龍 舉,李子孟,喻 亮,李佩佩,嚴(yán)忠雍,張小軍(浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室,浙江舟山316021)
亞甲基藍(lán)(methylene blue,MB)是一種人工合成的噻嗪類染料,被廣泛應(yīng)用于化學(xué)指示劑、染料、生物染色劑和藥物等方面[1]?;趤喖谆{(lán)的氧化還原性,它作為藥物使用時主要用作解毒劑,可用于亞硝酸鹽、氰化物、硝基苯、乙酰苯胺等藥物中毒以及氨基比啉、磺胺類等藥物引起的高鐵血紅蛋白癥。作為消毒劑使用的亞甲基藍(lán)基于在水溶液中離子型的亞甲基藍(lán)與微生物酶系統(tǒng)競爭氫離子,使酶處于無活性的氧化狀態(tài),微生物因缺乏酶而失去生存能力[2]。亞甲基藍(lán)對防治淡水魚的水霉病、紅嘴病、小瓜蟲病等有很好的療效。由于亞甲基藍(lán)毒性比孔雀石綠低,近年來作為孔雀石綠、硝基呋喃等禁藥的替代品在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用[3]。亞甲基藍(lán)也被用作抗真菌劑用來降低魚類運輸途中的死亡率[4]。由于亞甲基藍(lán)及其代謝物被認(rèn)為對動物體有毒性且有致突變作用[5],在20世紀(jì)90年代美國、日本等國家禁止將其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[6]。
亞甲基藍(lán)的大量使用或濫用對養(yǎng)殖水生物會產(chǎn)生一定的毒副作用,通過生物富集作用在水生生物體中積累一定量的殘留,對食品安全和人類健康構(gòu)成新的隱患。目前,有關(guān)亞甲基藍(lán)殘留的檢測方法主要為水產(chǎn)品中亞甲基藍(lán)殘留的檢測,其方法有分光光度法[7]、高效液相色譜法[8]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]等??刂起B(yǎng)殖水體環(huán)境中的亞甲基藍(lán)可以直接減少水生生物體對亞甲基藍(lán)的生物累積量,有效控制養(yǎng)殖水產(chǎn)品體內(nèi)亞甲基藍(lán)的攝入量。檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍(lán)含量對了解養(yǎng)殖環(huán)境安全狀況、控制養(yǎng)殖水生物過多積累亞甲基藍(lán)和水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作具有積極意義。而對于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍(lán)含量的檢測,目前還沒有相關(guān)的檢測方法。根據(jù)亞甲基藍(lán)的化學(xué)性質(zhì),選擇適合的前處理方法,優(yōu)化儀器分析條件,建立了一種檢測養(yǎng)殖水體中亞甲基藍(lán)的高效液相色譜法。
1.1 儀器和試劑 高效液相色譜儀:美國Waters 2695-2489紫外/可見光檢測器;色譜柱:XbridgeTMC18柱;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,瑞士BUCHI公司;分液漏斗振蕩器,北京國環(huán)高科自動化技術(shù)研究院;二氯甲烷(農(nóng)殘級)、甲醇、甲酸、乙腈(均為色譜純),德國Merck公司;亞甲基藍(lán),美國Sigma公司;鹽酸(優(yōu)級純),中國上海試劑總廠;試驗用蒸餾水為重蒸水,自動電熱純水蒸餾器制備。
1.2 液相色譜條件 色譜條件:XbridgeTMC18柱,5.0 μm ,4.6×250 mm;柱溫:30℃;流動相:濃度0.1%甲酸水溶液-乙腈(62∶38,V/V);流速:1.0 ml/min;進樣量:50 μl;紫外檢測波長:655 nm。
1.3 試驗方法
1.3.1 樣品處理。采集水樣,立即用0.01 mol/L鹽酸浸泡過半小時的0.45 μm濾膜進行抽濾處理,將抽濾所得水樣轉(zhuǎn)移至樣品瓶中,4~8℃保存。待水樣至室溫,準(zhǔn)確量取經(jīng)過濾后的水樣250 ml,轉(zhuǎn)移到500 ml分液漏斗中,加入50 ml二氯甲烷萃取,振蕩1 min后靜置20 min,待分液漏斗中液體穩(wěn)定且出現(xiàn)明顯分層后,把下層二氯甲烷轉(zhuǎn)移到100 ml旋蒸瓶中,在40~45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至蒸干。取下旋蒸瓶之后,往旋蒸瓶中準(zhǔn)確加入1.0 ml甲醇溶解殘留物,并將膠頭吸管伸入瓶中,利用加入的甲醇清洗旋蒸瓶內(nèi)壁。靜置旋蒸瓶,待內(nèi)壁上的液體完全流下,吸取瓶中提取液,過0.22 μm有機相微孔濾膜待測。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。用色譜甲醇配制濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L 的亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液,進行高效液相色譜紫外檢測。根據(jù)樣品目標(biāo)峰的保留時間定性,以峰面積為縱坐標(biāo),以亞甲基藍(lán)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,以外標(biāo)法定量計算亞甲基藍(lán)的含量。
2.1 提取方法的確定 亞甲基藍(lán)易溶于乙腈、甲醇、二氯甲烷等有機溶劑。對于水產(chǎn)品中亞甲基藍(lán)的提取,楊方等[2]用離子對試劑(對甲苯磺酸的乙酸銨緩沖液-乙腈)提取;宮向紅等[3]選擇用乙酸銨緩沖液和乙腈提取;王媛等[11]直接用乙腈提取。他們的一個共同點是都使用二氯甲烷反萃。由于乙腈與水不能明顯分層,該試驗選擇二氯甲烷作為提取試劑。在分液漏斗的樣品中加入一定量的二氯甲烷,劇烈振蕩后靜置,待分液漏斗中液體穩(wěn)定且出現(xiàn)明顯分層后,把下層二氯甲烷轉(zhuǎn)移到旋蒸瓶中,在40~45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至蒸干。向旋蒸瓶中準(zhǔn)確加入1.0 ml甲醇溶解殘留物,并且將膠頭吸管伸入瓶中,利用加入的甲醇清洗旋蒸瓶內(nèi)壁。試驗表明,該提取方法基質(zhì)影響較小,可以直接供液相色譜上機分析。
2.2 色譜條件及色譜圖 關(guān)于流動相的配制,選擇較多的有乙腈和0.125 mol/L乙酸銨溶液、甲醇和濃度0.1%甲酸水溶液等。結(jié)合實驗室儀器性能和試劑選擇性,選擇濃度0.1%甲酸水溶液 - 乙腈(60∶40,V/V)、乙腈 -0.125 mol/L乙酸銨溶液水(70∶30,V/V)、甲醇濃度 -0.1%甲酸水溶液(45∶55,V/V)等。經(jīng)過試驗優(yōu)化比較,在紫外波長655 nm處,以濃度0.1%甲酸水溶液-乙腈(62∶38,V/V)作為流動相的效果最好,可以有效地將亞甲基藍(lán)完全分離,不受雜峰干擾,且色譜峰峰形尖銳,對稱性好,能滿足亞甲基藍(lán)的檢測分離要求。所以,選擇濃度0.1%甲酸水溶液-乙腈(62∶38,V/V)作為流動相。以該試驗方法和色譜條件,亞甲基藍(lán)在色譜圖上保留時間約為3.50 min。亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖如圖1所示,空白樣品加標(biāo)色譜圖如圖2所示。
圖1 1.00 mg/L亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
圖2 空白水樣加標(biāo)色譜圖
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程 采用高效液相色譜-紫外/可見光檢測器進行色譜分析,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),以亞甲基藍(lán)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖3可知,線性方程為 Y=3.88×105X -5.83×103,線性相關(guān)系數(shù)(R2)=0.999 287,說明亞甲基藍(lán)在0.05 ~1.00 mg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,能夠進行準(zhǔn)確定量。
圖3 亞甲基藍(lán)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
2.4 方法回收率和精密度 分別取養(yǎng)殖水樣空白樣品各250 ml于500 ml分液漏斗中,加入相當(dāng)于水樣含量為0.06、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L 亞甲基藍(lán),每個添加水平做 6 個平行,測定亞甲基藍(lán)含量,計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表1可知,方法回收率為75.2% ~86.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于12%??梢姡撛囼灧椒ㄓ休^高的回收率和精密度。
表1 加標(biāo)回收率及方法精密度試驗(n=6)
2.5 檢出限 參考Waters 2695液相色譜儀靈敏度的要求,通過空白養(yǎng)殖水樣加標(biāo)液逐級稀釋,以信噪比S/N=3的樣品質(zhì)量濃度為方法檢出限,取信噪比S/N=10的樣品質(zhì)量濃度為方法定量限,計算出方法中亞甲基藍(lán)的檢出限為0.05 mg/L。
2.6 實際水樣的測定 采用建立的高效液相色譜法測定養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍(lán)含量的方法,分別對A、B兩地烏鱧養(yǎng)殖塘中的水樣進行20批次檢測,未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。據(jù)實地了解,得知這兩處養(yǎng)殖均未使用過亞甲基藍(lán)。
該試驗研究了高效液相色譜法測定養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍(lán)殘留量的提取、濃縮和分析條件,建立了可以成功用于養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍(lán)殘留量的分析方法。該試驗方法的測定結(jié)果能夠真實反映養(yǎng)殖水體環(huán)境情況,可以作為一個衡量養(yǎng)殖水體環(huán)境質(zhì)量的指標(biāo)。管理者可以根據(jù)需要對養(yǎng)殖水體中亞甲基藍(lán)進行長期監(jiān)測。這對于控制水體環(huán)境有著重要意義。適時監(jiān)測數(shù)據(jù)則對了解養(yǎng)殖的經(jīng)濟類水生物體內(nèi)亞甲基藍(lán)殘留情況有一定的指導(dǎo)作用。在試驗過程中,該方法有試劑干擾少、方法回收率高、重現(xiàn)性好、操作簡單、精密度高等優(yōu)點,能夠滿足養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍(lán)含量的測定要求。
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