1D TOCSY 技術(shù)用于水溶液中氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)指認

葉劍良， 歐陽捷， 陳 忠

(廈門大學a. 化學化工學院;b. 物理與機電工程學院，福建 廈門361005)

0 引 言

D-氨 基 葡 萄 糖 鹽 酸 鹽 (D-Glucosamine Hydrochloride，GAH，化學名為2-氨基2-脫氧D-葡萄糖鹽酸鹽)和 N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-Acetyl-DGlucosamine，GlcNAc)是生物體細胞中糖鏈的重要組成單元，也是一類具有顯著生物活性的氨基葡萄糖類化合物［1］。氨基葡萄糖在人體內(nèi)分布非常廣泛，其在血液中的正常濃度比葡萄糖濃度還高。但一般都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)參與人類的重要生理活動［2］，無游離態(tài)存在。由于具有顯著的抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和防腐抗菌等功效［3-5］，這類化合物在藥物、保健食品和美容產(chǎn)品中應(yīng)用廣泛。開展氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)及光譜學特性的研究，能夠為該類化合物的化學修飾改性工作提供很好的參考價值［6-9］。

核磁共振(NMR)應(yīng)用于糖化合物的結(jié)構(gòu)鑒定［10］始于20 世紀70 年代，該技術(shù)可直接測定單糖、寡糖以及糖鏈的結(jié)構(gòu)，能為研究者省去許多復(fù)雜的化學降解步驟。但目前有關(guān)氨基糖及其衍生物的NMR 譜研究報道相對較少［3，11］。而氨基糖類化合物在水溶液中很容易發(fā)生變旋，由單一構(gòu)型化合物變?yōu)棣粒?兩種構(gòu)型的混合物，加之糖環(huán)質(zhì)子化學位移差異不大，導致信號相互重疊交叉嚴重，極大增加了核磁譜圖的復(fù)雜性。如果遵循常規(guī)思路，需要各類型1H、13C 及2D NMR(包括COSY、HSQC、HMBC、TOCSY 甚至NOESY 等)實驗數(shù)據(jù)綜合推敲，才能保證此類化合物的結(jié)構(gòu)得以準確解析。本文利用選擇性1D TOCSY 技術(shù)隨混合時間的延長能由近到遠順序提取耦合網(wǎng)絡(luò)中不同位置質(zhì)子信息的特點［12-13］，使得同一端基異構(gòu)體糖環(huán)上的質(zhì)子選擇性地順序出峰，有效地消除了譜峰重疊的影響，快速、明確地完成了無法分離的α，β-氨基糖端基異構(gòu)體混合物的質(zhì)子信號的分組歸屬和核磁信息全指認流程。該結(jié)論得到了2D NMR 實驗數(shù)據(jù)的很好驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

實驗均在AVANCE Ⅲ500 型超導核磁共振波譜儀(德國布魯克公司)上完成，配有11.74 T 牛津超導磁體，三通道檢測系統(tǒng)，BVT3000 溫控單元，5 mm Z 梯度寬帶探頭(BBO Probe)和TOPSPIN2.1 核磁共振專用軟件。

1.2 試劑和樣品

重水(D2O，北京金鷗翔科貿(mào)有限公司，氘代度大于99.9%)。

待測樣383 和170 均為白色粉末狀晶體，易溶于溶劑重水(D2O)，分子式為C6H14NO5Cl 和C8H15NO6，初步判斷為化合物D-氨基葡萄糖鹽酸鹽和N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

1.3 實 驗

1D TOCSY［14-15］技術(shù)是二維TOCSY 實驗的一維簡化，選擇性1D TOCSY［16］則是通過優(yōu)化整形脈沖的脈沖形狀、寬度、強度、間隔(即混合時間)，對目標核進行激發(fā)，最終能夠選擇性地順序(隨相隔共價鍵數(shù)由近及遠)獲得同一自旋體系下，與激發(fā)核直接或間接耦合的質(zhì)子信息［17］，在糖環(huán)類結(jié)構(gòu)解析中具有獨特的優(yōu)勢［18-19］。綜合選擇性、信噪比及峰型等方面的實驗效果考慮，本工作選擇Gaussian 脈沖，以糖環(huán)上異頭質(zhì)子峰為激發(fā)中心，信號激發(fā)寬度為16 Hz。通過改變整形脈沖的混合時間，獲得系列1D TOCSY 譜，對糖環(huán)質(zhì)子位移信息進行指認?；旌蠒r間選擇區(qū)間為10 ～200 ms。

在此基礎(chǔ)上，結(jié)合13C NMR、DEPT135、HSQC 和HMBC 實驗結(jié)果完成對2 種氨基糖類化合物的α，β構(gòu)型混合物氫、碳核磁信息的全指認。所有實驗均在室溫條件(298 K)條件下完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 常規(guī)1H NMR、13CNMR 數(shù)據(jù)分析

重水溶解待測樣383 和170，其常規(guī)1H NMR 譜的信號均明顯嚴重重疊(見圖1)。以樣品383 為例，如果其為單一的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽化合物，扣除羥基及氨基活潑氫(實際檢測中會被重水氘代而不產(chǎn)生質(zhì)子峰)數(shù)目，結(jié)構(gòu)中只有7 個質(zhì)子。而實際氫譜，以δH4.5 以上積分值約為1.0∶0.6 的2 組質(zhì)子信號為參考，其余質(zhì)子峰積分值分別接近1.0 或0.6 的整數(shù)倍，不再滿足同一整數(shù)比的關(guān)系;并且積分總加和值接近1.6 的7 倍;同樣，樣品170 的1H NMR 譜也呈現(xiàn)出類似情況。

實際采集到的13C NMR 譜中分別有11 和16 個碳峰信號，數(shù)量也均接近樣品383 和樣品170 化學結(jié)構(gòu)中實際碳原子個數(shù)的2 倍。

基于以上分析，判斷2 個待測樣在D2O 溶液中并非以單一化合物形式存在，和D-葡萄糖一樣在溶液中發(fā)生變旋［22］，轉(zhuǎn)化為α，β 兩種構(gòu)型的端基異構(gòu)體。而兩種構(gòu)型的存在加劇了氫譜信號重疊。

2.2 1D TOCSY 對溶液態(tài)構(gòu)型混合物質(zhì)子信號的分離與指認

選擇性1D TOCSY 技術(shù)能夠有效提取與激發(fā)核在同一耦合體系中、但相隔共價鍵數(shù)遞增(由近及遠)的不同位置質(zhì)子信息，是簡化分解常規(guī)氫譜的有效方法。異頭質(zhì)子處于糖環(huán)自旋耦合體系的起始位置，由于直接與2 個氧原子相連，其化學位移一般處于糖環(huán)區(qū)相對低場(δH5.5 ～4.5)，譜峰獨立，特征性鮮明，可選擇作為該方法提取同一糖環(huán)自旋體系其他質(zhì)子位移信息的切入點。

圖1 樣品1H NMR 譜(D2O)

2.2.1 樣品383 的質(zhì)子信號指認

基于存在2 種構(gòu)型化合物的假設(shè)分析，待測樣383 氫譜低場的2 組質(zhì)子信號δH5.39 (d，J = 3.5 Hz)和δH4.89 (d，J = 8.5 Hz)均符合異頭質(zhì)子信號的特征。質(zhì)子δH5.39 耦合常數(shù)較小(3.5 Hz)，應(yīng)與相連的2 位質(zhì)子成ae 或ee 鍵關(guān)系，即兩質(zhì)子在糖環(huán)同側(cè)，因此其所屬化合物應(yīng)為α 構(gòu)型;而質(zhì)子δH4. 89(d，8.5 Hz)與相鄰的2'位質(zhì)子都處于a 鍵，兩質(zhì)子分別指向糖環(huán)上下個方向，所屬化合物定為β 構(gòu)型［20］。由積分值估計2 種構(gòu)型化合物的含量比約為62∶38，與D-葡萄糖在水溶液中α，β 構(gòu)型的比例37∶63 正好相反。

以δH5.39 (d，H1)為1D TOCSY 譜的激發(fā)中心，逐漸增大混合時間，屬于同一化合物383-α 糖環(huán)其他質(zhì)子峰依次“接力”出現(xiàn)(圖2 (a-1)自上而下):δH3.24 (dd，H2)，δH3. 83 (dd，H3)，δH3. 43 (dd，H4)。由于與H3 重疊，無法按信號提取的先后次序定義信號δH3.83，δH3.73 和δH3.79 代表的質(zhì)子位置，但HSQC 實 驗 數(shù) 據(jù) 顯 示δH3. 83 分 別 與δC69. 69 和δC71.56相關(guān)，表明δH3.83 確實為2 個不同質(zhì)子信號的重疊;另外δH3.73 和δH3.79 為同碳質(zhì)子峰，從而確定以下歸屬:δH3.83 (m，H5)，δH3.73 (dd，H6a)和δH3.79 (dd，H6b)。

以δH4. 89 (d，H1’)為激發(fā)中心，在系列1D TOCSY 譜(圖2(a-2))中剩余6 組積分值接近0.6 的質(zhì)子峰依次“接力”出現(xiàn):δH2.95 (dd)、δH3.64 (dd)、δH3.42 (dt)、δH3.45 (dt)，可依次歸屬為另一構(gòu)型化合物383-β 上與H1'相隔共價鍵數(shù)遞增的2'位、3'位、4'位、5'位質(zhì)子;最后同步出現(xiàn)的1D TOCSY 相關(guān)信號是δH3.85 (dd)與和δH3.69 (dd)，結(jié)合HSQC 結(jié)果定為6'位亞甲基的2 個同碳質(zhì)子峰。

圖2 樣品的1D TOCSY 圖組(D2O)

2.2.2 樣品170 的質(zhì)子信號指認

樣品170 氫譜中δH5. 13 (d，J = 3. 5 Hz)和δH4.64 (d，J = 8.5 Hz)符合異頭質(zhì)子信號的特征。結(jié)合耦合常數(shù)同樣可判斷，質(zhì)子δH5.13 所屬化合物為1，2 位ae 或ee 鍵關(guān)系的α 構(gòu)型，δH4.64 所屬化合物則為1，2 位aa 鍵關(guān)系的β 構(gòu)型。由2 組信號的積分值估計這2 種構(gòu)型化合物的含量比約為55∶45，與上述D-氨基葡萄糖相比，雖然還是α 構(gòu)型的較多，但兩種構(gòu)型的比例更為接近。

1D TOCSY 系列譜中，以δH5.13 (d，H1)為激發(fā)中心(圖2(b-1))，按構(gòu)型化合物170-α 的糖環(huán)上其他質(zhì)子產(chǎn)生的先后順序歸屬出:δH3. 80 (dd，H2)，δH3.69 (t，H3)，δH3.42 (dd，H4)，δH3.78 (m，H5)，δH3.71 (dd，H6a)和δH3.78 (m，H6b);以δH4. 64(d，H1')為激發(fā)中心(圖2(b-2))，構(gòu)型化合物170-β的糖環(huán)其他質(zhì)子位移依次為:δH3. 60 (dd，H2')，δH3.46 (dd，H3')，δH3. 39 (m，H4')，δH3. 39 (m，H5')，δH3.67 (dd，H6a')和δH3.84 (dd，H6b')。其中在1D TOCSY 系列激發(fā)實驗中，δH3.78 和δH3.39 處信號產(chǎn)生時，均是隨混合時間的增加峰強度連續(xù)明顯增強。依據(jù)2 個異頭質(zhì)子積分值之比約為1.0∶0.8，分析氫譜δH3.90 ～3.75、δH3.75 ～3.65、δH3.50 ～3.35三段信號的分組積分值，基本可判斷位移δH3.78 和δH3.39 處均分別重疊了2 個質(zhì)子，即H5 和H6、H4'和H5'的質(zhì)子峰分別存在重疊。后期HSQC 數(shù)據(jù)顯示，δH3.78 與δC60.59、δC71.56，δH3.39 與δC69.84、δC75.95均同時存在相關(guān)，從而進一步驗證了以上結(jié)論。

2.3 NMR 結(jié)構(gòu)解析和驗證

在利用系列1D TOCSY 基本完成了質(zhì)子信息全指認的基礎(chǔ)上，結(jié)合DEPT135、HSQC 實驗數(shù)據(jù)，待測樣383 和170 的13C NMR 譜的所有連氫碳的位移信息也均一一得到有效指認(見表1)。HMBC 實驗結(jié)果顯示2 個樣品共4 種構(gòu)型異構(gòu)體的1 位和5 位之間均存在遠程氫、碳耦合關(guān)系，證明化合物確實成糖環(huán)結(jié)構(gòu);同時其他HMBC 數(shù)據(jù)也驗證了TOCSY 技術(shù)指認糖環(huán)區(qū)氫位移順序的正確性。另樣品170 的碳譜信息顯示其2 個構(gòu)型化合物結(jié)構(gòu)中分別還含有一個羰基和一個甲基片段，但HMBC 數(shù)據(jù)表明季碳δC174.51 與質(zhì)子峰δH4.642 (2 位)、δH1.979 (s，3)，δC174.75 與質(zhì)子峰δH4.642(2'位)、δH1.977 (s，3)分別存在遠程相關(guān)信息，從而170 中各個構(gòu)型化合物在2 位氨基上連接的乙?；蔚奶細湮灰菩畔⒌靡源_定。

表1 樣品383(D-氨基葡萄糖鹽酸鹽)和170(N-乙酰-D-氨基葡萄糖)的相關(guān)核磁信息指認(D2O)

此外，借助系列選擇性1D TOCSY 實驗對常規(guī)氫譜做“分解”后，各組質(zhì)子信號的精細裂分也得以識別。測得2 個樣品共4 種構(gòu)型異構(gòu)體的2 位-5 位質(zhì)子的耦合常數(shù)值基本為8 ～11 Hz，表明4 個化合物2 位/3 位，3 位/4 位，4 位/5 位質(zhì)子均處于直立鍵(a 鍵)的位置，為aa 耦合;這也說明2 和4 位質(zhì)子同在糖環(huán)一側(cè)，3 和5 位質(zhì)子同在糖環(huán)另一側(cè)。另外可以根據(jù)1，2位質(zhì)子間耦合常數(shù)推斷170，383 中兩中異構(gòu)體的構(gòu)型:當異構(gòu)體中1，2 位質(zhì)子間耦合常數(shù)較小(3.5 Hz)時屬ae 鍵或ee 鍵耦合，而2 位質(zhì)子處于直立鍵(a鍵)，所以可確定1 位質(zhì)子處于平伏鍵(e 鍵)的位置，該異構(gòu)體為α-構(gòu)型;當異構(gòu)體中1，2 位質(zhì)子間耦合常數(shù)較大(8.5 Hz)時屬aa 鍵耦合，兩質(zhì)子均處于直立鍵(a 鍵)的位置，因此該異構(gòu)體為β-構(gòu)型。

綜合以上核磁數(shù)據(jù)解析，可確定待測樣383 和170 分別是D-氨基葡萄糖鹽酸鹽和N-乙酰-D-氨基葡萄糖，溶解于重水后分別轉(zhuǎn)化為1/2 位氫分別處于a鍵/e 鍵和a 鍵/a 鍵2 種形式的化合物，即產(chǎn)生α 和β兩種構(gòu)型化合物(見圖3)。2 個樣品共4 種構(gòu)型異構(gòu)體的核磁結(jié)構(gòu)信息均得以完整指認。

圖3 樣品383 和170 構(gòu)型異構(gòu)體的化學結(jié)構(gòu)

3 結(jié) 語

本文利用1D TOCSY 技術(shù)，通過優(yōu)化整形脈沖的混合時間，使得與異頭質(zhì)子在同一糖環(huán)自旋體系、相隔共價鍵數(shù)遞增的質(zhì)子，其信號依次“接力”出現(xiàn)。獲得的選擇性1D TOCSY 系列譜，相當于對復(fù)雜重疊的常規(guī)氫譜進行了有效分解，并且“分解譜”中大多數(shù)信號均能清晰呈現(xiàn)出原本的精細峰型結(jié)構(gòu)，為核磁解析提供了更明確和豐富的幫助信息，使得D-氨基葡萄糖鹽酸鹽和N-乙酰-D-氨基葡萄糖在水溶液中的兩種構(gòu)型結(jié)構(gòu)得以完全確認，大大簡化了對不同構(gòu)型化合物質(zhì)子信號分組歸屬和核磁信息全指認的流程。該思路對于核磁共振在快速解析碳水化合物中多糖環(huán)、在溶液中會發(fā)生變旋的糖類混合物等結(jié)構(gòu)，能夠提供一定的參考。

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