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    藜麥種子總黃酮提取及其抗氧化性

    2015-12-23 12:47孫雪婷袁俊杰蔣玉蓉陸國(guó)權(quán)毛前
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年10期
    關(guān)鍵詞:藜麥抗氧化活性總黃酮

    孫雪婷 袁俊杰 蔣玉蓉 陸國(guó)權(quán) 毛前

    摘要:為研究藜麥種子總黃酮的最佳提取工藝以及體外抗氧化活性,采用4因素3水平的正交試驗(yàn)法,探討乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提溫度和時(shí)間等因素對(duì)藜麥種子總黃酮的熱回流提取的影響。結(jié)果表明,藜麥種子總黃酮最佳提取條件為:體積分?jǐn)?shù)80%乙醇,料液比1 g ∶ 30 mL,60 ℃水浴條件下浸提60 min,其黃酮得率為2.64 mg/g。各因素對(duì)總黃酮提取率的影響程度從大到小依次為物料比>浸提時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>浸提溫度??寡趸钚栽囼?yàn)結(jié)果表明,藜麥種子中提取的總黃酮對(duì)DPPH·、·OH的清除率分別達(dá)90.89%、44.90%,其IC50(半抑制濃度)分別為9996、56.639 μg/mL。

    關(guān)鍵詞:藜麥;種子;總黃酮;提取工藝;正交試驗(yàn);抗氧化活性

    中圖分類號(hào): R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2015)10-0355-04

    藜麥(Chenopodium quinoa Willd.)別稱南美藜、奎藜、藜谷、奎奴亞藜等,是一年生的藜科(Chenopodiaceae)草本作物,原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū),至今已有5 000~7 000多年的利用和種植歷史,被印加人稱為“谷物之母”和“安第山的真金”[1-2]。藜麥蛋白質(zhì)含量高達(dá)13%~23%,富含人體無(wú)法生產(chǎn)和必需的9種氨基酸且比例平衡[3-4];鈣、鐵、鋅、銅、錳、鎂、鉀、硒等礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分的含量均較高[2,5];藜麥種子中的油脂富含不飽和脂肪酸、類黃酮、B族維生素和維生素E等多種有益化合物。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)為,藜麥?zhǔn)俏ㄒ坏膯我恢仓昙纯蓾M足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物,是最適合人類的全營(yíng)養(yǎng)食品[6]。美國(guó)國(guó)家航空航天局(NASA)更是將藜麥列為人類未來(lái)移民外太空空間的理想的“太空糧食”[7]。

    總黃酮是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一,是一種生理活性活潑的物質(zhì),具有抗病毒、抗炎、抗癌防癌、防止動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、降血脂及膽固醇、抗氧化、防衰老等藥理作用[8]。研究者已用不同方法在甘薯(Ipomoea batatas)[9]、蕎麥(Fagopyrum esculentum)[10]、銀杏(Ginkgo biloba)[11]、枸杞(Lycium chinense Miller)[12]、菊花(Dendranthema morifolium)[13]、柑橘(Citrus reticulata Banco)皮[14]、花生(Arachis hypogaea)殼[15]以及豆科(Leguminosae)植物[16]等中進(jìn)行總黃酮的提取及其含量測(cè)定。然而,有關(guān)藜麥總黃酮含量的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少[17]。本研究挑選已本土化栽培3年、農(nóng)藝性狀較好的藜麥品種Vanilla為材料,采用正交試驗(yàn)法對(duì)藜麥種子總黃酮的乙醇浸提法進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)測(cè)定其抗氧化活性,為優(yōu)質(zhì)高總黃酮得率藜麥品種的選育和利用等相關(guān)領(lǐng)域的深入研究提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    供試材料為農(nóng)藝性狀較好的藜麥品種Vanilla,由浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供,大田種植于該校官塘農(nóng)場(chǎng),于2014年4月移載種植,8月下旬收獲種子。種子干燥后充分碾碎,過(guò)60目篩篩選,裝入干燥器皿中備用。

    1.2 主要試劑和儀器

    試驗(yàn)試劑:DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社;蕓香苷對(duì)照購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、硝酸鋁、過(guò)氧化氫、氫氧化鈉、水楊酸、亞硝酸鈉等試劑(均為國(guó)產(chǎn)分析純)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

    主要儀器:DHG9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)、TP-214電子天平(丹佛儀器有限公司)、XMTD-6000恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司)、SHZ-DⅢ予華牌循環(huán)水真空泵(河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、752PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 藜麥種子總黃酮的提取 參考許鋼等提取黃酮的方法[18-20],設(shè)計(jì)藜麥黃酮提取的工藝流程:稱取0.5 g干燥粉末→浸提劑浸泡→熱回流提取→冷卻→過(guò)濾→濃縮→定容棕色容量瓶→避光保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[13] 準(zhǔn)確稱取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)試劑5.000 mg,用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇完全溶解后定容至50 mL,搖勻,得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別吸取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于6支 10.0 mL的試管中,用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇補(bǔ)至 0.5 mL,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min;再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL,放置6 min;再加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL,混勻,再加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇0.4 mL,室溫下放置15 min后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度。取上述中加入溶劑配制的溶液作為空白,于510 nm處比色測(cè)定提取液的吸光度。用最小二乘法進(jìn)行線性回歸,得蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(C)與吸光度(D)關(guān)系曲線的回歸方程:D=0.356 3C-0.009 6;r2=0.999 1。

    1.3.3 提取液中總黃酮得率的測(cè)定 分別取“1.2.1”節(jié)所得的待測(cè)總黃酮提取液代替蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,其他步驟與制作蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)方程相同。計(jì)算公式如下:

    總黃酮得率=(C×V1×V2×10-3)/(m/V0)×100%。

    其中:C為測(cè)定樣液的質(zhì)量濃度,g/L;V0為測(cè)定吸光度所用樣液的體積,mL;V1為測(cè)定時(shí)的稀釋體積,mL;V2為樣液定容后的體積,mL;m為樣品質(zhì)量,g。

    1.3.4 提取條件的選擇

    1.3.4.1 提取溶劑濃度對(duì)總黃酮得率的影響 取濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,料液比為1 g ∶ 30 mL,于60 ℃下熱水浴提取60 min,進(jìn)行總黃酮得率的測(cè)定。endprint

    1.3.4.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 在提取溶劑濃度為80%時(shí),料液比分別取1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL,于60 ℃下熱水浴提取60 min,測(cè)定總黃酮得率。

    1.3.4.3 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 當(dāng)提取溶劑濃度為80%、料液比為1 g ∶ 30 mL時(shí),分別在50、60、70、80、90 ℃熱水浴中提取60 min,進(jìn)行總黃酮得率的測(cè)定。

    1.3.4.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 在提取溶劑濃度為80%、料液比為1 g ∶ 30 mL的條件下分別提取30、45、60、75、90 min,再于60 ℃熱水浴中提取60 min,測(cè)定總黃酮得率。

    1.3.5 正交試驗(yàn)[21] 根據(jù)已有數(shù)據(jù)資料及實(shí)際情況,選擇提取溶劑濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素,以測(cè)得提取液中的總黃酮得率為考察指標(biāo),按照正交表L9(34)設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)。

    1.3.6 抗氧化性測(cè)定方法

    1.3.6.1 DPPH·的清除率[22] 準(zhǔn)確稱取DPPH·標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,溶于無(wú)水乙醇中,超聲5 min,充分振蕩,并定容于 100 mL 容量瓶中,配成0.1 mg/mL DPPH·儲(chǔ)備液,置于冰箱中備用。取不同質(zhì)量濃度的藜麥總黃酮提取液2 mL,分別加入0.1 mg/mL DPPH·溶液2 mL,搖勻,在黑暗中放置30 min,以無(wú)水乙醇為空白在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度D樣品,用無(wú)水乙醇代替DPPH·溶液按上述方法測(cè)定吸光度D對(duì)照,用無(wú)水乙醇代替藜麥種子總黃酮提取液按上述方法測(cè)定吸光度為D空白。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,按下式計(jì)算DPPH·的清除率:DPPH·清除率=[1-(D樣品-D對(duì)照)/D空白]×100%。

    1.3.6.2 ·OH的清除率[23-24] 在試管中依次加入濃度為6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL,不同質(zhì)量濃度的藜麥種子總黃酮提取液2 mL,6 mmol/L H2O2溶液2 mL,搖勻,靜置10 min,再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL,搖勻,靜置30 min,以蒸餾水為空白于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度D樣品,用蒸餾水代替水楊酸按上述方法測(cè)定吸光度D對(duì)照,用蒸餾水代替總黃酮提取液按上述方法測(cè)定吸光度D空白。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,按下式計(jì)算·OH清除率:·OH清除率=[1-(D樣品-D對(duì)照)/D空白]×100%。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 提取條件的選擇

    2.1.1 提取溶劑濃度對(duì)總黃酮得率的影響 從圖1可以看出,總黃酮得率隨乙醇濃度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì),于乙醇濃度為80%時(shí)達(dá)到最大。因此,乙醇濃度以70%~90%為宜。

    2.1.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 從圖2可以看出,總黃酮得率隨提取劑的增加呈先增加后降低的趨勢(shì),于料液比為1 g ∶ 30 mL 時(shí)達(dá)到最大。因此,料液比以1 g ∶ 30~50 mL為宜。

    2.1.3 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 從圖3可以看出,總黃酮得率隨提取溫度的增加呈“增加—降低—增長(zhǎng)”的趨勢(shì),

    于提取溫度為60 ℃時(shí)達(dá)到最大。因此,提取溫度以50~70 ℃ 為宜。

    2.1.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 從圖4可以看出,總黃酮得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后降低的趨勢(shì),于提取60 min時(shí)達(dá)到最大。因此,提取時(shí)間以30~60 min為宜。

    2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    將“2.1”節(jié)得到的提取條件結(jié)果按照L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表,L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

    由表2可以看出,熱回流法提取藜麥種子總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B1C2D3,即乙醇濃度為80%,料液比為1 g ∶ 30 mL,在60 ℃下提取60 min時(shí)的總黃酮含量最高,可達(dá)2.64 mg/g。試驗(yàn)結(jié)果與Yuko等的研究結(jié)果[25]基本保持一致,具有可靠性。極差值反映的因子影響順序?yàn)锽>D>A>C,即料液比對(duì)提取率的影響最大。

    2.3 抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果

    2.3.1 清除DPPH·效果的測(cè)定 DPPH·(二苯代苦味酰自由基) 在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,深紫色,在 517 nm 處有強(qiáng)吸收。有自由基清除劑存在時(shí),DPPH·的單電子被配對(duì),而使其顏色變淺,最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度變小,且這種顏色變淺的程度與配對(duì)電子數(shù)是成化學(xué)計(jì)量關(guān)系的。因此,用該波長(zhǎng)處的吸光度可檢測(cè)自由基的清除情況,從而評(píng)價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能力。抗氧化劑對(duì)DPPH·的清除率越高,其抗氧化性越強(qiáng)。藜麥種子總黃酮對(duì)DPPH·的清除作用見(jiàn)圖5。

    由圖5可知,藜麥種子總黃酮對(duì)DPPH·表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除作用,且與濃度呈正相關(guān),IC50值為9.996 μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明其清除能力高于小麥麩皮[26]、生姜[27]等。

    2.3.2 清除·OH效果的測(cè)定 ·OH是最活潑的自由基,細(xì)胞內(nèi)的H2O2能與Fe2+或Cu2+反應(yīng)生成·OH。另外,紫外線也能使H2O2均裂生成·OH。同時(shí),·OH也是毒性最大的自由基,它可與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損害,且反應(yīng)速度快[28]。藜麥種子總黃酮對(duì)·OH的清除作用見(jiàn)圖6。

    由圖6可知,藜麥種子總黃酮對(duì)·OH表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除作用,且與濃度呈正相關(guān),其IC50值為56.639 μg/mL,可見(jiàn)其清除能力高于小麥麩皮[26]、小駁骨[29]等。

    3 結(jié)論

    本研究通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化藜麥種子總黃酮的提取工藝條件,本著溶劑無(wú)毒性、易回收、對(duì)黃酮溶解力強(qiáng)和工藝簡(jiǎn)單的原則,確定乙醇為最佳提取劑。試驗(yàn)結(jié)果表明最佳工藝條件為:提取溶劑(乙醇)濃度為80%,料液比為1 g ∶ 30 mL,在溫度60 ℃下提取60 min。在此條件下,藜麥種子總黃酮得率高達(dá)2.64 mg/g。藜麥種子總黃酮對(duì)DPPH·和·OH有較好的清除能力,且隨著濃度的增加,清除能力增加,清除率分別可達(dá) 90.89%、44.90%。其 IC50值分別為9.996、56.639 μg/mL。同時(shí),本工藝在一定程度上節(jié)省原料,從而為其用于工業(yè)生產(chǎn)方面提供了一定的理論依據(jù)。endprint

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