與胰島共培養(yǎng)誘導(dǎo)肌源性干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的可能性研究

王欣燕617000四川省攀枝花市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科

與胰島共培養(yǎng)誘導(dǎo)肌源性干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的可能性研究

王欣燕
617000四川省攀枝花市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科

目的：探討胰島與新生大鼠肌源性干細(xì)胞（MDSCs）在體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)肌源性干細(xì)胞（MDSCs）分化為胰島素分泌細(xì)胞的可能性。方法：提取新生大鼠MDSCs原代細(xì)胞，行鑒定，取第2代MDSCs外源性綠色熒光蛋白（GFP）基因轉(zhuǎn)染。提取大鼠胰島，雙硫腙鑒定，胰島與GFP轉(zhuǎn)染的MDSCs共培養(yǎng)。另選單獨(dú)MDSCs培養(yǎng)為對照組。結(jié)果：共培養(yǎng)組第5天在顯微鏡下可見細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)，第7天可見典型的胰島樣細(xì)胞團(tuán)；雙硫腙鑒定細(xì)胞團(tuán)：綠色團(tuán)塊中有部分被染成猩紅色，說明猩紅色團(tuán)塊來自MDSCs分化表。對照組未檢測到上述變化。結(jié)論：胰島與MDSCs共培養(yǎng)能誘導(dǎo)大鼠MDSCs跨胚層分化為胰島素分泌細(xì)胞。

成體干細(xì)胞；共培養(yǎng)；胰島；胰島素分泌細(xì)胞

糖尿病己成為發(fā)達(dá)國家中繼心血管病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病。干細(xì)胞可定向分化為胰島素分泌細(xì)胞的研究為糖尿病的治療提供了新的思路。除了通過不同培養(yǎng)條件進(jìn)行體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的方法外，還有用成熟體細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)同樣可以誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化[1]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究大鼠胰島與MDSCs共培養(yǎng)后誘導(dǎo)MDSCs分化成胰島素分泌細(xì)胞的可能。

資料與方法

動(dòng)物：新生3d內(nèi)SD大鼠，雌雄不限；5周齡SD大鼠，雌雄不限。

主要試劑：Ⅱ型分散酶，Ⅱ、V型膠原酶，雙硫腙（DTZ），小鼠抗大鼠Desmin抗體。腺病毒介導(dǎo)的外源性綠色熒光蛋白（GFP）基因。

方法：①M(fèi)DSCs的原代培養(yǎng)：取新生3d內(nèi)的SD大鼠乳鼠5只，無菌條件下取骨骼肌，剪成乳糜狀，消化、離心，棄上清，細(xì)胞團(tuán)重懸，命名為PP1，置培養(yǎng)箱中。3h后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至另一個(gè)培養(yǎng)瓶，命名為PP2。相關(guān)實(shí)驗(yàn)選用同批收集的PP2。②MDSCs的Desmin免疫組織化學(xué)鑒定：取PP2的MDSCs，把細(xì)胞接種在6孔板中的蓋玻片上。以同期PP1細(xì)胞作為對照組。按照試劑盒說明書行細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色，予細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)：Desmin染色陽性率=陽性細(xì)胞/總細(xì)胞。③大鼠胰島的分離、純化：5周齡SD大鼠，麻醉，開腹，取胰腺、消化液。消化液過濾、離心，去上清液，冰浴備用。另取一個(gè)離心管，緩慢加入Ficoll，再加入胰島懸液。離心，于不同濃度層交界間吸取胰島，洗滌，重懸于培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中。④胰島細(xì)胞的DTZ染色，計(jì)數(shù)：將DTZ融于二甲基亞砜，再予稀釋，過濾。在胰島中加入DTZ工作液。按以下公式計(jì)數(shù)：胰島數(shù)=3次陽性細(xì)胞團(tuán)總數(shù)/3×20×樣本量（mL）。⑤大鼠肌源性干細(xì)胞的GFP轉(zhuǎn)染：取第二代MDSCs接種于transewell底層，用腺病毒介導(dǎo)的外源性GFP基因轉(zhuǎn)染MDSCs，熒光顯微鏡下觀察。⑥MDSCs與胰島共培養(yǎng)：加培養(yǎng)液于transewell底層中的MDSCs。將約400個(gè)胰島放進(jìn)transewell上層，加入同樣培養(yǎng)基，每3d換1次液。對照組為MDSCs單獨(dú)transwell培養(yǎng)。⑦第5、7天的誘導(dǎo)產(chǎn)物DTZ染色：方法同前。

結(jié)果

MDSCs的生物學(xué)特性：PP1接種2h后，倒置相差顯微鏡下發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞開始貼壁。差速后PP2貼壁后，倒置相差顯微鏡下其貼壁細(xì)胞呈短梭形、紡錘形或多角形，活性好，見圖1A。

MDSCs的Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果：PP2傳至第二代的細(xì)胞培養(yǎng)3d后，行免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見細(xì)胞質(zhì)Desmin染色強(qiáng)陽性，陽性細(xì)胞率（80.35±0.91）％，見圖1B。

胰島分離、純化、鑒定結(jié)果：胰島懸浮于培養(yǎng)基中，由大小不一的胰島細(xì)胞組成。每只大鼠胰腺消化、純化后可獲得（102±32）個(gè)胰島，純度（82±1.53）％，DTZ染色，呈猩紅色。

共培養(yǎng)后誘導(dǎo)產(chǎn)物第5、7天DTZ染色：共培養(yǎng)第5天的誘導(dǎo)產(chǎn)物DTZ染色，有猩紅色團(tuán)塊出現(xiàn)，但團(tuán)塊小且結(jié)構(gòu)松散（圖2A），共培養(yǎng)第7天，染成猩紅色的團(tuán)塊增大且結(jié)構(gòu)緊密（圖2B），單獨(dú)培養(yǎng)組染色未見猩紅色細(xì)胞團(tuán)。熒光顯微鏡觀察聚集成團(tuán)的團(tuán)塊中有部分或全部顯示綠色，說明猩紅色團(tuán)塊來自MDSCs分化。

討論

胰島細(xì)胞移植可以用來治療1型和部分2型糖尿病，但供體來源問題限制了它的廣泛應(yīng)用[2]。尋找新的細(xì)胞來源成為當(dāng)務(wù)之急，干細(xì)胞研究為此開辟了一條新途徑。目前認(rèn)為，在體外通過成體干細(xì)胞與目的細(xì)胞共培養(yǎng)能在一定程度上“再現(xiàn)”體內(nèi)微環(huán)境并成功地誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化[3]。Tomita等在未使用化學(xué)誘導(dǎo)劑情況下，將MSCs與新生鼠心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)一部分GFP標(biāo)記的MSCs出現(xiàn)自發(fā)性收縮[4]。在此理論基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)探討胰島與MDSCs共培養(yǎng)后誘導(dǎo)MDSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞的可能性。

本實(shí)驗(yàn)分離胰島細(xì)胞時(shí)采用了直接灌注法，具有胰島產(chǎn)出量高的特點(diǎn)[5]。并采用了Xu等人的Hank's液與聚蔗糖400配制成密度梯度介質(zhì)[6]，進(jìn)行胰島純化，純度可達(dá)83％左右。

GFP是一種在水母中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，在藍(lán)光或近紫外光的照射下，不需加入任何反應(yīng)底物或酶即可發(fā)射綠色熒光。GFP已成為一種監(jiān)測體內(nèi)基因表達(dá)，示蹤完整活細(xì)胞生命現(xiàn)象的重要報(bào)告基因[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)將GFP基因轉(zhuǎn)染肌源性干細(xì)胞，使其攜帶示蹤標(biāo)記，來證明共培養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞來自MDSCs。

圖1 MDSCs和MDSCs的Desm in免疫細(xì)胞化學(xué)染色

圖2 誘導(dǎo)產(chǎn)物DTZ染色

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠胰島與MDSCs共培養(yǎng)能成功的誘導(dǎo)MDSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞。為MDSCs治療糖尿病提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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The possibility ofmuscle-derived stem cells to differentiate into insulin-producing cellswas induced by co-culture of islet

Wang Xinyan
DpartmentofEndocrinology,The Second People's HospitalofPanzhihua City,Sichuan Province 617000

Objective：To investigate the possibility of the induction of muscle-derived stem cells（MDSCs）to differentiate into insulin-producing cells by isletandmuscle-derived stem cells in neonatal rats（MDSCs）which were co-cultured in vitro.Methods：The primary cells ofMDSCs in neonatal ratswere extracted and identified,exogenousgreen fluorescentprotein（GFP）were used to transfect MDSCs of the second generation.Rat pancreatic islets were extracted and then identified by dithizone,islets were co-cultured with MDSCs transfected by GFP.While only MDSCswere cultured as the controlgroup.Results：Cellmasswas found under amicroscope on the fifth days of the co-culture group,and typical pancreatic insulin-secreting cell clusterswas formed on the seventh day.Cell clusters identified by dithizone：a partof green cellswas dyed scarlet,which indict that scarletmass coming from MDSCs,but the same changeswere notdetected in the controlgroup.Conclusion：MDSCs in neonatal rats can be induced into differentiate insulin-producing cellsby co-cultureMDSCsand islets.

Muscle-derived stem cells；Co-culture；Pancreatic islets；Insulin-producing cells

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.10.1