啟動子和PolyA序列對水牛乳腺特異性表達載體表達效率的影響

羅嬋，任艷萍，屈春鳳，李海洋，李湘萍，石德順

（廣西大學動物繁殖研究所，亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530004）

啟動子和PolyA序列對水牛乳腺特異性表達載體表達效率的影響

羅嬋，任艷萍，屈春鳳，李海洋，李湘萍，石德順*

（廣西大學動物繁殖研究所，亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530004）

為了獲得能有效表達促乳素的乳腺特異性表達載體，本研究系統(tǒng)比較了不同長度的啟動子和有/無PolyA序列對乳腺特異性表達載體表達標記基因綠色熒光蛋白（GFP）和目的基因促乳素（PRL）的影響。將不同載體瞬時轉染Bcap37細胞后，分別用實時定量PCR和流式細胞儀檢測PRL和GFP的表達水平。結果表明：長度為5.2 kb的β-酪蛋白（Beta casein，BCN）啟動子啟動PRL的表達量顯著高于長度為3.8 kb啟動子，前者的表達量約為后者的6倍；在BCN啟動子長度均為5.2 kb情況下，添加PolyA的載體p5.2BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP-Neo組PRL的相對表達量為8.17，p5.2BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP組PRL的相對表達量為17.84，均顯著高于p5.2BCNPRL-CMV-GFP-Neo組，可見添加PolyA后，PRL的表達量均顯著增加；進一步比較發(fā)現(xiàn)，含PolyA的載體中GFP的表達水平也顯著高于不含PolyA的載體。對比以上結果發(fā)現(xiàn)，添加PolyA能夠有效解除啟動子之間的轉錄干擾，使標記基因的啟動子CMV和目的基因的啟動子BCN均能順利啟動基因表達。經過優(yōu)化的載體啟動目的基因PRL表達的效率更高，可應用于下一步的研究工作中。

啟動子；PolyA序列；促乳素；綠色熒光蛋白；基因表達；水牛

水牛奶具有獨特的醇香味，其乳脂率和蛋白質含量都比黃牛奶高，在市場上供不應求。因此，如何提高水牛產奶量成為亟待解決的重要問題。催乳素（prolactin，PRL）是腦垂體分泌的激素之一，參與啟動和維持泌乳，對乳蛋白、乳糖和乳脂的合成起主要的調控作用［1-2］。因此，利用分子育種技術，構建PRL乳腺特異性表達載體，用于轉基因水牛的生產，理論上可以增加水牛的產奶量。

構成表達載體的調控元件不同，其啟動基因表達的效率差異顯著。首先，啟動子的調控序列對外源基因的表達效率和組織定位起重要作用。β-酪蛋白（Beta casein，BCN）是動物乳汁中的主要蛋白，因此，其啟動子區(qū)域常被選為乳腺特異性表達載體的啟動子?，F(xiàn)有研究表明，BCN啟動子長度不同，驅動目的基因表達的效率也相應發(fā)生顯著變化［3］。其次，在原核細胞中，同一載體的含多個啟動子時，不同啟動子間存在競爭機制，從而發(fā)生轉錄干擾［4-5］。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，在真核細胞中也存在轉錄干擾現(xiàn)象。已有研究表明，在2個啟動子之間增加ployA序列可顯著減弱轉錄干擾［4］。因此，本研究擬探討含不同調控元件的水牛乳腺特異表達載體表達標記基因GFP和目的基因PRL的效率，篩選有效表達PRL的載體，為后期生產轉基因水牛提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料Bcap37細胞購自上海生化細胞所；本研究所用的載體由任艷萍同學構建、保存。

質粒純化試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性內切酶、Real time PCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM）為大連寶生物工程有限公司產品；EasyScript Firs-strand cDNA synthesis supermix試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；細胞培養(yǎng)液基礎液為Gibco RPMI 1640；脂質體為Invitrogen公司的Lipofectamine LTX；其他試劑為Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 載體的轉化、提取和鑒定將本實驗室保存的載體質粒分別進行轉化、提取和鑒定。質粒的轉化參照《分子克隆實驗指南》操作，將1 μg質粒加入到50 μL感受態(tài)細胞中，孵育、熱激后接種到含氨芐的LB固體培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)12～16 h，挑取單個克隆菌落到含Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床過夜培養(yǎng)。次日挑取陽性單菌落，接種于20 mL氨芐抗性LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)12 h后收集細菌，參照天根質粒提取試劑盒的說明書提取質粒。將提取好的質粒電泳進行初步鑒定，隨后分別用限制性內切酶Sac I、Kpn I、Bam HI進行酶切鑒定。

1.2.2 細胞的瞬時轉染參照Lipofectamine LTX使用說明書，提前1 d將細胞接種到6孔板，調整細胞密度至5×105/孔。轉染當天，細胞密度約為70%～80%。去除孔內的培養(yǎng)基，用無血清DMEM培養(yǎng)基漂洗后加入2 mL Opti-MEM培養(yǎng)基。在1.5 mL EP管中準備溶液A和溶液B，A液是2 μg質粒用250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，充分混勻后室溫靜置5 min，B液為250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中加入5 μL脂質體Lipofectamine LTX，輕輕混勻，室溫靜置5 min。然后將A、B液混合，室溫靜置30 min后均勻加入6孔板，輕輕搖晃使混合物與細胞均勻接觸，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后觀察轉染效率。

1.2.3 標記基因綠色熒光蛋白的表達檢測Bcap37細胞轉染48 h后，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌1次，加入0.25%Trysin消化細胞，1 200 r/min速離心3 min收集細胞，離心后去上清液，用PBS洗滌3次。最后用PBS重懸細胞樣品，采用流式細胞儀檢測表達GFP的細胞數(shù)，流式細胞儀的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。試驗以未轉染的Bcap37細胞為陰性對照。用BD Accuri C6軟件分析結果，試驗重復3次。

1.2.4 PRL基因mRNA表達豐度的檢測轉染48 h后提取細胞RNA，反轉錄后Q-PCR檢測各個載體PRL基因的mRNA表達豐度。試驗以未轉染的Bcap37細胞和水為陰性對照。

RNA的提?。杭毎氖占c1.2.3所述相同。采用Trizol法提取細胞的總RNA，步驟簡述如下：細胞離心后去除上清液，每個樣品內加入1 mL Trizol，冰上放置5 min，讓細胞充分裂解；然后加0.2 mL氯仿，用力震蕩15 s，冰上放置5 min后，12 000 r/min（2～8℃）離心15 min；取上層水相置于新EP管中，加入0.5 mL異丙醇，冰上放置5 min后，12 000 r/min（2～8℃）離心15 min；棄上清，用1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，7 500 r/min（2～8℃）離心5 min，棄上清；讓沉淀的RNA在室溫自然干燥；最后，用無RNA酶的水溶解RNA沉淀。

參照試劑盒使用說明書合成cDNA第1鏈。以反轉錄產物為模板，以β-actin為內參基因，進行Q-PCR檢測PRL基因的相對表達量。PRL基因、β-actin基因引物如表1所示。Q-PCR反應體系：cDNA 1μL，10 μmol/L正、反向引物0.6 μL，PCR預混反應液10 μL，參照染料Rox 0.4 μL，加純水至20 μL反應體系。試驗重復3次。

表1 PRL和β-actin引物

1.2.5 統(tǒng)計分析使用公式2-△△Ct計算PRL基因的相對表達量［6］。差異的顯著性采用軟件SPSS 17.0的單因素方差分析進行統(tǒng)計，當P＜0.05時，統(tǒng)計學上為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 載體結構的鑒定對4個含不同調控元件的質粒（p5.2BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP-Neo，p3.8BCNPRL-PolyA-CMV-GFP，p5.2BCN-PRL-PolyA-CMVGFP，p5.2BCN-PRL-CMV-GFP-Neo；載體結構見圖1）分別進行酶切鑒定，用Kpn I和BamH I對質粒進行雙酶切可獲得大小約800 bp的PRL基因片段，用Kpn I和Sac I對質粒進行雙酶切可獲得大小約1 100 bp的BCN polyA片段（圖2）。結果表明各質粒的結構、大小與預期相符，證明在保存、轉化過程中并未發(fā)生突變，可用于下一步實驗。

2.2 啟動子長度對PRL基因表達效率的影響將拷貝數(shù)相同的質粒p5.2BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP和p3.8BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP分別轉染Bcap37細胞，檢測5.2 kb和3.8 kb 2種長度的牛β-酪蛋白啟動子啟動PRL表達的效率。轉染48 h后提取細胞總RNA進行反轉錄，進行Q-PCR反應。Q-PCR反應各產物特異性強，熔解溫度均一，熔解曲線為尖銳的單一峰（圖3）。以瞬時轉染p3.8BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP的細胞樣品中PRL基因的表達為參照，設定其表達量為1，β-actin為內參基因，用2-△△Ct法統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結果顯示，p5.2BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP組PRL的相對表達量為6.04，顯著高于p3.8BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP組（圖4），說明啟動子的長度與其啟動目的基因的效率密切相關。

圖1 表達載體的線性化結構示意圖

圖2 表達載體結構的酶切鑒定

圖3 目的基因和內參基因的熔解曲線

圖4 含不同長度啟動子的載體瞬時轉染后PRL的相對表達水平

2.3 PolyA序列對其上、下游基因表達效率的影響將相同拷貝數(shù)的質粒p5.2BCN-PRL-CMV-GFP-Neo、p5.2BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP-Neo和p5.2BCNPRL-PolyA-CMV-GFP分別轉染Bcap37細胞，檢測PolyA序列對其上游基因PRL、下游基因GFP表達效率的影響。轉染24 h后觀察發(fā)現(xiàn)，添加PolyA序列的2個載體轉染Bcap37細胞后GFP陽性細胞數(shù)明顯多于無PolyA序列組（圖5）。轉染48 h后收集細胞，采用流式細胞儀檢測表達GFP的細胞數(shù)，結果與轉染24 h后觀察到的現(xiàn)象吻合（圖6A、B）。以瞬轉p5.2BCNPRL-CMV-GFP-Neo的細胞樣品中PRL基因的表達為參照，設定其表達量為1，β-actin為內參基因，用2-△△Ct法統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結果顯示，p5.2BCN-PRL-PolyACMV-GFP-Neo組PRL的相對表達量為8.17，p5.2BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP組PRL的相對表達量為17.84，均顯著高于p5.2BCN-PRL-CMV-GFPNeo組，可見添加polyA后，PRL的表達量均顯著增加（圖7）。進一步比較以上結果發(fā)現(xiàn)，添加polyA后，其上下游基因的表達水平均升高，說明不同啟動子的轉錄干擾被解除；經過優(yōu)化后的載體PRL表達水平較高，可用于下一步研究工作。此外，p5.2BCN-PRLPolyA-CMV-GFP組GFP、PRL的相對表達量也顯著高于p5.2BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP-Neo組（圖6、7），可能是由于后者增加的篩選基因Neo（新霉素抗性基因）對GFP、PRL的表達也存在轉錄干擾，具體原因仍有待進一步探究。

圖5 PolyA序列對GFP表達水平的影響

圖6 轉染48 h后Bcap37細胞中GFP的表達情況

圖7 PolyA序列對PRL相對表達水平的影響

3 討論

目前，國內、外的研究團隊通過轉基因克隆技術先后獲得了一批轉基因的豬［7-8］、牛［3，9］、羊［10］新品種，轉基因克隆技術已成為動物育種的新方法。上述轉基因動物能夠通過乳腺分泌人類醫(yī)療需要的藥用蛋白，在實際生產和應用中具有極大的潛能。本研究的最終目的是充分利用PRL調控泌乳的生物學功能，構建PRL乳腺特異性表達載體，通過體細胞核移植或受精卵注射的方法生產高產奶量的轉基因水牛。雖然PRL具有促進乳腺發(fā)育、啟動與維持泌乳的功能，但過量的表達PRL會增加乳腺癌的發(fā)病率［11］。因此，本研究試探討不同的載體構造元件下，PRL基因在細胞中的表達變化規(guī)律，篩選適度表達PRL的載體用于轉基因水牛的生產。

乳腺特異表達載體，是指在乳腺特異性調控元件的調控下，能啟動外源基因在泌乳期的乳腺細胞中表達的一種載體。乳腺特異表達載體能實現(xiàn)時空性表達的關鍵是啟動子，它一般由乳腺特異分泌的乳蛋白啟動子承擔。牛乳汁中含量最高的蛋白是酪蛋白，主要包括αs1-酪蛋白（αs1-Casein）、β-酪蛋白（β-Casein，BCN）、κ-酪蛋白（κ-Casein）、αs2-酪蛋白（αs2-Casein）。本研究中，選用乳汁中表達豐度最高的BCN啟動子構建乳腺表達載體。成功的表達載體必須包含足夠的應答元件。理論上，包含的元件越多，啟動子的特異性或者啟動的效率越高。本研究對不同長度的BCN啟動子啟動PRL的效率進行探討,結果發(fā)現(xiàn)5.2 kb BCN啟動子的效率顯著高于3.8 kb啟動子，與Brophy等［3］的報道一致。Narus等［12］比較了1.8 kb與3.1 kb的牛β-酪蛋白啟動子的啟動效率，則發(fā)現(xiàn)2個啟動子在效率上差異不顯著，但1.8 Kb的啟動子存在乳腺組織以外其他組織中的泄露性表達。由此推測，5.2 kb BCN已經包含了特異性調控下游基因高水平表達的各類調控元件，更適合作為乳腺特異表達載體的啟動子。

轉錄干擾是指一個基因在其轉錄的過程中，直接或者順式的抑制另一個基因轉錄［13］。目前研究發(fā)現(xiàn)，轉錄干擾現(xiàn)象也存在于由2個表達元件構成的轉基因載體中，其啟動外源基因表達的效率顯著低于僅含有一個表達元件的載體。前期研究工作中，對所構建載體的真核表達效率進行檢測，發(fā)現(xiàn)由CMV啟動子驅動的標記基因能順利表達，而乳腺特異啟動子BCN驅動的目的基因卻不表達，推測是由于轉錄干擾導致的。PolyA序列是具有轉錄終止作用和使轉錄的mRNA加尾的DNA序列，常在載體構建中用作加尾信號。本研究中，擬利用PolyA序列具有轉錄終止的作用，探討在2個表達元件之間添加PolyA序列能否消除轉錄干擾現(xiàn)象。結果顯示，添加polyA后，其上游基因EGFP和下游基因PRL的表達水平均顯著升高，說明不同啟動子的轉錄干擾被解除，與Callen等［4］的研究結果一致。Greger等［14］研究認為，插入PolyA序列可以顯著降低上游基因對下游基因表達的抑制作用，但無法徹底消除這種干擾現(xiàn)象［15］。本研究中，載體的轉錄干擾現(xiàn)象是否得到徹底消除仍有待進一步研究；但經過優(yōu)化后的載體PRL表達水平得到顯著提高，已可用于下一步的研究工作中。

綜上所述，目的基因的表達水平與啟動子長度密切相關，長度為5.2 kb的BCN啟動子比3.8 kb啟動子更適合用于乳腺特異表達載體的構建；在2個表達元件間添加polyA序列可以有效解除轉錄干擾；經過優(yōu)化的載體可用于后續(xù)工作。本研究為獲得高產奶量的轉基因水牛新品種奠定了工作基礎。

參考文獻:

［1］Lacasse P,Lollivier V,Dessauge F，et al.New developments on the galactopoietic role of prolactin in dairy ruminants［J］.Domest Anim Endocrinol,2012,43（2）:154-160.

［2］Kelly P A,Bachelot A,Kedzia C，et al.The role of prolactin and growth hormone in mammary gland developmen t［J］.Mol Cell Endocrinol,2002,197（1-2）:127-131.

［3］Brophy B,Smolenski G,Wheeler T，et al.Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of beta-casein and kappa-casein［J］.Nat Biotechnol,2003,21（2）:157-162.

［4］Callen B P,Shearwin K E,Egan J B.Transcriptional interference between convergent promoters caused by elongation over the promoter［J］.Mol Cell,2004,14（5）:647-656.

［5］Rollins R A,Korom M,Aulner N，et al.Drosophila nipped-B protein supports sister chromatid cohesion and opposes the stromalin/Scc3 cohesion factor to facilitate long-range activation of the cut gene［J］.Mol Cell Biol,2004,24（8）:3100-3111.

［6］Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method［J］.Methods,2001,25（4）:402-408.

［7］Cho S K,Hwang K C,Choi Y J，et al.Production of transgenic pigs harboring the human erythropoietin（hEPO）gene using somatic cell nuclear transfer［J］.J Reprod Dev,2009,55（2）:128-136.

［8］Zhang P,Zhang Y,Dou H，et al,Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene［J］.Cell Reprogram, 2012,14（3）:258-266.

［9］Monzani P S,Sangalli J R,De Bem T H，et al.,Breeding of transgenic cattle for human coagulation factor IX by a combination of lentiviral system and cloning［J］.Genet Mol Res, 2013,12（3）:3675-3688.

［10］Zhang P,Liu P,Dou H，et al.Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 Fatty acids［J］.PLoS One,2013,8（2）: e55941.

［11］Wennbo H,Kindblom J,Isaksson O G，et al.Transgenic mice overexpressing the prolactin gene develop dramatic enlargement of the prostate gland［J］.Endocrinology,1997,138（10）:4410-4415.

［12］Naruse K,Yoo S K,Kim S M，et al.Analysis of tissue-specific expression of human type II collagen cDNA driven by different sizes of the upstream region of the beta-casein promoter［J］. Biosci Biotechnol Biochem,2006,70（1）:93-98.

［13］Proudfoot N J.Transcriptional interference and termination between duplicated alpha-globin gene constructs suggests a novel mechanism for gene regulation［J］.Nature,1986,322（6079）: 562-565.

［14］Greger I H,Demarchi F,Giacca M，et al.Transcriptional interference perturbs the binding of Sp1 to the HIV-1 promoter［J］.Nucleic Acids Res,1998,26（5）:1294-1301.

［15］Padidam M,Cao Y.Elimination of transcriptional interference between tandem genes in plant cells［J］.Biotechniques,2001,31（2）:328-330.

Impact of Promoters and PolyA Sequence on Expression Efficiency of Buffalo Mammary Gland Specific Expressing Vectors

LUO Chan,REN Yan-ping,QU Chun-feng,LI Hai-yang,Li Xiang-ping,SHI De-shun*
（Animal Reproduction Institute,State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources,Guangxi University,Guangxi Nanning 530005,China）

To investigate the impact of promoters and PolyA sequence on the expression of exogenous genes in Bcap37 cells,two different length of Beta casein（BCN）promoters and PolyA sequences were used in the constitute of buffalo mammary gland specific expressing vectors.Real-time PCR and flow cytometry analysis were used to detect the expression levels of marker gene green fluorescent protein（GFP）and target gene prolactin（PRL）in Bcap37 cells transfected with different vectors.The result showed that the expression level of PRL was significant higher in the cells transfected with vector contained a 5.2 Kb length of BCN promoter than vector contained 3.8 Kb length of BCN promoter.It indicated that the expression of exogenous was positively correlated to the length of the promoters. Moreover,both the expression of GFP and PRL were improved remarkably when inserting PolyA sequence between promoter CMV and BCN,the results showed that the inserted PolyA sequences could eliminate the transcription inhibition inducing by promoter CMV and BCN.The modified vectors which driven the expression of PRL more effectively can be utilized in the subsequent work.

promoter；polyA sequence；prolactin；green fluorescent protein；gene expression；buffalo

S823.2

A

0258-7033（2015）09-0062-06

2014-09-08；

2014-10-30

國家“863”重大專項（2011AA100607）；廣西亞熱帶生物資源保護利用重點實驗室開放課題（SB1002）

羅嬋（1981-），女，廣西北流人，助理研究員，主要從事發(fā)育生物學和轉基因動物研究，E-mail：luochan@gxu.edu.cn

*通訊作者：石德順，研究員，博士生導師，E-mail：ardsshi@gxu.edu.cn