甘油、乙二醇對(duì)山羊精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

黃亞娟劉文娟邸俊龍

1.陜西省涇陽縣涇干鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站，陜西涇陽 713700；2.陜西省榆林市靖邊縣鎮(zhèn)靖鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站，陜西靖邊 718500；2.西安市閻良區(qū)關(guān)山鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，西安 710089

甘油、乙二醇對(duì)山羊精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

黃亞娟1劉文娟2邸俊龍3

1.陜西省涇陽縣涇干鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站，陜西涇陽 713700；2.陜西省榆林市靖邊縣鎮(zhèn)靖鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站，陜西靖邊 718500；
2.西安市閻良區(qū)關(guān)山鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，西安 710089

根據(jù)布爾山羊冷凍精液質(zhì)量監(jiān)測(cè)結(jié)果，目前國(guó)內(nèi)山羊冷凍精液解凍后的活力達(dá)30%以上。情期受胎率達(dá)60%左右，遼寧原種場(chǎng)在此基礎(chǔ)上于2004年開始對(duì)遼寧絨山羊細(xì)管冷凍精液的稀釋液、精液處理，冷凍工藝解凍方法及受胎率結(jié)果等作了比較系統(tǒng)的研究，取得了較好的結(jié)果。本試驗(yàn)通過對(duì)最佳基礎(chǔ)液的篩遠(yuǎn)，最佳保護(hù)劑種類及含量的篩選，分別用含甘油、乙二醇的最佳冷凍稀釋液對(duì)山羊的精液進(jìn)行處理，根據(jù)冷凍和解凍的結(jié)果，對(duì)精子活率、畸形率，頂體完整率進(jìn)行研究。

甘油；乙二醇；情期受胎率；精子活率

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

體格健壯、健康無傳染病且性欲旺盛的種公羊，精液要求呈現(xiàn)乳白色成略帶黃色云霧狀明顯，pH在6.8±0.2范圍內(nèi)，目測(cè)活率在0.7以上，種公羊均身體健康，精神狀態(tài)良好。

供選擇的稀釋液配方如下：

Ⅰ基礎(chǔ)液：葡萄糖8 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅱ基礎(chǔ)液：葡萄糖3 g、檸檬酸鈉3 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅲ基礎(chǔ)液：三羥甲基氨基甲烷4.34 g、葡萄糖0.70 g、蔗糖1.60 g、檸檬酸鈉1.972 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅳ基礎(chǔ)液：乳糖4.6 g、葡萄糖3.1 g、檸檬酸鈉1.5 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.35 mL乙二醇；（3）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.47 mL甘油；（4）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.47 mL乙二醇。

Ⅴ基礎(chǔ)液：乳糖5 g、葡萄糖3 g、檸檬酸鈉1.5 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅵ基礎(chǔ)液：乳糖6 g、檸檬酸鈉1.5 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅶ基礎(chǔ)液：乳糖3.8 g、葡萄糖2.6 g、檸檬酸鈉1.3 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅷ基礎(chǔ)液：葡萄糖1.15 g、檸檬糖2.6 g、檸檬酸1.0 g、二羥甲基氨基甲烷1.84 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎(chǔ)液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

VⅢ基礎(chǔ)液：葡萄糖0.96 g、檸檬酸鈉1.36 g、二羥甲基氨基甲烷2.42 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：基礎(chǔ)液8.0 mL+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：基礎(chǔ)液8.0 mL+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

以上每種基礎(chǔ)液消毒滅菌后放涼，再按每毫升各加青霉素、鏈霉素1 250 IU混勻即可保存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用合格新鮮精液，按以上20個(gè)稀釋液分別進(jìn)行處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，根據(jù)冷凍解凍后的活率選出最佳稀釋液的基礎(chǔ)液，將選出的基礎(chǔ)液按表1濃度添加保護(hù)劑，配成稀釋液，用此稀釋液再進(jìn)行冷凍處理，每個(gè)處理重復(fù)6次，再以解凍后精子的活率、畸形率，頂體完整率，得出分析結(jié)果（表2）。

表1 保護(hù)劑的添加量

表2 基礎(chǔ)液的篩選結(jié)果

1.3 試驗(yàn)過程

1）將所需用品嚴(yán)格消毒后，將鏡檢合格的新鮮精液按1∶3體積比稀釋后，裝管置于0～4℃環(huán)境中平衡2 h。

2）平衡后，將細(xì)管精液置于液氮中冷凍5～10 min。

3）解凍鏡檢：將冷凍后的精液置于38℃水浴中解凍后，制切片，觀察活率。

4）標(biāo)記分裝，保存，對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，選出最佳基礎(chǔ)液。

5）用最佳基礎(chǔ)液按表1配成稀釋液，重復(fù)以上操作分別選出甘油、乙二醇的最佳稀釋液A、B。

6）用A、B 2個(gè)稀釋液作冷凍精液處理，制作抹片，進(jìn)行活率、畸形率，頂體完整率的觀察。

7）對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出結(jié)論。

2 結(jié) 果

2）IV基礎(chǔ)液中添加不同濃度甘油對(duì)精子成活率的影響結(jié)果（=6）。由活率為依據(jù)進(jìn)行選擇，添加4.7%的甘油的效果明顯好于其他濃度，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，添加4.7%的甘油組與總體樣本比較，差異顯著（＜0.05），故可以選擇甘油的最佳濃度為0.47（表3）。

表3 不同濃度甘油對(duì)精子成活率的影響結(jié)果

表4 不同濃度乙二醇對(duì)精子成活率的影響結(jié)果

4）用A（含4.7%甘油）、B（含4.7%乙二醇）、C（新鮮精液）3個(gè)處理組對(duì)精子畸形率的影響（n=6）。甘油處理組的畸形率顯著高于對(duì)照組和乙二醇處理組（＜0.01）；乙二醇的處理組的畸形率顯著高于對(duì)照組（＜0.01）（表5）。

表5 不同處理組對(duì)精子畸形率的影響結(jié)果

表6 不同處理組對(duì)精子頂體完整率的影響結(jié)果

3 討 論

冷凍精液人工授精技術(shù)應(yīng)用到生產(chǎn)中以來，只是在牛的生產(chǎn)上應(yīng)用比較多。由于冷凍精液的活率、畸形率、頂體異常率等各方面因素的影響，使得受胎率于自然交配相比較低，從而使此技術(shù)在山羊生產(chǎn)上未得到大面積推廣。因此保護(hù)劑添加的種類和濃度，是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。精子在冷凍過程中，水分子重新按幾何圖形排列形成冰晶，冰晶可以使精子膜內(nèi)的濃度和滲透壓增高，水由精子內(nèi)向外滲透，造成精子細(xì)胞脫水，發(fā)生不可逆的化學(xué)毒害而死亡。同時(shí)，精子水分形成冰晶，其體積增大且形狀不規(guī)則，由于冰晶的擴(kuò)展和移動(dòng)，造成精子膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的機(jī)械損傷，引起精子死亡，所以，在冷凍過程中要盡量避開形成冰晶最多的溫度范圍（-15～25℃），在冷凍過程中就要以最快的速度降溫通過發(fā)生冰晶化的溫度范圍，形成玻璃化?？焖俳禍貢r(shí)應(yīng)添加一定量的甘油、乙二醇、二甲亞砜等抗凍保護(hù)物質(zhì)，以增加精子的抗凍能力，防止發(fā)生冰晶化。

保護(hù)劑中，甘油具有較強(qiáng)的吸水性，抑制水分子形成冰晶，使水處于過冷狀態(tài)，降低水形成冰晶的溫度，縮小危險(xiǎn)溫度區(qū)。研究表明，甘油濃度過高對(duì)精子有毒害作用，可能造成其頂體和頸部損傷，尾巴彎曲及某些酶類破壞，降低其受精能力。乙二醇具有較強(qiáng)的親水性能，能有效保護(hù)精子免受冰晶傷害，而且其濃度過高對(duì)于精子的毒害作用遠(yuǎn)小于甘油。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度的保護(hù)劑作用下（0.30～0.35 mL范圍內(nèi)/10 mL冷凍稀釋液中），甘油的保護(hù)作用與乙二醇的保護(hù)作用相比，差異不顯著，也就是二者并沒有本質(zhì)的區(qū)別，保護(hù)劑體積增加到0.35 mL以上時(shí)，乙二醇的保護(hù)作用明顯強(qiáng)于甘油，當(dāng)保護(hù)劑體積達(dá)到0.5 mL時(shí)，二者的保護(hù)作用都呈于下降趨勢(shì)，在這個(gè)過程中，精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了一系列的變化，本試驗(yàn)設(shè)置了2個(gè)處理組和1個(gè)對(duì)照組，即用所選擇的最佳基礎(chǔ)液，分別加入最適濃度的甘油和乙二醇后，制作抹片，在油鏡下統(tǒng)計(jì)出了各自的畸形率、頂體完整率，再以新鮮精液制成抹片作為對(duì)照組來進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是甘油，還是乙二醇處理組，都與對(duì)照組差異顯著，也就是說，在添加保護(hù)劑的過程中，精子的活率、畸形率、頂體完整率都不可避免地受到了很大的影響，甘油與乙二醇的處理組相比，甘油處理組的效果無論從活率、畸形率還是頂體完整率上分析，都不如乙二醇處理組好。

另外，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)的整個(gè)研究過程中，還存在一些不可知因素的影響，還存在一些尚未解決的問題，如在研究過程中，基礎(chǔ)液、稀釋液的原始配方都選取的一些實(shí)際生產(chǎn)中常用的一些配方，這些配方添加保護(hù)劑的濃度都是從3%開始，5%結(jié)束，那么3%以下的添加濃度，按照理論知識(shí)，甘油應(yīng)明顯強(qiáng)于乙二醇5%以上的添加濃度，乙二醇應(yīng)明顯強(qiáng)于甘油，但試驗(yàn)研究的添加濃度具有局限性，因而出現(xiàn)了一些不一致的地方，有待于進(jìn)一步的探討。就整個(gè)冷凍過程中，氣溫、光線、冷凍時(shí)間的微小差異，都有可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)微小的偏差。在解凍過程中，水溫的高低、解凍時(shí)間的長(zhǎng)短以及解凍技術(shù)的熟練程度，也都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。本試驗(yàn)在基礎(chǔ)液中添加的營(yíng)養(yǎng)劑為蛋黃，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)上的經(jīng)驗(yàn)，添加等量鮮奶的效果優(yōu)于蛋黃，以上是整個(gè)試驗(yàn)中存在的一些問題。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，稀釋液中添加4.7%的甘油和乙二醇時(shí)，對(duì)精子形態(tài)結(jié)構(gòu)以及活率都有顯著的影響，在選定的最佳稀釋液中，甘油的保護(hù)作用不及乙二醇，添加甘油對(duì)精子的活率、畸形率、頂體完整率的損害程度要強(qiáng)于乙二醇。在實(shí)際的生產(chǎn)中，建議盡可能用乙二醇作為保護(hù)劑。

[1]張忠誠(chéng).家畜繁殖學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[2]中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社主編.家畜繁殖學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1980.

[3]張世偉，宋先忱，朱延旭，等.遼寧絨山羊細(xì)管冷凍精液研究[J].中國(guó)畜牧雜志，2006（3）：23-25.

[4]董時(shí)富.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].北京：科學(xué)教育出版社，2000.

[5]明道緒.生物統(tǒng)計(jì)附實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[6]張一玲.家畜繁殖學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1991.

2015-08-16

黃亞娟，女，1984年生，碩士。