灰黃霉素中去氯灰黃霉素雜質(zhì)的提取和分離

呂書(shū)陽(yáng) 李樹(shù)學(xué)(赤峰艾克制藥科技股份有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

灰黃霉素(griseofulvin)，屬于芳香族衍生物類(lèi)抗生素，分子式為C17H17ClO6，相對(duì)分子質(zhì)量為352.77。生物合成灰黃霉素過(guò)程中，缺少氯離子或氯化反應(yīng)受阻時(shí)，灰黃霉素的合成量下降甚至不能產(chǎn)生，會(huì)通過(guò)一個(gè)分支反應(yīng)途徑，形成去氯灰黃霉素。去氯灰黃霉素抗真菌的活性很弱，會(huì)嚴(yán)重影響灰黃霉素的使用效果，是灰黃霉素發(fā)酵產(chǎn)物中的主要雜質(zhì)，所以必須嚴(yán)格控制灰黃霉素產(chǎn)品中去氯灰黃霉素的含量。而在質(zhì)量控制和檢驗(yàn)過(guò)程中，需要去氯灰黃霉素的純品作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。本文探討了從灰黃霉素中提取和分離去氯灰黃霉素的條件和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及來(lái)源:灰黃霉素產(chǎn)品:由赤峰制藥股份有限公司提供；試劑為分析純，設(shè)備儀器為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用設(shè)備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薄層層析法考察洗脫劑的條件:通過(guò)HPLC法測(cè)得灰黃霉素產(chǎn)品中去氯灰黃霉素的含量為0.3%。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)可知，去氯灰黃霉素在丙酮和N，N-二甲基甲酰胺中具有較大的溶解度，故分離去氯灰黃霉素的展開(kāi)劑由乙酸乙酯與正己烷組成。本實(shí)驗(yàn)以不同配比的展開(kāi)劑進(jìn)行薄層層析對(duì)比分離效果，并對(duì)比采用丙酮和N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑的分離效果。

1.2.2 硅膠柱層析

a準(zhǔn)備工作:取一柱長(zhǎng)45cm，直徑約3cm的下端有沙漏和活塞的玻璃層析柱，洗凈，涼干。取層析硅膠200克于大燒杯中，加入配好的比例為正己烷:乙酸乙酯為1:3的展開(kāi)劑至層析硅膠完全浸沒(méi)，密封，放置24小時(shí)。

b裝柱:向浸泡后的層析硅膠中加入適量展開(kāi)劑，用玻璃棒攪起硅膠沉淀，然后將渾濁夜倒入玻璃柱中然后靜止，待硅膠沉淀完全，放出適量展開(kāi)劑，再以同樣的方法將剩下的層析硅膠裝入柱內(nèi)，靜置至沉淀完全，始終保持液面高于層析硅膠上面。

c樣品溶液配制:稱(chēng)取約30g的灰黃霉素產(chǎn)品于100mL錐形瓶中，加入展開(kāi)劑至100mL的刻度線處，置于超聲波儀器中超聲30min，取出靜置至沉淀完全，將上清液用濾紙過(guò)濾后收集濾液，待用。

d層析分離:將過(guò)濾后的樣品溶液加入到層析柱中，加入樣品溶液的高度約4cm，流速每秒1-2滴，用50mL錐形瓶接流出液，做薄層層析，收集帶有去氯灰黃霉素斑點(diǎn)的流出液。

經(jīng)過(guò)柱層析，灰黃霉素和去氯灰黃霉素并未成功分離，可能是溶劑丙酮影響了展開(kāi)劑的比例，使層析效果不佳。改為N，N二甲基甲酰胺溶劑后，分離效果理想。去氯灰黃霉素在灰黃霉素產(chǎn)品中含量很少，須經(jīng)多次硅膠柱層析，將所有收集到的去氯灰黃霉素溶液合并，進(jìn)行濃縮結(jié)晶，才能得到一定量的去氯灰黃霉素溶液。

1.2.3 濃縮與結(jié)晶:將含有去氯灰黃霉素組分的合并洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，60℃條件下蒸餾，將得到的剩余溶液倒入干凈的錐形瓶中，加入少量水，即有白色晶體析出，經(jīng)過(guò)濾、洗滌、干燥，即得去氯灰黃霉素結(jié)晶。

1.2.4 產(chǎn)物的純度檢查:采用反向HPLC法，以乙腈:水=35:65為溶劑，以乙腈:水:冰乙酸=40:50:1為流動(dòng)相。采用面積歸一化法計(jì)算產(chǎn)品的純度，在相同條件下測(cè)定去氯灰黃霉素和灰黃霉素產(chǎn)品的色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 薄層層析法考察洗脫劑的條件

2.1.1 丙酮作為溶劑時(shí)薄層層析法結(jié)果:各比例展開(kāi)劑的薄層層析實(shí)驗(yàn)圖如圖1，其中1為去氯灰黃霉素，2為灰黃霉素。其中展開(kāi)劑正己烷:乙酸乙酯的比例分別為:a=1:1，b=1:2，c=1:3，d=2:1，e=3:1。由圖可知，樣品中物質(zhì)分離且樣品點(diǎn)展開(kāi)位置比較理想的是正己烷:乙酸乙酯為1:3的展開(kāi)劑。

2.1.2 N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑時(shí)薄層層析法結(jié)果:不同溶劑所得薄層色譜圖效果如圖2。其中1為去氯灰黃霉素，2為灰黃霉素。f是以N，N二甲基甲酰胺為溶劑，g是以丙酮為溶劑。對(duì)比可知，以N，N二甲基甲酰胺為溶劑時(shí)，樣品中物質(zhì)分離較好，且樣品點(diǎn)展開(kāi)位置比較理想。

圖1 、同配比展開(kāi)劑所得薄層色譜圖

圖2 、不同溶劑所得薄層色譜圖

2.2 硅膠柱層析結(jié)果

采用HPLC面積歸一化法計(jì)算去氯灰黃霉素的純度為90.5%，保留時(shí)間為10.640，譜圖見(jiàn)圖3。在相同條件下測(cè)定灰黃霉素產(chǎn)品中去氯灰黃霉素的保留時(shí)間為10.429，譜圖見(jiàn)圖4。

圖3 去氯灰黃霉素溶液HPLC圖譜

圖4 灰黃霉素產(chǎn)品溶液HPLC圖譜

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析可知，在展開(kāi)劑中正己烷:乙酸乙酯為1:3時(shí)，灰黃霉素和去氯灰黃霉素有較好的分離效果，因此選擇正己烷:乙酸乙酯(1:3)的展開(kāi)劑為柱層析的洗脫劑，以N，N二甲基甲酰胺為溶劑，分離得到的去氯灰黃霉素，其HPLC主峰保留時(shí)間(t=10.640min)與灰黃霉素產(chǎn)品中去氯灰黃霉素峰的保留時(shí)間(t=10.429min)基本一致，說(shuō)明所得產(chǎn)物為去氯灰黃霉素，且純度可達(dá)90.5%。

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