不同去核方法對豬手工克隆重構(gòu)胚發(fā)育效果的影響

呂玲燕，陸杏蓉，孫俊銘，潘翠玲，崔奎青*，謝炳坤*

（1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點實驗室，廣西南寧530001；2.廣西大學亞熱帶生物資源保護利用國家重點實驗室，廣西南寧530005）

不同去核方法對豬手工克隆重構(gòu)胚發(fā)育效果的影響

呂玲燕1，陸杏蓉2，孫俊銘2，潘翠玲1，崔奎青2*，謝炳坤1*

（1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點實驗室，廣西南寧530001；2.廣西大學亞熱帶生物資源保護利用國家重點實驗室，廣西南寧530005）

為探討不同去核方法對豬手工克?。℉MC）重構(gòu)胚發(fā)育效果的影響，本研究比較了盲切法，第一極體（Pb1）定位法及脫羰秋水仙堿（DM）輔助去核法3種不同的去核方法的去核效率及HMC胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明：第一極體定位法和DM輔助去核法的整體去核效率顯著高于盲切法去核法（P＜0.05）；應(yīng)用0.4 μg/mL DM處理卵母細胞60 min的突起率、整體去核效率顯著高于其他濃度和時間處理組（P＜0.05）；DM輔助去核與pb1定位去核法2種不同去核方法對HMC重構(gòu)胚的發(fā)育效果的影響差異不顯著。本研究表明，添加適量的DM可以提高徒手克隆去核效率，且對后期重構(gòu)胚發(fā)育沒有顯著影響。

去核方法；豬；手工克??；發(fā)育效果

自從“多莉”問世后,體細胞核移植技術(shù)不斷向前發(fā)展,并在優(yōu)秀動物個體復制、瀕危動物保護以及細胞分化研究中取得一些舉世矚目的成就,它已然成為生命科學研究的熱點領(lǐng)域之一。由于豬在生理、形態(tài)上與人的器宮非常相似,近年來應(yīng)用豬的體細胞核移植技術(shù)研制人類基因疾病的動物模型,以及生產(chǎn)基因敲除豬用于人異種器宮移植成為豬核移植相關(guān)研究的熱點方向之一［1-2］。就豬的體細胞核移植而言,成功克隆出小豬的概率總體只有1%,極大制約核移植克隆豬相關(guān)工作的開展［3-4］。卵母細胞的成功去核是克隆成功的第1步,影響去核的效率也是多方面的,如去核的干凈程度、對卵胞質(zhì)損傷類型及程度。DM具有破壞微管穩(wěn)定、干擾染色體的正常分離和紡錘體的功能,可以促使激活卵母細胞核內(nèi)的所有染色質(zhì)隨同極體一起排出,從而獲得核移植所需的受體胞質(zhì),因此被用于卵母細胞的去核［5］。Gasparrini等［6］用DM進行化學誘導去核,以去核后小鼠卵母細胞為受體重構(gòu)胚胚胎進行移植后成功獲得了健康的克隆小鼠。Lan等［7］用DM輔助羊卵母細胞的去核,從而改善羊重構(gòu)胚胎的發(fā)育潛能。Li等［8］用DM誘導去核的豬卵母細胞為受體的重構(gòu)胚移植后成功獲得了健康克隆小豬。由此可見,DM誘導去核的細胞質(zhì)能夠支持供體全基因組的重編程,可以用于體細胞核移植。本試驗探討不同去核方法對去核效率的影響,以及不同的去核方法對豬手工克隆重構(gòu)胚發(fā)育潛能的影響,從而優(yōu)化豬HMC的技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑耗材培養(yǎng)液中的TCM-199粉劑、DMEM粉劑購置于美國Gibco公司,胎牛血清(FBS)購置于Hyclone公司,激素為hCG,eCG購置于美國Sigma公司,其余的化學試劑如無特殊說明均購自美國Sigma Aldrich公司。配制溶液的三蒸水均為南寧本地水。融合槽型號：BTX 450(San Diego,USA),卵母細胞成熟培養(yǎng)皿：35 mm及60 mm塑料平皿(BD Falcon,USA)自制卵母細胞切割刀,胚胎培養(yǎng)皿：匹孔板(NUNC公司,舟麥)胚胎積聚針(DN-10式)。

1.2 卵母細胞的成熟培養(yǎng)卵巢從南寧市附近的屠宰場獲取,裝入含有雙抗(青霉素、鏈霉素)的生理鹽水中,用保溫壺4 h之內(nèi)送回實驗室。用手術(shù)剪剪掉卵巢上多余的結(jié)締組織,再用37℃的生理鹽水把卵巢沖洗干凈,然后加入37℃含雙抗的生理鹽水,送到胚胎室抽取卵母細胞。用10 mL的注射器抽取卵巢表面2～6 mm的卵泡,卵泡液放入恒溫架的試管中,靜置15 min,棄去上清,用洗卵液分裝沉淀的部分。在體視顯微鏡下挑選含有3層及3層以上有顆粒/卵丘細胞包被、折光性良好的卵丘卵母細胞復合體(COCs),放入成熟液中培養(yǎng)(含10 IU/mL h CG+ 10 IU/mL eCG),培養(yǎng)20～22 h后換成不含激素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18～20 h。

1.3 胎兒成纖維細胞的培養(yǎng)胎兒從南寧屠宰場已懷孕母豬獲取的,置于加雙抗的生理鹽水中,在4 h之內(nèi)送回實驗室。先用不含雙抗的普通生理鹽水清洗3遍,轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺,用眼科剪分離出部分大腿及臀部組織,之后用含有雙抗的PBS清洗2遍,放入60 mm的無菌平皿底部,將其剪碎成2～3 mm大小的組織塊,往培養(yǎng)皿中加入適量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,用鑷子將組織塊均勻地鋪開,在皿蓋作好標記,將其倒扣于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,4 h后加入少量培養(yǎng)液,防止組織塊漂浮。24 h后在平皿底部加滿培養(yǎng)液,48 h后繼續(xù)觀察胎兒成纖維細胞的生長狀況,待原代成纖維細胞生長至90%左右匯合時傳代,傳至5～6代,用作豬手工克隆供體細胞。

1.4 卵母細胞的去核方法挑選優(yōu)質(zhì)的卵母細胞置于1%透明質(zhì)酸酶中,輕輕吹打數(shù)次以去除包被在外層的顆粒細胞。然后將其移入的鏈霉蛋白酶溶液中,透明帶開始變形時,立即移入含胎牛血清為20%的洗液(T20)中洗滌3次,然后放入T20中讓其自然恢復成圓形,用口徑約為200～300 μmol/L的玻璃吸管將卵母細胞轉(zhuǎn)移至切割液(含2.5 μg/mL CB)中,挑選恢復完整、質(zhì)量較好的卵母細胞用于去核。

盲切法：將恢復完整的卵母細胞置于體視顯微鏡下,用自制切割刀隨機把細胞切成兩半,Hoechst 333342染色去核,挑取無核細胞待用。

極體定位法：挑取具有第一極體的細胞,將極體置于06：00或12：00的位置,用切割刀切去極體方向約1/3的卵胞質(zhì),剩下的無核胞質(zhì)留做后續(xù)試驗。

化學輔助去核：將挑選出的卵母細胞放入DM中孵育DM的濃度、處理時間根據(jù)試驗設(shè)計而定),將突起或極體至于06：00點或12：00的方位,利用自制的切割刀以壓鍘刀似的手法切去含突起或極體約1/3的胞質(zhì),留下2/3的胞質(zhì)用作受體胞質(zhì)。

1.5 供/受體細胞的融合/激活采用一步融合法。融合/激活分為3步,首先進行粘合,然后再進行融合/電激活,最后進行化學激活。

粘合：先用植物凝集素(PHA)把無核半卵和供體細胞粘合,形成半卵-供體細胞配對物；然后再把另一個去核半卵與配對物相粘合,形成卵-供體-卵式的粘合體,移入電融合液中待融合。

融合/電激活：將粘合體均勻放入有電融合液的融合槽中,電融合參數(shù)為AC：6 V/cm；DC：1.2 kV/cm, 30 μs,2 DC。電激活后完成后放入培養(yǎng)箱中恢復30 min,然后檢查其融合情況。

化學激活：將融合后的重構(gòu)胚放入含5 μg/mL CB和10 μg/mL CHX的PZM-3激活液中激活,每滴激活液中放入1枚重構(gòu)胚,激活4 h。

1.6 重構(gòu)胚的微穴培養(yǎng)為保證無透明帶的HMC重構(gòu)胚能夠在相對獨立的環(huán)境下生長,本研究采用微穴培養(yǎng)法對胚胎進行培養(yǎng),微穴(WOW)制作過程如下：用胚胎聚集針在匹孔板里扎出底部光滑、寬度適中的“U”型穴,使卵裂球在穴底能夠聚集在一起,便于到發(fā)育后期發(fā)生致密化形成囊胚。進行微穴培養(yǎng)時,每個孔扎30個穴左右為宜,密度適中,以便于胚胎發(fā)育過程中維持細胞間的聯(lián)系。扎好微穴后的匹孔板用胚胎培養(yǎng)液(PZM-3)清洗2～3遍除去塑料碎屑后,加入500 μL豬胚胎培養(yǎng)液(PZM-3),并蓋上500 μL礦物油。將已進行化學激活4 h的重構(gòu)胚移入微穴(WOW)中,于38.5℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行重構(gòu)胚胎培養(yǎng),48 h觀察卵裂率,160～168 h觀察囊胚率。

1.7 囊胚細胞計數(shù)收集第7天的囊胚,于CCM細胞洗液中清洗2～3次后,置于的10 μmol/mL Hoechst33342染液,室溫中避光染色15 min,取出于CCM中清洗2～3次,石蠟-凡士林封片,熒光顯微鏡下觀察記錄囊胚細胞總數(shù)目,每一組均統(tǒng)計10個囊胚以上。

1.8 試驗設(shè)計試驗1：比較盲切法、第一極體定位法、DM輔助去核法3種方法對去核成功率的影響；試驗2：比較0.3、0.4、0.5 μg/mL 3種DM濃度處理對去核效率的影響,探索DM處理的最佳濃度；試驗3：比較用0.4 μg/mL DM處理0、30、45、60、90 min 5個時間對去核效率的影響,探索DM處理的最佳時間；試驗4：探索DM處理對HMC重構(gòu)胚發(fā)育效果的影響。

1.9 統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)由SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析,試驗每重復1次均為同一批次試驗,使用相同來源的卵巢和試驗條件,所有試驗至少重復4次。

2 結(jié)果

2.1 3種不同去核方法對去核成功率的影響比較盲切法、第一極體定位法、DM輔助去核法3種不同去核方法對去核效率的影響。結(jié)果表明,第一極體定位法和DM輔助去核法的整體去核效率要高于盲切法去核,它們兩者之間的去核效率差異不顯著,具體結(jié)果見表1及圖1。

表1 不同去核方法對去核效率的影響

圖1 3種不同去核方法對去核效率的影響

2.2 3種不同DM濃度處理對去核效率的影響比較了0.3、0.4、0.5 μg/mL 3種不同濃度DM處理卵母細胞后對去核效率的影響,結(jié)果表明,0.4 μg/mL DM處理卵母細胞的突起率、整體去核效率顯著高于其他濃度處理組,結(jié)果見表2。

2.3 0.4 μg/mL DM處理不同時間對去核效率的影響比較了0.4 μg/mL DM處理卵母細胞0、30、45、60、90 min對去核效率的影響,結(jié)果表明,DM處理卵母細胞60 min的突起率、整體去核效率最高,顯著高于其他處理時間組(P＜0.05),其他各時間處理組之間的突起率、整體去核效率差異不顯著(表3)。

2.4 DM處理對HMC重構(gòu)胚發(fā)育效果的影響由表4和圖2可見,0.4 μg/mL DM輔助去核法與Pb1定位去核法對HMC重構(gòu)胚的發(fā)育效果的影響不大,兩者之間卵裂率、囊胚率以及細胞計數(shù)差異不顯著。

3 討論

3.1 不同去核方法對去核效率的影響第一極體定位去核是比較原始、直接的去核方法,由于豬的卵母細胞胞質(zhì)中沉積了大量的脂肪滴,使得在卵母細胞的去核過程中對胞質(zhì)、第一極體、染色體結(jié)構(gòu)的觀察受到一定的阻礙,后來人們研究發(fā)現(xiàn)了可借助一些特定的化學物質(zhì)輔助去核的方法,如盲切法結(jié)合熒光染料Hoechst33342染色去核和DM化學誘導輔助去核等。第一極體定位去核對卵胞質(zhì)的物理及化學損害比較小,但去核過程需要仔細尋找第一極體,比較耗時,效率偏低,部分卵母細胞的第一極體脫落也造成整體去核率偏低。Dominko等［9］用第一極體定位去核,含透明帶的卵母細胞的去核的率達70%,與本試驗的去核效率基本一致。盲切法結(jié)合熒光染料Hoechst33342染色去核,它是卵母細胞隨機切割去核后與熒光染料Hoechst33342共孵育,經(jīng)過短暫的紫外線照射后把含有染色體的半卵胞質(zhì)去除,留下另一半不含染色體的胞質(zhì)待用,但熒光染料特異性地結(jié)合DNA是否具有潛在的危害有待證實。DM化學誘導輔助去核,它能借助DM能松弛細胞骨架,用它處理MⅡ期的卵母細胞能使染色質(zhì)或核能突出于細胞表面,利用突起的位置可以定向、準確的去核［10］。Li等［11］在豬手工克隆中,用0.4 μg/mL的DM處理成熟41～42 h的卵母細胞45 min,結(jié)果表明,化學輔助去核的總體去核率、融合率及囊胚發(fā)育率明顯高于定向切割去核的。李向臣等［12］利用DM突顯牛卵母細胞的染色體進行定向去核,在濃度為0.5 μg/mL DM中孵育2 h,其顯核率達到76.54%。任子利等［13］研究發(fā)現(xiàn),切割成功率隨著豬卵母細胞成熟時間的延長有上升趨勢,成熟44 h和46 h組的切割成功率分別為83.68%和86.73%,高于40 h和42 h組(77.84%和82.97%,P＞0.05)。本試驗的3種去核方法中,DM輔助去核的效率較高,與上述文獻的試驗結(jié)果相符。

表2 不同DM濃度處理對去核效率的影響

表3 0.4 μg/mL DM不同處理時間對去核效率的影響

表4 DM處理對HMC重構(gòu)胚發(fā)育效果的影響

3.2 0.4 μg/mL DM處理不同時間對去核效率的影響DM與卵母細胞的共孵育時間對去核是至關(guān)重要的。孵育時間過短,第一極體無法凸顯；孵育時間太長,DM又可能影響去核后重構(gòu)胚的發(fā)育。任子利等［13］研究表明,0.4 μg/mL DM處理成熟44 h的豬卵母細胞1 h與0.5 h,1.5 h相比,卵裂率差異不顯著,囊胚率略高于其他時間處理組。Li等［11］用0.4 μg/mL的DM處理卵母細胞45 min,與隨機切割去核,顯微操作去核相比,其總體去核率、囊胚發(fā)育率都要高于其他去核方法。孫偉［14］研究表明,0.4 μg/mL DM處理牛MII卵母細胞60 min的誘導去核效率高達84.19%,與本研究結(jié)果一致。

3.3 DM處理對HMC重構(gòu)胚發(fā)育效果的影響DM誘導去核及Pb1定位去核后的受體是否影響重構(gòu)胚胎的后續(xù)發(fā)育過程有待驗證。去核過程損失過多的胞質(zhì)會影響重構(gòu)胚的發(fā)育能力及囊胚細胞總數(shù)。Bowles等［15］通過分別融合去核后的1、2、3個半卵胞質(zhì),比較后期囊胚的發(fā)育率,結(jié)果分別為9.9%、28.2%、30%,這說明重構(gòu)胚的體積對胚胎的后續(xù)發(fā)育具有至關(guān)重要的作用。Siriboon等［16］把發(fā)育到4細胞階段的手工克隆胚胎,通過2個4細胞階段和3個4細胞的胚胎聚合,增加胞質(zhì)的體積,從而提高胚胎發(fā)育效率,改善胚胎的發(fā)育質(zhì)量。Li等［17］研究表明在以轉(zhuǎn)基因的成纖維細胞為供體的HMC試驗中,pb1定位去核后受體重構(gòu)胚的發(fā)育潛能要略優(yōu)于DM輔助去核的重構(gòu)胚發(fā)育潛能。本試驗比較了DM誘導去核及pb1定位去核后的受體對重構(gòu)胚胎發(fā)育效果,結(jié)果表明2種去核方法的HMC重構(gòu)胚發(fā)育效果差異不顯著,可能是由于去核過程對卵母細胞胞質(zhì)造成的損傷是相當?shù)?而且都不影響后續(xù)胚胎的發(fā)育效果。

圖2 A、B分別為DM輔助去核后的HMC囊胚及Hoechst 33342染色后的囊胚細胞，C、D分別為Pb1定位去核后的HMC囊胚及Hoechst 33342染色后的囊胚細胞數(shù)

4 結(jié)論

第一極體定位法和DM輔助去核法的整體去核效率要高于盲切法去核；0.4 μg/mL DM處理卵母細胞60 min的突起率、整體去核效率最高,顯著高于其他濃度和時間處理組；DM輔助去核與Pb1定位去核2種不同去核方法對HMC重構(gòu)胚的發(fā)育效果的影響差異不顯著。

［1］Lai L X,Kolber-Simonds D,Park K W,et al.Production of α-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning［J］.Science,2002,2959（5557）:1089-1092.

［2］張德福,劉東,湯琳琳,等.不同供體細胞及其處理對豬核移植重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響［J］.遺傳,2007,29（2）:211-217.

［3］Colman A.Somatic cell nuclear transfer in mammals:progressand applications［J］.Cloning,1999,1（4）:185-200.

［4］Vajta G,Zhang Y,Macháty Z.Somatic cell nuclear transfer in pigs:recent achievements and future possibilities［J］.Reprod Fertil Dev,2007,19（2）:403-423.

［5］趙禹,劉軍,王保壘,等.小鼠卵母細胞化學去核及手工構(gòu)建核移胚胎［J］.中國畜牧獸醫(yī),2009,10（36）:102-106.

［6］Gasparrini B,Gao S,Ainslie A,et a1.Cloned mice derived from embryonic stem cell karyoplasts and activated cytoplasts prepared by induced enucleation［J］.Biol Reprod,2003,68（4）: 1259-1266.

［7］Lan G C,Wu Y G,Han D,et a1.Demecolcine-assisted enucleation of goat oocytes:protocol optimization,mechanism investigation,and application to improve the developmental potential ofcloned embryos［J］.Cloning Stem Cells,2008,10（2）: 189-202.

［8］Li J,Du Y,Zhang Y H,et a1.Chemically assisted handmade enucleation of porcine oocytes［J］.Cloning Stem Cells,2006,8（4）:241-250.

［9］Dominko T,Ramalho-Santos J,Chan A,et al.Optimization strategies for production of mammalian embryos by nuclear transfer［J］.Cloning,1999,1（3）:143-152.

［10］Peura T.Improved in vitro development rates of sheep somatic nuclear transfer embryos by using a reverse-order zona-free cloning method［J］.Cloning Stem Cells,2003,5（1）:13-24.

［11］Li J,Du Y T,Zhang Y H,et al.Chemically assisted handmade enucleation of porcine oocytes［J］.Cloning Stem Cells,2006,8（3）:241-250.

［12］李向臣,吳月紅,馬毅,等.脫羰秋水仙堿（DM）輔助去牛卵母細胞核的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報,2007,38（6）:537-541.

［13］任子利,趙彥玲,楊小淦,等.豬卵母細胞化學輔助手工去核及手工核移植胚胎發(fā)育能力因素的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報,2011,42（7）:921-931.

［14］孫偉.化學誘導去核和全細胞胞質(zhì)注射法生產(chǎn)牛體細胞克隆胚胎的研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學,2007.

［15］Bowles E J,Tecirlioglu R T,French A J,et al.Mitochondrial DNA transmission and transcription after somatic cell fusion to one or more cytoplasts［J］.Cloning Stem Cells,2008,26（3）: 775-782.

［16］Siriboon C,Tu C F,Kere M,et al.Production of viable cloned miniature pigs by aggregation of handmade cloned embryos at the 4-cell stage［J］.Reprod Fertil Dev,2014,26（3）:395-406.

［17］Li J,Villemoes K,Zhang Y H,et al.Efficiency of two enucleation methods connected to handmade cloning to produce transgenic porcine embryos［J］.Reprod Domest Anim,2009,44（1）:122-127.

Effects of Developmental Potency of Reconstructed Embryos on Pig Handmade Clone with Different Enucleation Methods

LV Ling-yan1,LU Xing-rong2,SUN Jun-ming2,PAN Cui-ling1,CUI Kui-qing2*,XIE Bing-kun1*
（1.Guangxi Key Laboratory of Livestock Genetic Improvement,Guangxi Institute of Animal Sciences,Guangxi Nanning 530001,China；2.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources Guangxi University,Guangxi Nanning 530005,China）

Effects of developmental potency of reconstructed embryo on pig handmade clone（HMC）with different enucleation method was investigated.In this study,we compared with enucleation efficiency and effect of HMC embryos developmental potency by three different methods with blind cut method,first polar body positioning method（Pb1）and demecolcine（DM）assistance method.The results showed that overall enucleation efficiency of Pb1 positioning method was significantly higher than blind cut method（P＜0.05）.Protuberance rate and overall enucleation efficiency of 0.4 μg/mL DM treated group for 60 min was significantly higher than other concentration and time treatment groups（P＜0.05）.Developmental potency of HMC reconstructed embryos by DM assistance method and Pb1 positioning method had no significant difference.In conclusion,this study indicated that appropriate amount addition of DM could enhance enucleation efficiency of HMC,however,it wasn't significantly effects on developmental potency of reconstructed embryos.

enucleation methods；porcine；handmade clone；developmental potency

S828.3

A

0258-7033（2015）09-0016-05

2014-10-14；

2014-12-05

國家自然科學基金（31360544）；廣西畜牧研究所基本科研業(yè)務(wù)費項目基金（桂牧研科2014-02）

呂玲燕（1985-），女，廣西桂林人，碩士，主要從事動物胚胎工程和分子遺傳育種研究，E-mail：llyan159@163.com，第二作者跟第一作者具有相同的貢獻，故并列第一作者

*通訊作者：崔奎青，教授，kqcui@126.com；謝炳坤，副研究員，bkxie@163.com