200 mm）。

1.3 對照品溶液的制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液 分別稱取恩諾沙星10.11 mg、沙拉沙星10.27 mg、雙氟沙星10.22 mg、諾氟沙星10.89 mg、環(huán)丙沙星10.70 mg、丹諾沙星10.81 mg，置于10 mL容量瓶中，加入20 μL甲酸和適量甲醇溶解，最后用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述溶液1 mL置于100 mL容量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、丹諾沙星濃度分別為9.958 3、 9.907 8、9.964 5、10.835 6、10.165 0、10.161 4 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液 分別吸取恩諾沙星、雙氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1 mL，沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液5 mL，丹諾沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0.2 mL，置于同一個10 mL量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得0.995 8 μg/mL恩諾沙星、 4.904 1 μg/mL沙拉沙星、 0.996 4 μg/mL雙氟沙星、1.083 6 μg/mL諾氟沙星、1.016 6 μg/mL環(huán)丙沙星、 0.203 2 μg/mL丹諾沙星的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（臨用前現(xiàn)配）。

1.4 供試品溶液的制備

1.4.1 牛奶樣品溶液的制備 稱取牛奶樣品10 g于50 mL離心管中，加入5%乙酸乙腈溶液15 mL，渦旋1 min；加入無水硫酸鈉1.5 g和無水硫酸鎂6 g，渦旋5 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液于另1個50 mL離心管中，加入正己烷5 mL，渦旋1 min，分取下層溶液。將上述殘渣加入10 mL 5%乙酸乙腈溶液中，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)同一份正己烷萃取，合并下層溶液，置于50 ℃水浴鍋上蒸干。將上述殘渣加入2 mL 0.2%甲酸水溶液中，再加入PSA凈化劑0.2 g和無水硫酸鎂0.5 g，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min，上清液過0.45 μm微孔濾膜，備用。endprint

1.4.2 蜂蜜樣品溶液的制備 稱取蜂蜜樣品5 g，置于100 mL離心管中，加入Mcllvaine緩沖液約5 mL，渦旋1 min；加入5%乙酸乙腈溶液至50 mL，渦旋10 min；加入無水硫酸鎂5 g，渦旋2 min。5 000 r/min離心5 min，吸取上清液 25 mL 至蒸發(fā)皿中于50 ℃水浴蒸干，加0.2%甲酸水溶液2 mL，加入PSA凈化劑0.2 g，渦旋1 min，離心，取上清液過 0.45 μm 微孔濾膜，備用。

1.5 點樣

在同一默克薄層板上，距板底邊13 mm處依次點6種氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液、混合對照溶液和供試品溶液各5 μL，將溶液點成帶狀，帶狀寬度為3 mm。

1.6 展開及檢視

以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（體積比 15 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 2 ∶ 1）為展開劑，飽和15 min后上行展開，取出，晾干，再噴3%三氯化鋱乙醇溶液，100 ℃烘1 min，取出，冷至室溫，在365 nm波長下檢視。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品結(jié)果判斷

如果供試品色譜中與對照色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，被視為疑似陽性樣品。試驗表明：15批牛奶樣品供試品色譜中，有3批樣品在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，則視為疑似陽性樣品，分別是2號、4號、11號樣品，其他樣品在與對照品色譜相應(yīng)位置上均未顯相同顏色的斑點，初步判斷其他12批樣品中未檢出6種氟喹諾酮類藥物殘留物。15批蜂蜜樣品供試品色譜中，有6批樣品在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，則視為疑似陽性樣品，分別是17號、19號、26號、27號、28號、29號樣品，其他9批樣品在與對照品色譜相應(yīng)位置上均無顯相同顏色的斑點，初步判斷其他9批樣品未檢出6種氟喹諾酮類藥物殘留物。從牛奶檢測結(jié)果圖譜（圖1）可見，基質(zhì)對樣品測定結(jié)果基本無干擾，說明牛奶樣品前處理方法是適用的；從蜂蜜檢測結(jié)果圖譜（圖2）可見，蜂蜜基質(zhì)對樣品測定結(jié)果有干擾，說明蜂蜜前處理方法不夠完善。

2.2 專屬性

取對照品溶液和自制模擬樣品溶液用點樣儀點樣，然后展開及檢視。結(jié)果表明，該方法專屬性強，陰性樣品無干擾，適用于牛奶、蜂蜜中6種氟喹諾酮類藥物的快速篩查。結(jié)果見圖3。

2.3 檢出限

供試品溶液色譜中待檢查的斑點應(yīng)與相應(yīng)的對照品溶液或系列對照品溶液的相應(yīng)斑點比較，顏色（或熒光）不得更深。結(jié)果表明，牛奶、蜂蜜中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、雙氟沙星的檢出限均為10 μg/kg，丹諾沙星的檢出限為2 μg/kg，沙拉沙星的檢出限為20 μg/kg。

2.4 質(zhì)譜確認(rèn)結(jié)果

將疑似陽性樣品經(jīng)過質(zhì)譜確認(rèn)，結(jié)果顯示所有疑似陽性樣品中有3批為陽性樣品，其余幾批均為假陽性樣品。質(zhì)譜確認(rèn)結(jié)果見表1，色譜圖和質(zhì)譜圖見圖4至圖9。

2.5 展開劑的考察

分別考察了5種展開系統(tǒng)：（1）四氫呋喃-乙酸乙酯-異丙醇-氨水（體積比4 ∶ 3 ∶ 6 ∶ 3）；（2）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（體積比16 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 3）；（3）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（體積比15 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 3）；（4）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（體積比15 ∶ 10 ∶ 7 ∶ 3）；（5）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（體積比15 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 2 ∶ 1）。結(jié)果表

明，系統(tǒng)1中6種喹諾酮只呈現(xiàn)4個點，其中丹諾沙星和沙拉沙星、恩諾沙星和雙氟沙星無法分離；系統(tǒng)2中6種喹諾酮只呈現(xiàn)5個點，其中丹諾沙星和沙拉沙星無法分離；系統(tǒng)3/系統(tǒng)4中丹諾沙星和沙拉沙星無法分離；只有系統(tǒng)5中6種喹諾酮均能分離，且Rf值為0.2～0.8。故選擇系統(tǒng)5為展開劑，飽和15 min，直立上行展開8～10 cm，取出，晾干。在紫外波長365 nm下觀察6種氟喹諾酮的斑點，并測量Rf值進行定性。

2.6 顯色劑的考察

分別考察了3%三氯化鉍乙醇溶液、3%三氯化鋱乙醇溶液2種顯色劑，在波長365 nm 下檢視。結(jié)果顯示，3%三氯化鋱乙醇溶液顯色后在波長365 nm下斑點明顯易于觀察。另外考察了1%、3%、5%、7%三氯化鋱乙醇溶液的顯色效果，結(jié)果顯示， 3%三氯化鋱乙醇溶液顯色后在波長365 nm下斑

點明顯易于觀察、無擴散。故選擇3%三氯化鋱乙醇溶液作為最終顯色劑。

2.7 薄層板的選擇

在選定條件下，分別運用國產(chǎn)高效硅膠G 預(yù)制板、國產(chǎn)普通硅膠G 預(yù)制板、自制板、H板、Merck板，觀察分離效果。結(jié)果表明，在Merck板中的分離效果優(yōu)于其他薄層板，斑點清晰，條帶無擴散，因此選擇Merck板進行薄層鑒別。

2.8 耐受性考察

用不同濃度的硫酸溶液來控制薄層板的相對濕度，觀察

展開劑在5種濕度下的展開情況。結(jié)果顯示，濕度為32%～72%時，均能獲得較好的分離效果。分別在高溫（40 ℃）、室溫（20 ℃）、低溫（4 ℃）環(huán)境下考察溫度對展開效果的影響，發(fā)現(xiàn)在各溫度條件下均能獲得較好的分離效果。

2.9 凈化劑及其用量選擇

目前對于氟喹諾酮類藥物殘留的凈化大多數(shù)選擇固相萃取。但是此方法操作步驟繁瑣、費用較高且回收率普遍偏低。本研究對近年來在農(nóng)藥、獸藥殘留應(yīng)用廣泛的樣品前處理技術(shù)QuEChERS進行了探索。目前分散固相萃取技術(shù)常用的吸附劑有C18 、NH2、PSA、PAX 等4種，根據(jù)牛奶基質(zhì)特點，選取C18、PSA比較其凈化效果及其對目標(biāo)物的影響。試驗表明，2種吸附劑對目標(biāo)物的影響沒有明顯區(qū)別，但C18對牛奶中蛋白質(zhì)和蜂蜜中糖提取物凈化效果有限，故采用PSA作為凈化劑。比較0、25、50、75、100、150、200 mg/mL PSA下的凈化效果，發(fā)現(xiàn)過量使用吸附劑會吸附目標(biāo)化合物，吸附劑使用較少時凈化效果不佳，當(dāng)吸附劑用量為100 mg/mL時目標(biāo)物幾乎無損失，且凈化效果較好。因此選擇PSA凈化劑用量為100 mg/mL。endprint

3 結(jié)論

本研究建立了牛奶、蜂蜜中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星等6種氟喹諾酮類的快速檢測方法，即薄層鑒別法。本方法簡單、快速，靈敏度高，檢出限均可滿足獸藥殘留篩查檢測要求。本方法為牛奶、蜂蜜中氟喹諾酮類藥物殘留監(jiān)測提供了簡單、快速的前處理和檢測手段，適用于大批量牛奶、蜂蜜樣品中氟喹諾酮類藥物殘留的篩選。本方法也適合其他對象中該類獸藥殘留的監(jiān)測，為食品安全快速檢測研究提供了研究基礎(chǔ)。參考文獻：

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